针对XY性发育异常疾病的靶向检测的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及针对xy性发育异常疾病的靶向检测。
背景技术：
：性发育疾病(disordersofsexdevelopment,dsd)是性别决定和性别分化异常的一组异质性遗传病,是由于染色体畸变或单基因突变等导致的疾病，在人群中的发病率为1/4500。目前认为，性别由染色体性别、性腺性别、表型性别和社会心理性别等几个层面组成，当这个层面的性别不一致的时候，会导致性发育异常疾病。胚胎发育中的性别分化和性别决定，涉及复杂的基因和分子网络调控；而睾丸分泌的两种激素——睾酮和苗勒管抑制因子在性别分化过程中起重要作用。对于各种dsd患者分子病因的探究，极大地推动了人们对于性别分化这一生理过程的认识，也使该类疾病的诊治逐渐规范合理。由于发现46，xx的表型男性的患者存在y-to-x的染色体异位，促使人们逐渐发现了y染色体上的睾丸决定基因——sexdeterminingregiony(sry基因)；并认识其在性别决定中的关键调控作用。目前认为，y染色体上的sry基因，通过其下游基因sox9等启动了原始性腺向睾丸组织的分化，sry，sox9，wt-1等基因突变均可导致性反转。由胎儿睾丸的支持细胞分泌的副中肾管抑制因子(mif)，使副中肾管结构(发育为子宫、输卵管和阴道的上1/3)退化；而睾丸间质细胞分泌的雄激素(主要是睾酮)，则引起中肾管结构男性化，发育为输出血管、输精管、附睾和精囊；在靶细胞中，5α-还原酶2的作用下，睾酮转化为双氢睾酮，使前列腺和外生殖器男性化。然而，性别决定和分化过程中，还有许多未知的分子的参与，对于这类疾病的分子病因还有很多未知领域。在dsd疾病中，最棘手的是46，xydsd，涉及疾病的正确及时诊断、性别的选择以及外生殖器重建手术方案的时机和选择。46，xy的胎儿，如果胚胎期睾丸雄激素分泌不足(如促进睾酮生成的各种酶类缺陷)、雄激素的作用障碍(雄激素受体不敏感)或靶细胞中睾酮向双氢睾酮的转化障碍等，均可以导致46，xydsd。此类患者的临床表型可为接近正常男性的小阴茎、伴有不同程度尿道下裂和隐睾到近乎正常的女性外生殖器，其分子病因常见为雄激素受体基因(ar)、5α-还原酶2(srd5a2)基因、17-羟化酶基因等突变导致。通过对dsd患者基因的分析以及动物模型研究发现，sf-1,wt-1,gata-4等基因突变可以导致睾丸发育不全的表型，提示这些基因也参与了原始性腺向睾丸的分化。此外，近年的研究发现，女性卵巢的发育并不是一个“缺省”的过程，也有一些分子和物质作用(如foxl2等)以对抗向睾丸方向的分化。目前已知基因中可能导致dsd的基因有80-90个，仅有少部分疾病可通过临床表型特点和激素水平进行诊断。这类疾病作为疑难杂症，多数相同临床表型的患者可有截然不同的分子病因，内分泌激素测定的诊断价值有限；目前临床上的到基因诊断的不足20％；且该类诊疗往往需要不同科室之间的合作，患者往往辗转于不同医院、科室，长期得不到诊断，甚至误诊误治，遭受严重的身心创伤。以往对于这类疾病的分子诊断，往往是根据临床表型，采用候选基因sanger测序的方法，费时费力，而且有时不能得到明确结果。因而建立一种基于二代测序技术的靶向基因测序对于dsd疾病的诊断具有重要的价值和意义，有望大幅度改善患者的预后。因此，本领域迫切需要开发一种针对46，xy性发育异常疾病的靶向二代测序的基因芯片。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种针对46，xy性发育异常疾病的靶向二代测序的基因芯片。本发明的另一目的是为了提供一种针对46，xydsd患者的靶向基因二代测序的检测方法。本发明第一方面提供了一种性发育异常相关基因或其位点、和/或其检测试剂的用途，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于检测被检测对象对性发育异常的易感性，所述性发育异常相关基因选自下组：srd5a2、ar和nr5a1。在另一优选例中，所述被检测对象包括：人或非人哺乳动物(如家畜、实验动物等)。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：egf、esr1。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：amh、bmp4、cbx2、map3k1。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：gja4、myh6、ptch1。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：sox3、hsd17b3、por、wnt4、wt1、lhcgr、mamld1、rxfp2、lhx9、msx1、bmp7、dgkk、cst9、fgf10。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：cyp17a1、fgf8、gata4、rspo1、sry、arnt2、bmp2、bnc2、ephb2、esr2、fgfr2、fkbp4、gstm1、tesc。在另一优选例中，所述的相关基因包括5-80个基因，较佳地8-60个基因，更佳地20-40个基因。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因位点的检测试剂：srd5a2：chr2：31754395、srd5a2：chr2：31805954、srd5a2：chr2：31754392、srd5a2：chr2：31754418、srd5a2：chr2：31805786、srd5a2：chr2：31751294、srd5a2：chr2：31805775、srd5a2：chr2：31758693、srd5a2：chr2：31754418、srd5a2：chr2：31754497、nr5a1：chr9：127262605、nr5a1：chr9：127265467、nr5a1：chr9：127262390、nr5a1：chr9：127265589、nr5a1：chr9：127262797、nr5a1：chr9：127262973、nr5a1：chr9：127265498、nr5a1：chr9：127253389、nr5a1：chr9：127253398、nr5a1：chr9：127245134、ar：chrx：66942740、ar：chrx：66765516、ar：chrx：66766163、ar：chrx：66863249、ar：chrx：66943556、ar：chrx：66765872。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因位点的检测试剂：srd5a2：chr2：31805775、srd5a2：chr2：31758693、srd5a2：chr2：31754418、srd5a2：chr2：31754497、nr5a1：chr9：127265467、nr5a1：chr9：127262390、nr5a1：chr9：127265589、nr5a1：chr9：127262797、nr5a1：chr9：127262973、nr5a1：chr9：127265498、nr5a1：chr9：127253389、nr5a1：chr9：127253398、nr5a1：chr9：127245134、ar：chrx：66863249、ar：chrx：66943556、ar：chrx：66765872。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因位点的检测试剂：egf：chr9：110920947、egf：chr9：110884370、egf：chr9：110932389、egf：chr9：110902074、egf：chr9：110834507、esr1：chr6：152129480、esr1：chr6：152129484。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因位点的检测试剂：amh：chr19：2249647、amh：chr19：2249450、amh：chr19：2251466、bmp4：chr14：54417171、bmp4：chr14：54417226、cbx2：chr17：77758182、cbx2：chr17：77757651、cbx2：chr17：77755866、map3k1：chr5：56177692。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因位点的检测试剂：gja4：chr1：35260541、gja4：chr1：35260779、myh6：chr14：23876318、myh6：chr14：23865496、myh6：chr14：23857492、ptch1：chr9：98240468、ptch1：chr9：98241383、ptch1：chr9：98224163。