一类小蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及一类小蛋白，具体涉及一类基于gb1(链球菌g蛋白(streptococcalproteing)的igg结合域(immunoglobuling-bindingproteing)，简称为gb1)骨架的小蛋白，且此类小蛋白同时具有结合igg的能力，以及其作为pd-1/pd-l1抑制剂的应用，属于pd-1/pd-l1抑制剂技术领域。

背景技术：

在与癌症的对抗中，免疫系统的作用至关重要。肿瘤细胞由于遗传物质的改变，细胞表面表达肿瘤特异性抗原。免疫细胞可以通过对这些特异性抗原的识别，杀伤肿瘤细胞。然而肿瘤细胞会采取免疫逃逸机制使得他们在抗肿瘤免疫中存活下来。因此阻断肿瘤细胞的逃逸有利于对肿瘤细胞的杀伤。

pd-1(programmedcelldeath1，cd279)程序性细胞死亡蛋白，是i型膜蛋白，cd28家族的一员。在b淋巴细胞、t淋巴细胞、单核细胞表面均有表达。pd-1的配体pd-l1(cd279，b7-h1)，广泛分布于淋巴和非淋巴组织中，pd-l1基因的敲除导致t细胞响应的上调。阻断pd-1/pd-l1的抗体可提高抗肿瘤免疫活性。pd-1的另一个配体pd-l2(cd273，b7-dc)，分布不如pd-l1广泛，仅在活化的巨噬细胞和树突状细胞上有表达。正常生理状态下，活化的t细胞表面可表达pd-1，同时产生干扰素诱导正常组织中pd-l1的表达。pd-1/pd-l1通路可以防止t细胞的过度激活，保持免疫系统稳态。然而在肿瘤细胞(如淋巴瘤、黑素瘤、肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、卵巢癌等)上常呈现pd-l1过表达，pd-1/pd-l1的结合抑制t细胞的增殖，细胞因子的释放以及细胞毒性功能的行使，最终导致t细胞的耗竭，导致在肿瘤微环境中免疫反应被抑制，肿瘤生长不受控制。

pd-1/pd-l1作为重要的免疫检查点，其抑制剂旨在解除pd-1/pd-l1结合对t细胞的抑制作用，恢复t细胞介导的抗肿瘤免疫。

近年来，免疫检查点抑制剂的发展给了癌症治疗新的希望，免疫检查点抑制剂通过阻断抑制性信号来恢复t细胞的功能。2008年报道的murinepd-1/humanpd-l1以及murinepd-1/murinepd-l2的结构解析奠定了pd-1/pd-l1，-l2相互作用模型的基础；2015年发表的humanpd-1/humanpd-l1复合物的晶体结构解析(pdb:4zqk)，为研究pd-1/pd-l1相互作用的热点位置提供了重要依据。二者的结合面约疏水且较为平坦，没有深的结合口袋，这样的结合面不利于设计小分子抑制剂。

目前，业界研发人员对pd-1/pd-l1抑制剂的研究主要分为三种：

一、单克隆抗体药物(mabs)：已经上市的pd-1/pd-l1抑制剂有四个，nivolumab(opdivo，百时美施贵宝)pembrolizumab(keytruda，默沙东)、atezolizumab(tecentriq，罗氏)、durvalumab(imfinzi，阿斯利康)、临床试验中的avelumab(默克/辉瑞)，pdr001(诺华)等。抗体由于半衰期长，亲和力高，阻断效果好，是医药公司争相开发的药物并已成功上市。但抗体的生产成本高，且可能产生t细胞耗竭等副作用，因此也需要其他抑制剂的替代。

二、小分子抑制剂：2010年哈佛大学团队发表专利，磺胺类衍生物sulfamonomethoxine和sulfamethizole可恢复t细胞释放ifn-γ的功能；2015年bms公司的专利化合物，在htrf结合实验中，ic50达0.1μm以下；2016年吉林大学团队报道以间苯二酚为核心结构，氨基连接二甲基氨基甲酸酯的phenyldimethylcarbamates，htrf实验有效抑制pd-1/pd-l1结合且效果优于前面报道的sulfamonomethoxine和sulfamethizole，抑制率达40％以上。然而小分子虽然渗透性好，但特异性不高，副作用大。

