一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法与流程

本发明属于细胞工程技术，尤其是涉及一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法。

背景技术：

自从1975年Kohler和Milstein建立杂交瘤技术以来，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已应用到许多方面，特别是在疾病诊断和治疗及亲和层析分离方面，单克隆抗体具有十分诱人的应用前景，其中CD3单抗于1987年被美国FDA批准用于临床，1990年已达到1千万美元的年产值。美国制药工业协会调查报告显示，单抗位列所有医药生物技术产品之首。

随着单克隆抗体的大量应用，杂交瘤细胞的大规模培养技术日趋成熟。英国Celltech公司的1万升气升式反应器已经开发成功，并应用于抗人ABO血型单抗的生产。国内华东理工大学开发的10升规模气升式细胞培养用生物反应器已成功地培养了WuT3杂交瘤细胞。武汉生物制品研究所用70升生物反应器培养WuT3细胞也取得了成功。

目前，杂交瘤细胞的培养已不再以反应器培养规模作为重要的指标，而把更多的精力集中于杂交瘤细胞的代谢调控、反应器的操作模式和控制策略及无血清无蛋白培养技术等方面，以提高杂交瘤细胞密度和单抗的生产率，生产杂蛋白含量低、容易分离纯化的体内用单克隆抗体。

相对于贴壁依赖性细胞，杂交瘤细胞培养的放大可以更多地借助于微生物发酵的经验。八十年代初，已利用生物反应器大规模培养杂交瘤细胞。为了使培养放大工作更加有效，细胞高密度培养的研究引起重视，而首先遇到的则是培养条件的优化，并逐渐过渡到代谢的调控等方面。杂交瘤细胞在生长过程中对pH及渗透压等环境参数十分敏感。鉴于其在融合阶段所采用的细胞的特性，大规模高密度的细胞培养面临的一系列的挑战。我们知道在细胞培养过程中，葡萄糖作为主要碳源及能源物质，被连续摄入并代谢，而代谢副产物乳酸对于培养环境的pH有巨大影响。大细胞大规模培养过程pH是很重要的过程参数，其主要调控手段包括关联补充CO2及NaHCO3进行酸碱调控。而流加培养中也采用降低培养环境中葡萄糖浓度的策略，以促进糖酵解过程向完全氧化的方向进行，以降低乳酸的堆积。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷而提供一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，本发明采用7L和100L生物反应器进行二级细胞放大培养，在搅拌通气的条件下大规模自动化培养杂交瘤细胞，具有明显的在线放大细胞优势和连续培养的优势，是大规模自动化细胞培养的最佳途径，工艺合理、蛋白产量和活性高。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是提供了一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，将杂交瘤细胞自动化接种于生物反应器中连续二级放大自动化培养，包括对杂交瘤细胞进行一级细胞培养和二级细胞放大。

一级生物反应器细胞培养，经摇瓶制备密度为1.2×10⁶cells/ml的杂交瘤细胞悬液200ml，接种于7L反应器内进行细胞培养。二级生物反应器培养放大，将7L反应器内的细胞悬液作为初始细胞，细胞浓度2～3×10⁶cells/ml，自动输送到100L生物反应器中，收获约80L；蛋白浓度达500mg/L-600mg/L之间。

本发明使用的细胞为杂交瘤细胞，包括哺乳类动物悬浮细胞，BHK悬浮细胞细胞，选择培养的生物反应器是广州齐志生物工程设备有限公司制造的搅拌通气式BC-7L，100L型动物细胞培养生物反应器。

与现有技术相比，本发明通过两个生物反应器连续放大培养杂交瘤细胞，在线实时监控，自动化分析培养物的代谢产物。表现在PID峰值图反应出细胞生长和细胞的代谢情况。培养前期，随着细胞密度的提高，PID值慢慢提高，培养中期PID值达到峰值，说明此时细胞耗氧量最高，培养后期随着细胞活率下降，耗氧也随着降低，但同时表达量也在大幅度提高。

通过新型生物反应器技术高密度细胞悬浮培养工艺，细胞表达蛋白量高，蛋白的活性强，能推动单克隆抗体药物的生产。本发明工艺采用搅拌式生物反应器流加培养工艺，采用温度、pH值、溶氧量、二氧化碳浓度、转速等控制参数，控制系统中的PID值可直接反映细胞耗氧情况，可判断细胞生长阶段，为培养操作提供很大帮助；可达到稳定的培养环境，稳定表达的目的。