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因位点的检测试剂：sox3：chrx：139587069、hsd17b3：chr9：99060720、hsd17b3：chr9：98997823、por：chr7：75615537、por：chr7：75608886、wnt4：chr1：22456135、wnt4：chr1：22446752、wt1：chr11：32456873、wt1：chr11：32417943、lhcgr：chr2：48982782、lhcgr：chr2：48915950、mamld1：chrx：149639324、mamld1：chrx：149639544、rxfp2：chr13：32366083、rxfp2：chr13：32355815、lhx9：chr1：197886988、lhx9：chr1：197890684、msx1：chr4：4864775、msx1：chr4：4862087、bmp7：chr20：55840949、bmp7：chr20：55840785、dgkk：chrx：50127741、dgkk：chrx：50213362、cst9：chr20：23584368、fgf10：chr5：44388594、fgf10：chr5：44305114。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因位点的检测试剂：cyp17a1：chr10：104592955、fgf8：chr10：103531266、gata4：chr8：11614521、rspo1：chr1：38095564、sry：chry：2655418、arnt2：chr15：80762743、bmp2：chr20：6751089、bnc2：chr9：16437095、ephb2：chr1：23208869、esr2：chr14：64701857、fgfr2：chr10：123353315、fkbp4：chr12：2910316、gstm1：chr1：110233137、tesc：chr12：117494679。在另一优选例中，所述的性发育异常相关基因位点包括10-500位点，较佳地20-200个位点，更佳地50-150个位点。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自表1所示的一个或多个性发育异常相关基因突变位点的检测试剂：表1在另一优选例中，本发明的基因突变位点为双等位基因突变位点。在另一优选例中，所述双等位基因突变位点选自下组：srd5a2chr2：31754395c→tsrd5a2chr2：31754392g→aarchrx：66942740c→tarchrx：66765516c→aarchrx：66766163c→garchrx：66943556t→garchrx：66765872t→csox3chrx：139587069c→glhcgrchr2：48982782a→gmamld1chrx：149639544c→tdgkkchrx：50213362c→tsrychry：2655418c→agstm1chr1：110233137a→g。在另一优选例中，被检测对象包括：人或非人哺乳动物(如家畜、实验动物等)。在另一优选例中，被检测对象包括亚洲人群(优选中国人)。在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。在另一优选例中，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：(a)用于基因检测的特异性引物；(b)用于基因检测的特异性探针；(c)用于基因检测的芯片；(d)用于检测突变基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒用于实时荧光定量pcr检测。在另一优选例中，所述实时荧光定量pcr中，退火温度为60-67℃之间，pcr扩增产物长度为80-300bp。在另一优选例中，所述实时荧光定量pcr中，荧光探针退火温度为60-70℃之间。在另一优选例中，所述探针的双末端进行化学基团的修饰，5’端修饰有荧光激发基团，3端修饰有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述检测为辅助性检测。本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括性发育异常相关基因的检测试剂，所述性发育异常相关基因选自下组：srd5a2、ar和nr5a1。在另一优选例中，所述试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：egf、esr1。在另一优选例中，所述试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：amh、bmp4、cbx2、map3k1。在另一优选例中，所述试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：gja4、myh6、ptch1。在另一优选例中，所述试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：sox3、hsd17b3、por、wnt4、wt1、lhcgr、mamld1、rxfp2、lhx9、msx1、bmp7、dgkk、cst9、fgf10。在另一优选例中，所述试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个性发育异常相关基因的检测试剂：cyp17a1、fgf8、gata4、rspo1、sry、arnt2、bmp2、bnc2、ephb2、esr2、fgfr2、fkbp4、gstm1、tesc。在另一优选例中，所述的相关基因包括5-80个基因，较佳地8-60个基因，更佳地20-40个基因。在另一优选例中，所述试剂盒包括选自下组的一个或多个所述性发育异常相关基因位点的检测试剂：srd5a2：chr2：31805775、srd5a2：chr2：31758693、srd5a2：chr2：31754418、srd5a2：chr2：31754497、nr5a1：chr9：127265467、nr5a1：chr9：127262390、nr5a1：chr9：127265589、nr5a1：chr9：127262797、nr5a1：chr9：127262973、nr5a1：chr9：127265498、nr5a1：chr9：127253389、nr5a1：chr9：127253398、nr5a1：chr9：127245134、ar：chrx：66863249、ar：chrx：66943556、ar：chrx：66765872。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂：egf：chr9：110920947、egf：chr9：110884370、egf：chr9：110932389、egf：chr9：110902074、egf：chr9：110834507、esr1：chr6：152129480、esr1：chr6：152129484。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂：amh：chr19：2249647、amh：chr19：2249450、amh：chr19：2251466、bmp4：chr14：54417171、bmp4：chr14：54417226、cbx2：chr17：77758182、cbx2：chr17：77757651、cbx2：chr17：77755866、map3k1：chr5：56177692。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括还包括选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂：gja4：chr1：35260541、gja4：chr1：35260779、myh6：chr14：23876318、myh6：chr14：23865496、myh6：chr14：23857492、ptch1：chr9：98240468、ptch1：chr9：98241383、ptch1：chr9：98224163。