三、蛋白多肽类抑制剂：2007年，日本京都大学研究团队即报道四聚体化的murinepd-l1与murinepd-1的亲和力明显提高；2015年，斯坦福大学和耶鲁大学的团队利用酵母筛选的方式得到pd-1胞外域的突变体hac-pd-1，具有良好的肿瘤组织渗透性，在小鼠肿瘤模型中比抗pd-l1抗体更有效。同在2015年，清华大学和浙江大学的研究者采用镜像噬菌体筛选技术得到了第一个可抗水解的d型pd-1/pd-l1拮抗剂^dppa-1，并在细胞及肿瘤动物模型上证明有效。此外，2016年，华东理工大学研究者利用电脑辅助从头设计多肽的方式得到一系列pd-1靶向多肽，证明可以恢复被hct116抑制的jurkatt细胞的功能。但是多肽类抑制剂的结构稳定性差，亲和力不够高，体内循环时间短也限制了其应用。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一类小蛋白及其应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一类小蛋白，所述小蛋白的骨架蛋白(简称为gb1)为链球菌g蛋白(streptococcalproteing)的igg结合域(immunoglobuling-bindingproteing)的突变体，并且所述小蛋白包括一个α螺旋和四个β折叠，所述α螺旋贯穿由四个β折叠围合形成的区域，同时在由所述四个β折叠形成的的β折叠面上还分布有能够与pd-1蛋白结合的关键氨基酸位点。

在一些实施例中，所述小蛋白的氨基酸序列如seqidno:12所示，并且所述氨基酸序列具有下列的至少一种氨基酸置换：在第5位的arg残基置换，第7位的met残基置换，第9位的ser残基置换，第14位的ala残基置换，第15位的asp残基置换，第16位的tyr残基置换，第17位的lys残基置换，第18位的arg残基置换，第45位的gln残基置换，第52位的glu残基置换，第54位的tyr残基置换，第56位的ile残基置换。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:1所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:2所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:3所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:4所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:5所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:6所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:7所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:8所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:9所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:10所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:11所示。

进一步地，分布于靠近所述α螺旋一侧的两个β折叠相互平行，而分布于所述α螺旋另一侧的两个β折叠反向平行。

进一步地，所述小蛋白具有弱igg结合能力。

进一步地，所述小蛋白与pd-l1蛋白有高度的结构相似性。

进一步地，所述小蛋白具有抑制pd-1/pd-l1蛋白结合的能力。

本发明实施例还提供了前述小蛋白在制备pd-1/pd-l1抑制剂中的用途。

进一步地，本发明实施例还提供了一种pd-1/pd-l1抑制剂，其包含前述的小蛋白。

与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：

1)本发明提供的小蛋白与pd-l1蛋白有高度的结构相似性，可抑制pd-1/pd-l1结合，是潜在的pd-1/pd-l1抑制剂，其具有弱igg结合能力，在体内循环滞留时间长，并且具有高度结构稳定性，可用于抑制pd-1/pd-l1之间的相互作用，制备简单，可用于规模化生产和应用，以便癌症的免疫治疗；

2)本发明提供的结构稳定的小蛋白与小分子化合物相比，更能模拟蛋白质与蛋白质间的相互作用(ppis)，靶向性和特异性好。与多肽相比，小蛋白有更稳定的结构，易于获得适宜的体内循环时间。与抗体相比，有更好的组织穿透性并且无fc介导的t细胞耗竭副作用。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案中小蛋白骨架gb1的结构示意图。

图2是本发明一典型实施方案中将pd-l1与pd-1蛋白结合面的关键氨基酸位点移植到小蛋白的β折叠面相应位置上的结构示意图。

图3是本发明一典型实施方案中一类小蛋白的结合模型原理图。

图4是本发明实施例1中纯化后突变体小蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图5是本发明实施例2中小蛋白骨架与pd-l1蛋白构象相似度比对示意图。

图6是本发明实施例3中突变体小蛋白gbm8抑制pd-1/pd-l1结合的表面等离子体共振检测结果示意图。

图7是本发明实施例3中突变体小蛋白gbm7、gbm9、gbm11抑制pd-1/pd-l1结合的表面等离子体共振检测结果示意图。

图8是本发明实施例4中圆二色谱法表征突变后小蛋白gbm1、gbm2、gbm3、gbm4的二级结构与骨架蛋白gb1的对比结果示意图。

图9是本发明实施例4中圆二色谱法表征突变后小蛋白gbm8的二级结构与骨架蛋白gb1的对比结果示意图。

图10是本发明实施例4中圆二色谱法表征突变后小蛋白gbm8的二级结构的温度稳定性结果示意图。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是通过分子克隆、蛋白质原核表达等技术，将pd-l1与pd-1结合面的关键氨基酸位点移植到小蛋白的β折叠面相应位置上，得到一类小蛋白，其自身具有良好的稳定性，具有弱igg结合能力，在体内循环滞留时间长，可用于抑制pd-1/pd-l1之间的相互作用，以便癌症的免疫治疗。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明实施例的一个方面提供的一类小蛋白，所述小蛋白的骨架蛋白(简称为gb1)为链球菌g蛋白(streptococcalproteing)的igg结合域(immunoglobuling-bindingproteing)的突变体，并且所述小蛋白包括一个α螺旋和四个β折叠，所述α螺旋贯穿由四个β折叠围合形成的区域，同时在由所述四个β折叠形成的的β折叠面上还分布有能够与pd-1蛋白结合的关键氨基酸位点。

