本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法。
背景技术：
灯盏细辛又名灯盏花，为菊科植物短葶飞蓬(erigeronbreviscapus(vant.)hand.-mazz.)的干燥全草。主要分布于云南、四川、贵州、广西等地。具有活血化瘀、通络止痛，祛风散寒等功效。我国对灯盏细辛化学成分的研究始于20世纪70年代中期，目前已分离鉴定出黄酮类、咖啡酰类、酚酸类、吡喃酮类、植物甾醇、倍半萜类等多种类型的化学成分，其中以灯盏甲素和灯盏乙素为代表的黄酮类化合物是其活性成分。其注射液制剂在临床上主要用于治疗心脑血管系统疾病，除此之外，对治疗老年性疾病、颈性眩晕、糖尿病、肾病等疾病也具有很好的效果。
绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)是1962年由shimomurao等首次从多管水母属(aequoreavictoria)中分离纯化出的一种具有独特功能的生物发光蛋白。能够通过催化自身65～67位的氨基酸残基(ser-tyr-gly)环化形成稳定的生色团，在蓝光或紫外光激发下产生的绿色荧光，gfp作为一种标记蛋白具有发光稳定、耐受性良好、检测方便、可进行活体观察、对受体细胞基本无毒和损伤作用等优点，已成为监测外源基因在遗传转化体系中表达情况的有效工具。
目前，针对灯盏细辛的相关研究主要集中在有效成分的提取分离、药效和药理等方面，偶见灯盏细辛遗传转化体系研究的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，为进一步提升灯盏细辛药用成分含量以及探究在灯盏细辛毛状根遗传转化体系中外源基因的高效表达奠定基础。
第一方面，本发明要求保护一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法。
本发明所提供的灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，具体可包括如下步骤：
(a1)采用含有目的基因表达载体的发根农杆菌的侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘，将侵染后的灯盏细辛叶盘置于ms固体培养基上，于25±2℃(如25℃)恒温暗培养2天。
其中，所述侵染液为用重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌至od600值为0.6所得；所述重悬液为含有终浓度为100μmol·l-1乙酰丁香酮的ms液体培养基。
所述ms固体培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：
大量元素：nh4no31650mg·l-1、kno31900mg·l-1、cacl2·2h2o440mg·l-1、mgso4·7h2o370mg·l-1、kh2po4170mg·l-1；
微量元素：ki0.83mg·l-1、h3bo36.2mg·l-1、mnso4·4h2o22.3mg·l-1、znso4·7h2o8.6mg·l-1、cuso4·5h2o0.025mg·l-1、cocl2·6h2o0.025mg·l-1；
铁盐：feso4·7h2o27.8mg·l-1、na2-edta·2h2o37.3mg·l-1；
有机物质：肌醇100mg·l-1、烟酸0.5mg·l-1、盐酸吡哆醇(维生素b6)0.5mg·l-1、盐酸硫胺素(维生素b1)0.1mg·l-1、甘氨酸2.0mg·l-1；
蔗糖30g·l-1；
琼脂8g·l-1；
ph：5.8-6.0。
注：以上各物质的浓度均为在ms固体培养基中的终浓度。
在本发明的一个实施例中，所述ms固体培养基是采用ms培养基粉末(即所述大量元素、所述微量元素、所述铁盐和所述有机物质)、蔗糖和琼脂配制而成，其中所述ms粉末为phytotechnologylaboratories公司产品，货号：m519，商品名称：murashige&skoogbasalmediumwithvitamins，规格：100l，使用浓度：4.43g/l；蔗糖：30g/l；琼脂：8g/l；ph:5.8-6.0。以上各物质的浓度均为在ms固体培养基中的终浓度。
所述ms液体培养基与所述ms固体培养基相比，差别仅在于不含有琼脂。
(a2)将步骤(a1)培养后的灯盏细辛叶盘转至筛选培养基上，于25℃暗培养，每隔15～20天继代一次，共进行两次以上继代(如三次)，直至获得灯盏细辛毛状根。
其中，进行所述继代时采用的培养基与所述筛选培养基均为含有抗生素的1/2ms固体培养基；所述抗生素为抗生素1和抗生素2，所述抗生素1为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素，所述抗生素2为能够抑制所述发根农杆菌生长的抗生素。
所述继代培养基中的所述抗生素2的含量少于所述筛选培养基中所述抗生素2的含量，且进行后一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量均少于进行前一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量。
另外，进行最后一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量具体可为0。所述继代培养基与所述筛选培养基中的所述抗生素1的含量可相同，也可不相同。
(a3)对步骤(a2)所得灯盏细辛毛状根进行鉴定。