在另一优选例中，还包括选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂：sox3：chrx：139587069、hsd17b3：chr9：99060720、hsd17b3：chr9：98997823、por：chr7：75615537、por：chr7：75608886、wnt4：chr1：22456135、wnt4：chr1：22446752、wt1：chr11：32456873、wt1：chr11：32417943、lhcgr：chr2：48982782、lhcgr：chr2：48915950、mamld1：chrx：149639324、mamld1：chrx：149639544、rxfp2：chr13：32366083、rxfp2：chr13：32355815、lhx9：chr1：197886988、lhx9：chr1：197890684、msx1：chr4：4864775、msx1：chr4：4862087、bmp7：chr20：55840949、bmp7：chr20：55840785、dgkk：chrx：50127741、dgkk：chrx：50213362、cst9：chr20：23584368、fgf10：chr5：44388594、fgf10：chr5：44305114。在另一优选例中，还包括选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂：cyp17a1：chr10：104592955、fgf8：chr10：103531266、gata4：chr8：11614521、rspo1：chr1：38095564、sry：chry：2655418、arnt2：chr15：80762743、bmp2：chr20：6751089、bnc2：chr9：16437095、ephb2：chr1：23208869、esr2：chr14：64701857、fgfr2：chr10：123353315、fkbp4：chr12：2910316、gstm1：chr1：110233137、tesc：chr12：117494679。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自表1所示的一个或多个性发育异常相关基因突变位点的检测试剂。在另一优选例中，所述的检测试剂为：(a)用于基因检测的特异性引物；(b)用于基因检测的特异性探针；(c)用于基因检测的芯片；(d)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体。本发明第三方面提供了一种体外检测样品是否存在基因突变的方法，包括步骤：(a)用特异性引物扩增样品的多核苷酸，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中性发育异常相关基因srd5a2、ar和nr5a是否存在突变。在另一优选例中，检测扩增产物中是否存在以下一个或多个性发育异常相关基因位点：srd5a2：chr2：31805775、srd5a2：chr2：31758693、srd5a2：chr2：31754418、srd5a2：chr2：31754497、nr5a1：chr9：127265467、nr5a1：chr9：127262390、nr5a1：chr9：127265589、nr5a1：chr9：127262797、nr5a1：chr9：127262973、nr5a1：chr9：127265498、nr5a1：chr9：127253389、nr5a1：chr9：127253398、nr5a1：chr9：127245134、ar：chrx：66863249、ar：chrx：66943556、ar：chrx：66765872。在另一优选例中，所述方法还包括(c)，检测扩增产物中是否还存在以下一个或多个性发育异常相关基因突变位点：srd5a2：chr2：31754395c→tsrd5a2：chr2：31805954g→aar：chrx：66942740c→t；archrx：66765516c→a。在另一优选例中，所述方法还包括(d)，检测扩增产物中是否还存在以下一个或多个性发育异常相关基因突变位点：egfchr4：110920947g→aesr1chr6：152129480g→aesr1chr6：152129484c→a。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(e)，检测扩增产物中是否还存在以下一个或多个性发育异常相关基因突变位点：amhchr19：2249647g→abmp4chr14：54417171c→tmap3k1chr5：56177692g→c。在另一优选例中，所述方法包括步骤(f),检测扩增产物中是否还存在以下性发育异常相关基因突变位点：gja4chr1：35260541c→t。在另一优选例中，所述方法包括步骤(g),检测扩增产物中是否还存在以下一个或多个性发育异常相关基因突变位点：sox3chrx：139587069c→gcst9chr20：23584368g→a。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(h)，检测扩增产物中是否还存在表1所示的一个或多个性发育异常相关基因突变。在另一优选例中，所述检测为非诊断性和非治疗性的。在另一优选例中，所述样本来自于人。本发明第四方面提供了一种检测个体对性发育异常的易感性的方法，包括步骤：(i)检测该个体的srd5a2、ar和nr5a1基因；和(ii)与对应的正常基因位点相比较，存在差异就表明该个体对性发育异常的易感性高于正常人群。在另一优选例中，所述方法还包括检测选自下组的性发育异常相关基因：egf、esr1。在另一优选例中，所述方法还包括检测选自下组的性发育异常相关基因：amh、bmp4、cbx2、map3k1。在另一优选例中，所述方法还包括检测选自下组的性发育异常相关基因：gja4、myh6、ptch1。在另一优选例中，所述方法还包括检测选自下组的性发育异常相关基因：sox3、hsd17b3、por、wnt4、wt1、lhcgr、mamld1、rxfp2、lhx9、msx1、bmp7、dgkk、cst9、fgf10。在另一优选例中，所述方法还包括检测选自下组的性发育异常相关基因：cyp17a1、fgf8、gata4、rspo1、sry、arnt2、bmp2、bnc2、ephb2、esr2、fgfr2、fkbp4、gstm1、tesc。在另一优选例中，所述检测srd5a2、ar和nr5a1基因包括检测表1的一种或多种核苷酸变异。在另一优选例中，所述检测srd5a2、ar和nr5a1基因包括检测下表2的一种或多种的核苷酸变异：表2基因基因突变突变位点srd5a2chr2：31805775c→tsrd5a2chr2：31758693g→asrd5a2chr2：31754418ga→gsrd5a2chr2：31754497t→anr5a1chr9：127265467cttg→cnr5a1chr9：127262390g→tnr5a1chr9：127265589g→tnr5a1chr9：127262797tc→tnr5a1chr9：127262973ct→cnr5a1chr9：127265498g→tnr5a1chr9：127253389g→anr5a1chr9：127253398a→gnr5a1chr9：127245134g→tarchrx：66863249g→carchrx：66943556t→gar：chrx：66765872t→c。在另一优选例中，所述的差异选自表1或表2的一种或多种核苷酸变异。在另一优选例中，所述的个体是人。本发明第五方面提供了一种分离的基因多核苷酸序列，所述的核苷酸序列衍生自选自下组的基因的片段：srd5a2基因、ar基因和nr5a1基因，且所述的核苷酸序列分别具有一个或多个选自表2所示的基因突变位点。在另一优选例中，所述核苷酸序列还衍生自选自下组的基因的片段：egf、esr1、或其组合，且所述的核苷酸序列分别具有一个或多个选自表1所示的基因突变位点。在另一优选例中，所述核苷酸序列还衍生自选自下组的基因的片段：amh、bmp4、cbx2、map3k1、或其组合，且所述的核苷酸序列分别具有一个或多个选自表1所示的基因突变位点。在另一优选例中，所述核苷酸序列还衍生自选自下组的基因的片段：gja4、myh6、ptch1、或其组合，且所述的核苷酸序列分别具有一个或多个选自表1所示的基因突变位点。在另一优选例中，所述核苷酸序列还衍生自选自下组的基因的片段：sox3、hsd17b3、por、wnt4、wt1、lhcgr、mamld1、rxfp2、lhx9、msx1、bmp7、dgkk、cst9、fgf10、或其组合，且所述的核苷酸序列分别具有一个或多个选自表1所示的基因突变位点。在另一优选例中，所述核苷酸序列还衍生自选自下组的基因的片段：cyp17a1、fgf8、gata4、rspo1、sry、arnt2、bmp2、bnc2、ephb2、esr2、fgfr2、fkbp4、gstm1、tesc、或其组合，且所述的核苷酸序列分别具有一个或多个选自表1所示的基因突变位点。在另一优选例中，所述多核苷酸序列长度为30-1000bp；优选为50-500bp，更佳地，200-250bp。本发明还提供了本发明第五方面中所述多核苷酸序列的用途，所述的序列可用作阳性对照(标准品)。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1为对70个46，xydsd患者进行靶向基因二代测序后的结果。