在一些实施例中，所述小蛋白的氨基酸序列如seqidno:12所示，并且所述氨基酸序列具有下列的至少一种氨基酸置换：在第5位的arg残基置换，第7位的met残基置换，第9位的ser残基置换，第14位的ala残基置换，第15位的asp残基置换，第16位的tyr残基置换，第17位的lys残基置换，第18位的arg残基置换，第45位的gln残基置换，第52位的glu残基置换，第54位的tyr残基置换，第56位的ile残基置换。

进一步的讲，所述小蛋白上改造的pd-1/pd-l1结合的关键氨基酸位点从n端到c端依次为arg(精氨酸)、met(甲硫氨酸)、ser(丝氨酸)、ala(丙氨酸)、asp(天冬氨酸)、tyr(酪氨酸)、lys(赖氨酸)、arg(精氨酸)、gln(谷氨酰胺)、glu(谷氨酸)、tyr(酪氨酸)、ile(异亮氨酸)。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:1所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:2所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:3所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:4所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:5所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:6所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:7所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:8所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:9所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:10所示。

进一步地，所述小蛋白的氨基酸序列可如seqidno:11所示。

进一步地，分布于靠近所述α螺旋一侧的两个β折叠相互平行，而分布于所述α螺旋另一侧的两个β折叠反向平行。

进一步地，所述骨架蛋白包括天然存在的或人工合成的αβ小蛋白。

进一步地，所述小蛋白具有弱igg结合能力。

进一步地，所述小蛋白与pd-l1蛋白有高度的结构相似性。

进一步地，所述小蛋白具有抑制pd-1/pd-l1蛋白结合的能力。

本发明实施例还提供了前述小蛋白在制备用于抑制pd-1/pd-l1之间相互作用的抑制剂中的用途。

进一步地，本发明实施例还提供了一种pd-1/pd-l1抑制剂，其包含前述的小蛋白。

在本发明的一典型实施方案中，本发明通过分子克隆、蛋白质原核表达等技术，将pd-l1与pd-1结合面的关键氨基酸位点移植到小蛋白的β折叠面相应位置上，得到一类小蛋白(其典型结构可参阅图1-图3)，使其既保留较弱的igg结合能力，又具有抑制pd-1/pd-l1结合的能力，发挥癌症免疫治疗的作用。其中，小蛋白骨架gb1的结构示意图参见图1，图2-图3示出了将pd-l1与pd-1蛋白结合面的关键氨基酸位点移植到小蛋白的β折叠面相应位置上的结构示意图和结合模型原理图。

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1较优选的小蛋白序列与野生型gb1骨架序列对比

表1中列举了本实施例中涉及到的11个突变体小蛋白和骨架蛋白gb1。所述的各突变体小蛋白均可通过简单的原核表达得到，经分子克隆得到小蛋白的原核表达载体，再由原核表达，亲和纯化可得到纯净的突变体小蛋白。其中，小蛋白原核表达过程为：各突变体小蛋白的原核表达质粒可由分子克隆获得。质粒测序正确后经化学转化入bl21(de3)感受态大肠杆菌细胞，细胞在含与质粒抗性基因一致的抗生素lb培养基中(如pet28a用含卡那霉素的lb培养基)中培养过夜，得到过夜菌。表达蛋白时，在含抗生素的培养基中加入1/100的过夜菌(1ml过夜菌加入100mllb培养基中)，37℃摇床培养至oc600＝0.5时，加入iptg(终浓度1mm)，37℃摇床继续培养4小时。收集菌液，超声破碎细胞，亲和纯化后得到纯净的突变体小蛋白。如图4所示为纯化后突变体小蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