进一步地，步骤(a1)中，采用所述侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘前，不包括将所述灯盏细辛无菌叶盘进行预培养的步骤。
进一步地，步骤(a1)中，所述侵染液可按照包括如下步骤的方法制备得到：向od600值为0.4的所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌的培养液中加入终浓度为100μmol·l-1的乙酰丁香酮，继续培养至菌液od600值为0.6，离心(如室温条件下，4000×g离心7min)后弃上清液，用所述重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌，即得所述侵染液。
进一步地，步骤(a1)中，所述灯盏细辛无菌叶盘可为0.4～0.6cm2大小的叶盘。
进一步地，步骤(a1)中，采用所述侵染液侵染所述灯盏细辛无菌叶盘可按照包括如下步骤的方法进行：将所述灯盏细辛无菌叶盘置于所述侵染液中，28℃100r·min-1振荡10min后捞出，无菌纸吸干叶盘表面残留菌液。
进一步地，步骤(a1)中，所述发根农杆菌具体可为农杆菌c58c1。
进一步地，步骤(a2)中，所述抗生素2具体可为头孢噻污钠(cef)。所述抗生素1具体可为潮霉素b(hyg)。
更进一步地，所述筛选培养基是在1/2ms固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素b后得到的培养基；所述筛选培养基中头孢噻污钠的终浓度为500mg·ml-1、潮霉素b的终浓度为2.5mg·ml-1。
其中，所述1/2ms固体培养基与所述ms固体培养基相比，差别仅在于其中所述大量元素、所述微量元素、所述铁盐和所述有机物质的含量减半。
步骤(a2)中共进行了三次继代。进行第一次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2ms固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素b后得到的培养基；所述继代培养基中头孢噻污钠的终浓度为300mg·ml-1、潮霉素b的终浓度为2.5mg·ml-1。进行第二次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2ms固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素b后得到的培养基；所述继代培养基中头孢噻污钠的终浓度为100mg·ml-1、潮霉素b的终浓度为2.5mg·ml-1。进行第三次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2ms固体培养基中加入潮霉素b后得到的培养基；所述继代培养基中潮霉素b的终浓度为2.5mg·ml-1。
在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为增强型绿色荧光蛋白(egfp)的编码基因。相应的，所述目的基因表达载体为pbi-1300-egfp载体(该载体含有潮霉素抗性选择标记基因和egfp报告基因)。
进一步地，步骤(a3)中，对所得灯盏细辛毛状根进行鉴定的方法包括但不限于：pcr鉴定法、荧光检测法等。
第二方面，本发明要求保护成套培养基或试剂盒。
本发明所提供的成套培养基由前文任一所述的筛选培养基和所述继代培养基组成。
本发明所提供的试剂盒包括前文任一所述的侵染液和所述成套培养基。
第三方面，本发明要求保护所述成套培养基或所述试剂盒在灯盏细辛遗传转化诱导毛状根中的应用。
随着对药用植物中次生代谢产物合成途径研究的深入，基因工程技术的创新和高效遗传转化系统的发展，使得利用遗传代谢工程手段构建能够高效生产具有生物活性的次生代谢产物的植物细胞工厂已成为可能。毛状根是一种能够恶性增殖的器官，相较于天然植物根来说，具有激素自养，生长速度快、周期短，遗传稳定等特点。与此同时，由于毛状根的分化程度很高，对于生长条件要求相对简单，是一种理想的适合大量培养的研究材料，有助于研究根中基因功能和调节作用，亦可作为高效生产植物次生代谢产物的天然反应器。绿色荧光蛋白(gfp)来源于多管水母属(aequoreavictoria)，能够在活体细胞中自主表达，无种属特异性，对受体细胞无毒害作用，可直接在活细胞中检测基因表达、信号转导、蛋白运输与定位等，且对活细胞功能无干扰，是一种极具潜力的基因转移物和蛋白定位标记物，可作为进行基因表达活体检验的理想报告基因。当前gfp基因已广泛应用于植物细胞内植株活细胞内的基因表达与定位，为利用绿色荧光蛋白基因作为构建药用成分生物合成途径的报告基因提供一定的参考依据，本发明首次以绿色荧光蛋白(gfp)作为目的基因，实现了该基因在灯盏细辛毛状根遗传转化体系的高效表达，同时对外源基因在灯盏细辛毛状根生物反应器中的高效表达的可行性研究奠定基础。
附图说明
图1为灯盏细辛毛状根转化体系不同阶段。a：灯盏细辛无菌苗；b、c、d：发根农杆菌c58c1侵染叶盘2d、15d、40～50d后诱导产生毛状根。
图2为发根中gfp基因pcr鉴定结果。m：dl2000dnamaker；p：阳性对照；n：阴性对照；1～2：样品。
图3为gfp基因在灯盏细辛毛状根细胞中的表达。a：蓝色光激发下成功转基因毛状根发出强烈绿色荧光；b：自然光亮视野；c：透射光视野。坐标尺＝50μm。