标红色的基因为dsd候选基因，标蓝色基因为dsd潜在致病基因。潜在致病基因是指在动物研究中发现与性发育相关但未在dsd患者中发现的基因。具体实施方式经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次开发了针对性发育异常疾病相关的一组高相关性的靶基因及其相关突变位点。本发明的实验结果表明，基于本发明所提供的性发育异常疾病的靶基因及其相关突变位点，可以开发相应的诊断试剂和试剂盒，从而用于早期诊断或辅助诊断对象是否易患性发育疾病。在此基础上完成了本发明。术语除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。靶基因组合本发明所提供的靶基因组合中，核心靶基因包括srd5a2、ar和nr5a1。在此基础上，还可包括一个或多个额外的靶基因。在一个优选例中，本发明人通过初步对70个46，xydsd患者的二代测序、数据分析以及sanger测序验证，发现突变的验证率为113/127＝89％。80个基因中有40个基因测到突变，包括ar基因8个纯合突变，sox3基因2个纯合突变，esr1基因1个复合杂合突变，wt1基因2个杂合突变，sry基因一个纯合突变，bmp4基因3个杂合突变，lhcgr基因1个纯合突变，mamld1基因1个纯合突变，nr5a1基因10个杂合突变，srd5a2基因3个纯合突变以及4个复合杂合突变。分析结果提示，在人(尤其是亚洲人群)中，46，xydsd患者最核心的致病基因是：srd5a2、ar和nr5a1。srd5a2基因srd5a2基因为5α-还原酶ⅱ型基因，主要在外生殖器组织和前列腺上表达，促进睾酮向双氢睾酮的转换。在本发明的一个优选地实施方式中，用于检测srd5a2基因中所对应的氨基酸序列的arg227gln，gln6*，ala228val，f219fs、ala62glu、arg246gln、gly66arg、thr142ile和n193i位突变位点的引物对如下：c.680c→t,p.arg227gln杂合突变srd5a2chr2：31754395c→tf:aaagctacgtgaatgctgcc(seqidno.:1)r:tgaccttccgattcttctgc(seqidno.:2)c.16g→a,p.gln6*杂合突变srd5a2chr2：31805954g→af:aaggcagctcctgcaggaac(seqidno.:3)r:tctcttctgggagggcagcg(seqidno.:4)c.683g→a,p.ala228val纯合突变srd5a2chr2：31754392g→af:aaagctacgtgaatgctgcc(seqidno.:5)r:tgaccttccgattcttctgc(seqidno.:6)c.656delt,p.f219fs杂合突变srd5a2chr2：31754418ga→gf:aaagctacgtgaatgctgcc(seqidno.:7)r:tgaccttccgattcttctgc(seqidno.:8)c.185g→t,p.ala62glu杂合突变srd5a2chr2：31805786g→tf:ccgcaagggaaaaacgctac(seqidno.:9)r:ttgtacgtcgcgaagcctc(seqidno.:10)c.737c→t,p.arg246gln杂合突变srd5a2chr2：31751294c→tf:ttcatcagcattgtgggagc(seqidno.:11)r:gaccatcgaaatagtcaggc(seqidno.:12)c.196c→t,p.gly66arg杂合突变srd5a2chr2：31805775c→tf:ccgcaagggaaaaacgctac(seqidno.:13)r:ttgtacgtcgcgaagcctc(seqidno.:14)c.425g→a,p.thr142ile杂合突变srd5a2chr2：31758693g→af:tgggaagtaggtgagaagtg(seqidno.:15)r:taacctttcctccctgtgtg(seqidno.:16)c.t578a,p.asn193ile杂合突变srd5a2chr2：31754497t→af:aaagctacgtgaatgctgcc(seqidno.:17)r:tgaccttccgattcttctgc(seqidno.:18)ar基因ar，又称雄激素受体基因，其编码产物属于核受体家族，主要在阴茎和尿道表达，与睾酮和双氢睾酮复合物结合影响下游性分化过程中关键基因表达。在本发明的一个优选地实施方式中，用于检测ar基因对应的氨基酸序列的arg841cys、s176r、pro392arg、gly590arg、phe879cys和leu295pro位突变位点的引物对如下：c.2521c→t,p.arg841cys纯合突变archrx：66942740c→tf：tgtctaatgctccttcgtgg(seqidno.:19)r：accctccatcgtttgcttac(seqidno.:20)c.c528a,p.s176r纯合突变archrx：66765516c→af：cgctcaggatgtctttaagg(seqidno.:21)r：aggaacagcaaccttcacag(seqidno.:22)c.1175c→g,p.pro392arg纯合突变archrx：66766163c→gf：aagtccggagcactggacga(seqidno.:23)r：tgagggtgacccagaaccg(seqidno.:24)c.1768g→c,p.gly590arg杂合突变archrx：66863249g→cf：gcatgtgcaagaccctttac(seqidno.:25)r：ctgccattcagtgacatgtg(seqidno.:26)c.2636t→g,p.phe879cys纯合突变archrx：66943556t→gf：gtcaaccctgtttttctccc(seqidno.:27)r：gggaaatagggtttccaatg(seqidno.:28)c.884t→c,p.leu295pro纯合突变archrx：66765872t→cf：cagcagtatcttcagtgctc(seqidno.:29)r：tttctgacaacgccaaggag(seqidno.:30)nr5a1基因nr5a1，又称类固醇生成因子1，是核受体超家族成员之一，调控下游多个已知与性腺发育、肾上腺发育、类固醇生成及生殖有关基因的转录。在本发明的一个优选地实施方式中，用于检测nr5a1基因对应的氨基酸序列的gly212ser、p.n44del、cys283*、e148fsx295、r89fsx105、g35v、c370y、、e367g、s430i和thr29lys位突变位点的引物对如下：c.634c→t,p.gly212ser杂合突变nr5a1chr9：127262605c→tf：tcctgcaggcagcccaagat(seqidno.:31)r：actggctggctacctctac(seqidno.:32)c.135delttg,p.n44del杂合突变nr5a1chr9：127265467cttg→cf：cctaccccctcaggctgtg(seqidno.:33)r：cctcgctgactctcagctc(seqidno.:34)c.849c→a,p.cys283*杂合突变nr5a1chr9：127262390g→tf：gaggagagactcacctcca(seqidno.:35)r：aacgtgcctgagctcatcct(seqidno.:36)c.86g→t,p.thr29lys杂合突变nr5a1chr9：127265589g→tf：agtgcttgttgttctgcacc(seqidno.:37)r：acgccgcgggcatggactat(seqidno.:38)(此位点与最后一个突变点重复)c.443delc,p.e148fsx295杂合突变nr5a1chr9：127262797tc→tf：tactcagacttgatggcacg(seqidno.:39)r：cttcaagctggagacaggg(seqidno.:40)c.265delt,p.r89fsx105杂合突变nr5a1chr9：127262973ct→cf：tgggaggcagcacgtagtc(seqidno.:41)r：gcttagagagggtgagtctg(seqidno.:42)c.g104t,p.g35v杂合突变nr5a1chr9：127265498g→tf：agtgcttgttgttctgcacc(seqidno.:43)r：acgccgcgggcatggactat(seqidno.:44)c.g1109a,p.c370y杂合突变nr5a1chr9：127253389g→af：gacccacgtcctctgactgt(seqidno.:45)r：ctggctgtctccacctctct(seqidno.:46)c.a1100g,p.e367g杂合突变