表1实施例1中涉及到的11个突变体小蛋白和骨架蛋白gb1的氨基酸序列

实施例2小蛋白骨架与pd-l1蛋白构象相似度比对

利用pymol软件wiazrd菜单的pairfitting功能，选取pd-l1与pd-1结合面的12个关键氨基酸的cα与小蛋白骨架β折叠面相对应位置cα进行比对，根据软件计算出的均方根偏差(root-mean-squaredeviation,rmsd,单位为)评价小蛋白面与pd-l1结构的相似程度，数值越小代表空间结构越相近，当时，代表结构完全重合。选取若干的小蛋白骨架与pd-l1的rmsd比对值均在左右，本发明选择的gb1骨架与pd-l1的rmsd值仅为如图5和表2所示，表2列举了本实施例中小蛋白骨架与pd-l1蛋白构象相似度比对所得rmsd值，结构相似度很高。因此gb1具有设计成pd-1/pd-l1抑制剂的潜力。

表2本实施例中小蛋白骨架与pd-l1蛋白构象相似度比对所得rmsd值

实施例3

1)突变体小蛋白8抑制pd-1/pd-l1结合的表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance，spr)检测

spr检测是通过检测芯片折射率的改变，反应芯片表面结合物质重量的变化，当分析物流经芯片表面，与芯片上偶联的配体结合，引起芯片折射率的改变，仪器记录下变化的响应值(responseunit，ru)。ru值体现了芯片表面结合物重量的变化，反应分析物与配体的结合或解离。如图6所示，芯片上偶联pd-1蛋白，并在分析物pd-l1中混合不同浓度的gb1突变体gbm8，随着gb1突变体gbm8浓度的增加，pd-l1与pd-1的结合减少，体现了gb1突变体gbm8对pd-1/pd-l1结合的抑制作用。

2)突变体小蛋白7、突变体小蛋白9、突变体小蛋白11抑制pd-1/pd-l1结合的表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance，spr)检测

spr检测是通过检测芯片折射率的改变，反应芯片表面结合物质重量的变化，当分析物流经芯片表面，与芯片上偶联的配体结合，引起芯片折射率的改变，仪器记录下变化的响应值(responseunit，ru)。ru值体现了芯片表面结合物重量的变化，反应分析物与配体的结合或解离。如图7所示，芯片上偶联pd-1蛋白，并在分析物pd-l1中混合不同浓度的gb1突变体gbm7、gbm9、gbm11，随着gb1突变体gbm7、gbm9、gbm11浓度的增加，pd-l1与pd-1的结合减少，体现了gb1突变体gbm7、gbm9、gbm11对pd-1/pd-l1结合的抑制作用。

此外，本发明中的其余突变体小蛋白如突变体小蛋白1(gbm1)、突变体小蛋白2(gbm2)、突变体小蛋白3(gbm3)、突变体小蛋白4(gbm4)、突变体小蛋白5(gbm5)、突变体小蛋白6(gbm6)、突变体小蛋白10(gbm10)抑制pd-1/pd-l1结合的表面等离子体共振检测的结果与图6和图7相似。

实施例4改造后突变体小蛋白二级结构测定及小蛋白二级结构的稳定性

圆二色谱能够表征蛋白质的二级结构特征。如图8和图9所示，经10个氨基酸突变后的小蛋白仍能保持和野生型小蛋白骨架相似的二级结构，并具有良好的温度稳定性。如图10所示，测量由10℃到90℃温度引起gbm8结构的变化，显示gbm8有较好的温度稳定性，且从90℃冷却到20℃后，结构的恢复率达86％。

此外，本发明中的其余突变体小蛋白如突变体小蛋白1(gbm1)、突变体小蛋白2(gbm2)、突变体小蛋白3(gbm3)、突变体小蛋白4(gbm4)、突变体小蛋白5(gbm5)、突变体小蛋白6(gbm6)、突变体小蛋白7(gbm7)、突变体小蛋白9(gbm9)、突变体小蛋白10(gbm10)、突变体小蛋白11(gbm11)的二级结构测定结果与图8和图9相似，其二级结构的稳定性测试结果与图10相似。

藉由上述技术方案，本发明通过分子克隆、蛋白质原核表达等技术，将pd-l1与pd-1结合面的关键氨基酸位点移植到小蛋白的β折叠面相应位置上，得到一类小蛋白或其突变体，其与pd-l1蛋白有高度的结构相似性，可抑制pd-1/pd-l1结合，是潜在的pd-1/pd-l1抑制剂，其具有弱igg结合能力，在体内循环滞留时间长，并且具有高度结构稳定性，可用于抑制pd-1/pd-l1之间的相互作用，制备简单，可用于规模化生产和应用，以便癌症的免疫治疗。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>上海大学

中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所

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<213>人工序列(人工序列)

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