生产成本低可以采用单元操作法培养，随着规模增大，降低生产成本。生物反应器培养放大过程可以工程化和自动控制，提高了重演性。

附图说明：

图1是第二生物反应器细胞密度曲线。

图2是第二生物反应器细胞表达蛋白浓度曲线。

图3是细胞在线代谢PID曲线。

具体实施方式

以下为本发明具体的实施方案，一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法的进一步阐述，但不能限制本发明的范围，具体实施步骤如下：

实施实例：一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，将杂交瘤细胞至于生物反应器中连续二级放大自动化培养，包括对杂交瘤细胞进行一级细胞放大和二级细胞放大。

生物反应器一级细胞培养：

1、设定生物反应器的参数：温度35-37℃，转速20-40rpm，溶氧量50％，pH值6.0-7.2，空气、氧气、二氧化碳流量：0.2-0.4L/min、0.4-0.6L/min、0.2-0.4L/min；自动加入600ml SFM培养基于7L生物反应器内。

2、自动加入密度为1.2×10⁶cells/ml的杂交瘤细胞悬液200ml,作为7L反应器生产的种子来源；

3、当反应器内温度、pH达到设定值后，接种S1中200ml细胞悬液，此时培养体积为800ml；

4、培养48小时后开始流加13％的培养体积/天，72小时开始流加50％的培养体积/天，96小时开始流加77％的培养体积/天，120小时开始流加77％的培养体积/天；

5、144小时7L反应器内的细胞密度达2～3×10⁶cells/ml，培养体积为4L，作为接种100L反应器生产的种子来源。

生物反应器二级细胞放大：

1、将16L SFM培养基加入100L生物反应器，并设定生物反应器的参数：温度35-37℃，转速40-60rpm，溶氧量50-60％，pH/7.0-7.2，空气、氧气、二氧化碳流量分别为0.3-0.4L/min,0.4-0.6L/min,2-4L/min。

2、当100L反应器内温度、pH达到设定值后，将7升反应器悬浮细胞自动接种传入100L生物反应器，培养体积为18L。

3、培养2天后开始流加13％的培养体积/天，pH设定为6.9，并开始使用7.5％NaHCO3自动补碱；第3天开始流加50％的培养体积/天和添加100g蛋白水解物；第4天开始流加77％的培养体积/天和添加50g蛋白水解物，氧气流量提高至5L/min，转速提高至100rpm；第5天开始流加77％的培养体积/天，第6天添加200g蛋白水解物、80g葡萄糖；第7天添加100g蛋白水解物、80g葡萄糖；从第9天开始到13天，每天添加80g葡萄糖；第14天停止培养，收获约80L。蛋白浓度达500mg/L-600mg/L之间。

所选择培养的生物反应器为广州齐志生物工程设备有限公司制造的BC生物反应器，7L，70L，700L，1000L，3000L，5000L等不同型号的搅拌式通气式生物反应器。

所述杂交瘤细胞包括哺乳类动物悬浮细胞、BHK悬浮细胞。

所述第一生物反应器杂交瘤培养的培养基为SFM培养转铁蛋白、胰岛素。

所述第二生物反应器杂交瘤培养的培养基和添加剂为SFM培养转铁蛋白、胰岛素，蛋白水解物。

结合附图可以得到，本发明通过两个生物反应器连续放大培养杂交瘤细胞，在线实时监控，自动化分析培养物的代谢产物。表现在PID峰值图反应出细胞生长和细胞的代谢情况。培养前期，随着细胞密度的提高，PID值慢慢提高，培养中期PID值达到峰值，说明此时细胞耗氧量最高，培养后期随着细胞活率下降，耗氧也随着降低，但同时表达量也在大幅度提高。，控制系统中的PID值可直接反映细胞耗氧情况，可判断细胞生长阶段，为培养操作提供很大帮助；可达到稳定的培养环境，稳定表达的目的。

通过新型生物反应器技术高密度发酵工艺生产细胞和蛋白，提高了蛋白的活性，能推动单克隆抗体药物的生产。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，对其进行简单的组合变化都列为本发明的保护之内。