nr5a1chr9：127253398a→gf：gacccacgtcctctgactgt(seqidno.:47)r：ctggctgtctccacctctct(seqidno.:48)c.g1289t,p.s430i杂合突变nr5a1chr9：127245134g→tf：attccagcagctgctgctgt(seqidno.:49)r：aatgaaccatgcggagccag(seqidno.:50)c.86g→t,p.thr29lys杂合突变nr5a1chr9：127265589g→tf：agtgcttgttgttctgcacc(seqidno.:51)r：acgccgcgggcatggactat(seqidno.:52)靶位点的组合本发明所提供的靶位点组合中，核心靶位点包：srd5a2：chr2：31805775、srd5a2：chr2：31758693、srd5a2：chr2：31754418、srd5a2：chr2：31754497、nr5a1：chr9：127265467、nr5a1：chr9：127262390、nr5a1：chr9：127265589、nr5a1：chr9：127262797、nr5a1：chr9：127262973、nr5a1：chr9：127265498、nr5a1：chr9：127253389、nr5a1：chr9：127253398、nr5a1：chr9：127245134、ar：chrx：66863249、ar：chrx：66943556、ar：chrx：66765872。在此基础上，还可包括一个或多个额外的靶位点。针对46，xydsd患者的靶向基因的检测方法本发明提供了一种针对46，xydsd患者的靶向基因的检测方法。优选地，该方法是基于二代测序的，它包括以下步骤：步骤(1)：明确目前已知可能导致46，xydsd的病因；步骤(2)：通过ucsc和ncbi数据库导出基因序列以及编码信息；步骤(3)：使用massarrayassaydesign软件对这些基因进行aa芯片引物设计；步骤(4)：aa芯片实验大致步骤(可分为5步)；①上样：用排枪将96孔板里引物和模板吸到48.48accessarrayifc芯片上。②装载：将芯片放进pre-pcrifccontrollerax仪器里，引物和模板自动混合。③热循环：利用fc1cycler仪器进行pcr扩增反应。④收获：利用post-pcrifccontrollerax仪器进行pcr产物汇集和收获。⑤恢复：用排枪将芯片模板上样处pcr产物吸出。步骤(5)：illumina测序仪进行测序分析；步骤(6)：利用bwa,samtools和gatk软件对测序结果进行分析。步骤(7)：所有测得的snv以及indel经过公共数据库(exac,1000genomes,dbsnpandclinvar)过滤和annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/)功能注释。步骤(8)：符合①双复孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②单孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③双复孔snv,单孔测的不好，复孔测的好的(alldepth>1000)标准的snv经sanger测序进行证实。步骤(9)：符合①双复孔indel；②单孔indel,alldepth>25,vaf>＝0.4标准的indel经sanger测序进行证实。较佳地，所述的与46，xydsd发病有关的80个基因，857对引物分配于两个panel。较佳地，第一块panel的40个基因为：srd5a2,nr5a1,ar,egf,esr1,amh,bmp4,cbx2,map3k1,gja4,myh6,ptch1,sox3,hsd17b3,por,wnt4,wt1,lhcgr,mamld1,rxfp2,lhx9,msx1,bmp7,dgkk,cst9,fgf10,sry,cyp17a1,rspo1,fgf8,gata4,gstm1,tesc,bmp2,fgfr2,arnt2,bnc2,ephb2,esr2,fkbp4较佳地，第二块panel的40个基因为：sox9、nr0b1、bmp15、dhh、arx、star、amhr2、cyp11a1、hsd3b2、cyb5a、hoxa13、lhb、hsd11b1、fdx1、fdxr、map3k11、emx2、lhx1、ctnnb1、foxl2、fst、shox、dmrt1、sox8、tspyl1、smad5、kiaa1310、mid1、atf3、shh、wnt5a、hoxd13、bmpr1a、mafb、pip、cyr61、ctgf、gadd45a、hoxa4、hoxb6。较佳地，筛选snv的标准为①双复孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②单孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③双复孔snv,单孔测的不好，复孔测的好的(alldepth>1000)。较佳地，筛选indel的标准为①双复孔indel；②单孔indel,alldepth>25,vaf>＝0.4。本发明适用于46，xy性发育异常患者分子病因的明确，弥补了该领域的不足与缺失，其原理为本发明通过病例积累观察以及文献检索，找到目前已知可能导致46，xydsd的80个基因，包括目前已知的候选基因和某些在动物模型中显示与性腺发育有关，但在人体中尚未报道突变的基因。通过accessarraytmsystem建立2个panel进行靶向基因的二代测序。根据2015年美国医学遗传学和基因组学以及分子病理学协会(americancollegeofmedicalgeneticsandgenomics；acmg))的标准，检测出的核苷酸变异分为5种：(1)致病性的,(2)可能治病的,(3)不明临床意义的变异(variantsofuncertainclinicalsignificance，vus),(4)可能为良性的(5)良性的。对于以往文献中已经报道的突变类型，具有相近表现的，考虑为致病性的。对于新的突变类型，用三个软件进行预测，包括sift,polyphen2,和mutationtaster，有两个以上预测为致病性且与临床表型相关，归为可能致病性变异；预测为良性变异(非丧失功能)或功能丧失但与该表型无关的，为不明临床意义的变异(具体见表2)。将致病性变异和可能致病性变异进行总和后，发现该方法对46，xydsd的诊断率为42.86％(30/70)，高于同类研究。更有意义的是，该方法首次在多例患者中出现多个致病基因出现突变的情况，通过与144个正常人的全外显子测序数据进行fisher检验发现，该种遗传模式在dsd病人中不是随机发生的(p＝0.024)，说明性分化的分子调控网络存在很大的复杂性，与患者的表型异质性有关，进一步证实对于此类疑难杂症进行精准医学诊断的必要性。本发明适用于临床拟诊为46,xydsd的患者，可以进行高通量检测，并进行临床推广，有助于全面选择患者的治疗方案，充分弥补该领域的不足与缺失，十分具有实用价值。本发明的优点主要包括：(1)本发明首次筛到一组性发育异常相关基因、其相关位点及其相关突变位点，并且本发明将这些性发育异常相关基因、其相关位点及其相关突变位点组合使用(如srd5a2、ar和nr5a1组合使用)，可显著提高性发育疾病诊断的准确度，高达90％(计算方式：按照本发明真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)×100％)。(2)本发明的方法对46，xydsd的诊断率为42.86％(30/70)；其中，计算方法：根据acgm标准，(带有致病性的核苷酸变异的患者+带有可能致病的核苷酸变异)/总患者。(3)本发明的方法首次在多例患者中出现多个致病基因出现突变的情况，通过与144个正常人的全外显子测序数据进行fisher检验发现，该种遗传模式在dsd病人中不是随机发生的(p＝0.024)，说明性分化的分子调控网络存在很大的复杂性，与患者的表型异质性有关，进一步证实对于此类疑难杂症进行精准医学诊断的必要性。本发明适用于临床拟诊为46,xydsd的患者，可以进行高通量检测，并进行临床推广，有助于全面选择患者的治疗方案，充分弥补该领域的不足与缺失，十分具有实用价值。(4)dsd疾病临床表型差异大，错综复杂。对于临床表型不典型的46，xydsd，在没有临床拟诊的情况下，便可用本发明进行分子诊断。及时有效的分子诊断，有助于制定针对这种疑难杂症的长期治疗方案，提供性别选择信息，并对患者家系进行遗传咨询，从而全面提高患者的预后。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。实施例146，xydsd的相关基因位点的筛选和鉴定具体实施步骤：步骤(1)：选取目前已知可能导致46，xydsd的致病基因80个，根据ucscgenomebrowser中grch37/hg19中的基因序列，明确基因在染色体位置、编码、基因大小以及假基因情况等。表3.80个46，xydsd的已知可能致病基因步骤(2)：根据accessarraytmsystem扩增的要求(目标序列大小240bp,存在重叠)，设计引物，并加入标签序列。以srd5a2基因为例。例如，检测srd5a2chr2：31805954的引物如下：f:aaggcagctcctgcaggaac(seqidno.:3)r:tctcttctgggagggcagcg(seqidno.:4)；检测srd5a2chr2：31754392的引物如下：f:aaagctacgtgaatgctgcc(seqidno.:5)r:tgaccttccgattcttctgc(seqidno.:6)检测srd5a2chr2：31754418的引物如下：f:aaagctacgtgaatgctgcc(seqidno.:7)r:tgaccttccgattcttctgc(seqidno.:8)检测srd5a2chr2：31805786的引物如下：f:ccgcaagggaaaaacgctac(seqidno.:9)r:ttgtacgtcgcgaagcctc(seqidno.:10)检测srd5a2chr2：31751294的引物如下：f:ttcatcagcattgtgggagc(seqidno.:11)r:gaccatcgaaatagtcaggc(seqidno.:12)检测srd5a2chr2：31805775的引物如下：f:ccgcaagggaaaaacgctac(seqidno.:13)r:ttgtacgtcgcgaagcctc(seqidno.:14)检测srd5a2chr2：31758693的引物如下：f:tgggaagtaggtgagaagtg(seqidno.:15)r:taacctttcctccctgtgtg(seqidno.:16)检测srd5a2chr2：31754497的引物如下：f:aaagctacgtgaatgctgcc(seqidno.:17)r:tgaccttccgattcttctgc(seqidno.:18)步骤(3)：引物合成后，进行稀释，按accessarraytmsystem扩增要求，配制引物混合物，分于96孔板。步骤(4)：扩增模板的制备,定量到50ng/ul(不足50ng/ul以50ng/ul记)，配制模板混合物，分于96孔板。步骤(5)：用排枪将96孔板里引物和模板吸到48.48accessarrayifc芯片上。步骤(6)：将芯片放进pre-pcrifccontrollerax仪器里，引物和模板自动混合，并利用fc1cycler仪器进行pcr扩增反应。步骤(7)：利用post-pcrifccontrollerax仪器进行pcr产物汇集和收获(注意收获时需要更换房间操作，以防污染)步骤(8)：准备barcode混合物加入1：100稀释产物，进行pcr反应。步骤(9)：磁珠纯化产物，跑胶确认barcode加上后，准备上机测序。步骤(10)：hiseq2500上机测序，利用bwa,samtools和gatk软件对下机数据进行分析。步骤(11)：所测得的snv以及indel经过公共数据库(exac,1000genomes,dbsnpandclinvar)过滤和annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/)功能注释。步骤(12)：符合①双复孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②单孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③双复孔snv,单孔测的不好，复孔测的好的(alldepth>1000)标准的snv经sanger测序进行证实。步骤(13)：符合①双复孔indel,除去snp；②单孔indel,alldepth>25,vaf>＝0.4,除去snp标准的indel经sanger测序进行证实。本发明适用于46，xy性发育异常疾病已知基因突变的检测，弥补了该领域的不足与缺失，其原理为本发明在目前已知可能导致46，xydsd的80个基因中，通过massarrayassaydesign软件设计引物，在48.48accessarrayifc上，进行靶向基因外显子多重pcr扩增后，进行二代测序分析，使针对该疾病的高通量更大覆盖面的基因诊断成为可能。通过前期70例患者的研究，发现80个基因中有40个基因测到突变(表4)，46，xydsd患者最常见的致病基因是：srd5a2、ar和nr5a1等。进一步可将中国人中常见的基因汇聚在一个诊断panel中，可以更高效、快速地进行大量样本的基因检测。本发明十分适用于中国人46，xydsd患者，可弥补该领域的不足与缺失，具有实用价值。表4正常人群的突变频率如表5所示。表5实施例2试剂盒的制备和效果验证本实施例提供了一种检测46，xydsd的试剂盒。本试剂盒可对上表3中的突变位点进行基因突变检测：试剂盒主要试剂：(1)多态位点扩增引物上游引物(f)和下游引物(r)(massarrayassaydesign软件设计)；(2)多态位点测序引物测序引物(s)(根据本领域常规方法设计)；(3)pcr主要试剂：pfu高保真酶，10×pcrbuffer，dntpmixtur，ddh2o；(4)焦磷酸测序主要试剂：70％乙醇溶液，磁珠，变性缓冲液，退火缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，底物(asp,荧光素)，酶混合溶液(dna聚合酶、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶)，a/t/c/g碱基。使用本实施例提供的试剂盒，对300例患者进行检测，具体方法参考实施例1，共检出了229例患者携带本发明的基因突变，最后通过临床常规方法确认46，xydsd患者为218例，检出率高达95％以上，具体检测结果见表6。表6300例患者靶向基因二代测序的结果实施例3性发育异常相关疾病的相关基因位点的鉴定在本实施例中，对第二个群体样本进行检测，方法同实施例1。本实施例的样本数为110例性发育异常相关疾病患者和200例正常人。结果：在110例性发育异常相关疾病的患者中，有51例检测出在srd5a2、nr5a1和ar这三个基因中有基因突变(部分患者是srd5a2双等位基因突变)，即有51例患者性发育异常相关疾病的致病基因为这三个基因中的某一个基因。而在200例正常人中未检出上述三种基因的突变。具体地，就单基因而言，110位性发育异常相关疾病患者中有21例(19.09％，21/110)携带srd5a2突变，nr5a1的突变发生率为10.91％(12/110)，ar的突变发生率为16.36％(18/110)。此外，有21例(19.1％)在egf、esr1、bmp4和lhx9基因中也检出突变。实施例3性发育异常相关疾病的相关基因位点的鉴定在本实施例中，对第三个群体样本进行检测，方法同实施例1。本实施例的样本数为200例性发育异常相关疾病患者和200例正常人。结果：在表2中所示的新发现的snv，在该第三群体的性发育异常相关疾病患者中检出的有12种(约70％)，而在正常人中未检出，这提示，表2中所示的新发现的snv在性发育异常相关疾病患者中有一定的发生频率，并可作为辅助性检测或早期诊断性发育异常相关疾病的靶标。讨论46,xydsd患者临床表型存在显著异质性，对其进行及时准确的治疗非常困难，而诊断对于他们的性别决定、治疗策略和家庭的长期遗传咨询非常重要。鉴于大多数dsd患者为孟德尔遗传性疾病，传统的sanger测序法已成功运用于表型提示为完全性雄激素不敏感综合征(cais)和先天性肾上腺增生症(cah)的部分患者中。无论如何，由于此类患者复杂的分子病因和临床上相应分子标志的缺乏，sanger测序诊断率很低，特别是性腺发育不良患者。在此，我们采用靶向二代测序的方法，发现52例患者共检测到113个突变，主要分布在40个基因。诊断率可达42.86％(30/70)，比先前2项研究的诊断率更高，可能是由于其更佳的平均测序深度和靶向基因区域覆盖度。大部分患者表现为不同程度的小阴茎、尿道下裂和隐睾。排除典型的完全性雄激素不敏感综合症和17α羟化酶/17,20裂解酶缺陷症患者。同时，青春期后出现显著男性化导致社会性别转变的患者也一并排除。与先前研究结果相类似，在我们的研究中，突变频率最高的3个基因分别为srd5a2(15.04％,17/113)，nr5a1(8.84％,10/113)和ar(7.96％,9/113)，表明它们是导致46，xydsd最主要的原因。在所有检测到的突变中，有15个已报道突变来自srd5a2,nr5a1,ar,lhcgr,hsd17b3,bmp4,esr1和msx1基因，34个先前未报道的基因突变被预测为可能致病。此外，37个突变发生在19个潜在引起dsd的基因上，这些基因为首次报道发现与46,xydsd有关，主要包括egf、lhx9和cst9等。患者dsd0037和dsd0094分别携带nr5a1基因突变p.c283*和p.e367g，与此同时，他们都检测到cst9基因的无义突变p.r87*。之前研究已经表明，cst9在睾丸早期发育过程中起到重要作用，虽然并没有在性腺发育不良患者中发现该基因的突变。lhx9作为一种转录因子，在wt1的协助下，直接调节nr5a1基因的活性，对小鼠性腺的形成非常重要。然而，ottolenghi等人在对30个46，xy性腺发育不良患者进行lhx9基因筛查时并未发现突变，可能是由于样本量不足所致。在我们的研究中，发现患者dsd0044和dsd0101都携带lhx9基因杂合突变,分别为p.g201s和p.s12*。患者dsd0044主要表现为46，xydsd同时伴有睾丸退化，而患者dsd0101在出生时即发现小阴茎及尿道下裂。除外，dsd0044还携带srd5a2基因的2个杂合突变(p.r227q和p.a62e)，而dsd0101只携带srd5a2的1个杂合突变(p.n193i)。由此，我们猜测lhx9基因联合srd5a2基因缺陷可能导致非典型的5α还原酶2型缺陷症。在我们的患者中，nr5a1基因发生突变的频率位于第二位(10/70)。nr5a1基因是核受体超家族中的一员，调控下游多个基因的表达，这些基因与肾上腺和性腺发育、类固醇激素合成和生殖相关。不同的nr5a1基因杂合突变可引起不同的临床表现，从轻型的到严重的性腺发育不良，或者男性化不足伴或不伴有肾上腺功能不全到男性不育。此外，nr5a1突变与原发性卵巢功能早衰及46，xx患者睾丸或卵睾性dsd同样有关。我们研究发现9个新的nr5a1基因突变，主要分布在dna结合区和配体结合区。wang等人发现一种磷脂分子结合在lbd区，发生在该区域的突变可能会阻碍磷脂的结合，从而导致转录活性下降。铰链区203位丝氨酸的磷酸化可调节共激活子的募集，而119位和194位的赖氨酸的泛素化会导致转录活性的抑制。研究中发现的一个先前报道过的突变p.gly212ser，位于203位丝氨酸附近，可能会影响其磷酸化。2个移码突变p.e148fsx295、p.r89fsx105和无义突变p.cys283*可产生截短蛋白，破坏配体结合区或影响nr5a1磷酸化。在功能研究中，我们发现10种突变型对下游靶基因cyp17a1和cyp19a1的转录活性均下降，而核定位并未受影响。和野生型相比，突变p.t29k和p.n44del表现出异常的核聚集现象，其转录活性也相对较低。值得注意的是，我们的研究发现47.14％(33/70)的患者发现多个基因突变。在携带nr5a1基因突变的10位患者中，8位存在其它基因突变，频率高达80％(8/10)。dsd0011为几乎完全女性的表型，表现为完全性性腺发育不良、幼女型外阴及原发性闭经；超声检查未发现睾丸及卵巢结构。基因筛查结果显示，该患者携带有sry基因的一个新突变点(p.r76l)及nr5a1基因的一个已报道点(p.g212s)。sry基因的突变与46，xy性反转或性腺发育不良相关，而突变p.g212s先前报道与一个越南患者相关，其表型较轻，主要表现为生精障碍及不育。dsd0011更加严重的表型提示sry基因合并nr5a1基因突变可导致完全性性腺发育不良的发生，从而产生更加复杂的临床表现。此外，dsd0011还携带fgf10基因突变(p.m204v)。虽然先前研究已表明fgf10在早期生殖结节的发生中发挥作用，但是突变p.m204v是否参与其致病过程尚不明确。dsd0049患者表现为男性化不足(小阴茎、会阴型尿道下裂、隐睾及阴囊对裂)，激素结果显示fsh、lh升高和相对低的睾酮水平。测序分析发现，其携带ar基因1号外显子上的一个突变p.l295p，该突变先前报道与雄激素不敏感综合征(ais)相关。除此之外，dsd0049还携带nr5a1基因突变p.t29k，该突变可能导致其非典型的雄激素不敏感综合征表型，特别是低的睾酮水平。患者dsd0096同时携带nr5a1基因的错义突变p.s430i和wt1基因的突变p.t7p，表现为性腺发育不良及相对正常的睾酮水平。研究表明wt1基因在性腺早期发育为双向分化潜能过程中发挥作用且直接调节nr5a1基因的活性。因此，nr5a1基因和wt1基因同时发生突变可能导致临床表型重叠。患者dsd0092表现为外生殖器和性腺发育障碍，研究结果发现其携带nr5a1基因突变p.c370y和sox3基因突变p.v53l。sox3基因在小鼠胚胎期性腺组织中表达，对性腺的形成是非必须的，但与睾丸分化及精子形成有关。以上结果可以部分解释携带nr5a1基因患者临床表型的异质性，从严重的性腺发育不良、男性化不足到仅表现为男性不育。迄今为止，越来越多的nr5a1基因杂合突变、移码突变及错义突变已被报道，而大部分都不是从父母遗传而来。我们通过对3个患者父母的突变分析发现突变p.g35v和p.c370y不是遗传得来，而突变p.n44del是从患者的父亲遗传而来，其父亲表型正常。lin等人发现母亲同患者一样携带相同的nr5a1基因突变，却表现为正常的性分化且生育正常，可能是由于限性的显性遗传方式导致的。基于以上结果，我们推测，nr5a1基因突变合并其它致病性突变可能引起部分46,xydsd患者复杂的临床表型，即使不是所有的患者(比如dsd0032)。携带相同突变的患者表现为不同的临床表型，可能由于等位基因表达不平衡、不完全外显率或是靶向基因测序未检测到的不同致病突变所导致的。srd5a2基因突变p.r227q,p.q6*,p.r246q和p.a228v是复发性突变。与先前用sanger测序得出的结果相一致，我们的研究中有6位患者只发现srd5a2基因的单一杂合突变不能用常染色体隐性遗传方式进行致病解释。在这6个患者中，有5个还伴有其它基因突变。患者dsd0056和dsd0073都携带bmp4基因突变，与此同时，他们都带有单一的srd5a2基因杂合突变。dsd0073表现为严重的男性化不足，几乎女性外生殖器，阴囊对裂。此外，dsd0073还发生wnt4基因突变(p.p96l)。wnt4基因拮抗睾丸的发育，在女性外生殖器发育和阻碍睾丸形成方面发挥重要作用，而chen等人发现bmp4基因与尿道下裂有关。综合上述结果，我们发现在部分患者中，存在“二次打击”现象，表明dsd可能不像之前研究所示为单基因疾病。至少在某些患者里，它可呈现出一种双基因或寡基因病的遗传模式。此外，还有一些罕见dsd基因突变也被发现。患者dsd0042携带mamld1基因的纯合突变p.p542s，主要表现为小阴茎、会阴型尿道下裂和隐睾。mamld1基因发生的突变可引起x染色体连锁的尿道下裂和46,xydsd。cbx2基因突变p.r137c和p.g185e分别发生在患者dsd0010和dsd0017，该基因突变首次被biason-lauber等人报道发生在一个表型为女性的46，xy患者中。患者dsd0013表现为严重的隐睾、小阴茎，无尿道下裂，hcg试验反应不良，测序发现其携带lhcgr基因的纯合突变p.l10p。突变p.l10p位于黄体生成素受体信号肽区，可影响leydig细胞发育及受体合成47。另外，研究也发现bmp4和esr1基因的突变，它们以往被报道与尿道下裂相关。总的来说，靶向二代测序的方法可诊断42.86％的患者。本研究揭示了46,xydsd患者的遗传特征，并扩大了该疾病的候选基因表达谱。患者存在多个基因突变的现象表明dsd可能不是简单的单基因遗传疾病，在一些性腺发育不良的患者中存在一种潜在的双基因或寡基因遗传模式。未来，关于多基因突变的研究会不断涌现，对患者的性别决定或遗传咨询方面将会有重要的指导作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海交通大学医学院附属第九人民医院<120>针对xy性发育异常疾病的靶向检测<130>p2017-0366<160>52<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aaagctacgtgaatgctgcc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgaccttccgattcttctgc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aaggcagctcctgcaggaac20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tctcttctgggagggcagcg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaagctacgtgaatgctgcc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tgaccttccgattcttctgc20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aaagctacgtgaatgctgcc20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tgaccttccgattcttctgc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ccgcaagggaaaaacgctac20<210>10<211>19<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>10thrthrglythralacysglythrcysglycysglyalaalaglycys151015cysthrcys<210>11<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11thrthrcysalathrcysalaglycysalathrthrglythrglygly151015glyalaglycys20<210>12<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>12glyalacyscysalathrcysglyalaalaalathralaglythrcys151015alaglyglycys20<210>13<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cyscysglycysalaalaglyglyglyalaalaalaalaalacysgly151015cysthralacys20<210>14<211>19<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>14thrthrglythralacysglythrcysglycysglyalaalaglycys151015cysthrcys<210>15<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>15thrglyglyglyalaalaglythralaglyglythrglyalaglyala151015alaglythrgly20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16taacctttcctccctgtgtg20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17aaagctacgtgaatgctgcc20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tgaccttccgattcttctgc20<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19tgtctaatgctccttcgtgg20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20accctccatcgtttgcttac20<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21cgctcaggatgtctttaagg20<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22aggaacagcaaccttcacag20<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23aagtccggagcactggacga20<210>24<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24tgagggtgacccagaaccg19<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25gcatgtgcaagaccctttac20<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26ctgccattcagtgacatgtg20<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27gtcaaccctgtttttctccc20<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28gggaaatagggtttccaatg20<210>29<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29cagcagtatcttcagtgctc20<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30tttctgacaacgccaaggag20<210>31<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31tcctgcaggcagcccaagat20<210>32<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32actggctggctacctctac19<210>33<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33cctaccccctcaggctgtg19<210>34<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34cctcgctgactctcagctc19<210>35<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gaggagagactcacctcca19<210>36<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36aacgtgcctgagctcatcct20<210>37<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37agtgcttgttgttctgcacc20<210>38<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38acgccgcgggcatggactat20<210>39<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39tactcagacttgatggcacg20<210>40<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40cttcaagctggagacaggg19<210>41<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41tgggaggcagcacgtagtc19<210>42<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gcttagagagggtgagtctg20<210>43<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43agtgcttgttgttctgcacc20<210>44<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44acgccgcgggcatggactat20<210>45<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45gacccacgtcctctgactgt20<210>46<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46ctggctgtctccacctctct20<210>47<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47gacccacgtcctctgactgt20<210>48<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48ctggctgtctccacctctct20<210>49<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49attccagcagctgctgctgt20<210>50<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50aatgaaccatgcggagccag20<210>51<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51agtgcttgttgttctgcacc20<210>52<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52acgccgcgggcatggactat20当前第1页12