图4为灯盏细辛转基因毛状根液体培养不同阶段。a：鉴定含有绿色荧光标记的毛状根；b：毛状根液体培养至3周；c：毛状根液体培养至7周；d：毛状根液体培养至10周。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的各培养基如下：
ms固体培养基：采用ms培养基粉末(含有大量元素、微量元素、铁盐和有机物质)、蔗糖和琼脂配制而成，其中所述ms粉末为phytotechnologylaboratories公司产品，货号：m519，商品名称：murashige&skoogbasalmediumwithvitamins，规格：100l，使用浓度：4.43g/l；蔗糖：30g/l；琼脂：8g/l；ph:5.8-6.0。其中，各物质的浓度为在培养基中的终浓度。
ms液体培养基：与所述ms固体培养基相比，差别仅在于不含有琼脂。
1/2ms固体培养基：与所述ms固体培养基相比，差别仅在于其中ms培养基粉末(含有大量元素、微量元素、铁盐和有机物质)的用量减半。
1/2ms液体培养基：与所述1/2ms固体培养基相比，差别仅在于不含有琼脂。
下述实施例中所用到的生物材料如下：
发根农杆菌c58c1：记载于“马莹,马晓惠,马晓晶等.丹参酮生物合成途径cyp76ah1基因rna干扰体系的建立及干扰效果研究.中国中药杂志,2015年4月”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
pbi-1300-egfp载体：该载体含有潮霉素抗性选择标记基因和egfp报告基因。记载于“yujunzhao,yifengzhang,pingsu,etal.genetictransformationsystemforwoodyplanttripterygiumwilfordiianditsapplicationtoproductnaturalcelastrol.frontiersinplantscience,january2018,volume8”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
实施例1、灯盏细辛遗传转化诱导毛状根
本实施例采用电转化法将pbi-1300-egfp载体(含有潮霉素抗性选择标记基因和egfp报告基因)导入发根农杆菌c58c1中，以农杆菌c58c1工程菌(含有pbi-1300-egfp载体)为介导，叶盘法转化灯盏细辛无菌叶片，诱导并筛选出具有潮霉素抗性的毛状根，提取灯盏细辛毛状根基因组dna，经gfp基因特异性引物扩增，得到与目的基因分子片段大小一致的dna条带；双光子显微镜下观察可见明显的绿色荧光。
一、材料和试剂
供试灯盏细辛无菌植株种植于中国中医科学院中药资源中心组培室；pcr反应过程中所用的2×easytaqpcrsupermix和dnamarker等为北京全式金生物技术有限公司产品；质粒提取试剂盒购自omegabiotek公司；头孢噻肟钠(cefotaximesodium)购自美国genview公司；卡那霉素(kanamycin)、利福平(rifampicin)、潮霉素(hygromycin)、乙酰丁香酮(acetosyringone)为北京索莱宝科技有限公司产品，ms培养基(murashigeandskoogbasalmeidiumwithvitamins)购美国phytotechnologylaboratories公司，酵母提取物(yeastextract)、胰蛋白胨(tryptone)为英国oxoid公司产品，氯化钠(nacl)购自国药集团化学试剂有限公司。
二、农杆菌工程菌株的制备
取发根农杆菌c58c1的感受态细胞于冰上冻融，加1μl质粒dna(pbi-1300-egfp载体)于20μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀，取出细胞与质粒的混合物转入预冷(-20℃)电转杯中，在3000v高压下电击，取出电转杯，冰浴5min，加入500μl预冷的空白lb培养基，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200r·min-1振荡培养4h后，取100μl菌液涂在lb(50mg·ml-1rif+50mg·ml-1kan)固体培养基上，28℃恒温培养箱倒置培养24h，菌液pcr鉴定阳性克隆，并将阳性克隆菌种接种于lb(50mg·l-1rif+50mg·l-1kan)液体培养基中培养至对数生长期，无菌条件下将阳性克隆菌液与50％甘油等体积混合于离心管中，-80℃冻存。。
所用引物靶向gfp基因，具体如下：
gfp-f：5’-cgagctcttaaagatcttcttcagaa-3’；
gfp-r：5’-cttgctcaccatggtacctctagag-3’。
结果显示：随机挑取单菌落至1mllb(50mg·ml-1rif+50mg·ml-1kan)液体培养基中，28℃，220r·min-1震荡5h后进行菌液pcr鉴定，得到与目的基因片段大小一致(758bp)的扩增条带，表明pbi-1300-egfp载体已成功转化至农杆菌c58c1感受态菌株中。
三、农杆菌侵染液的制备
取-80℃冻存的步骤二构建的c58c1工程菌(携带pbi-1300-egfp载体)菌液20μl加入到2mllb(50mg·ml-1rif+50mg·ml-1kan)液体培养基中，28℃恒温过夜培养24h。取活化的c58c1工程菌菌液300μl加入到30mllb(50mg·ml-1rif+50mg·ml-1kan)液体培养基中，28℃，220r·min-1振荡培养至菌液od600值为0.4时，加入终浓度为100μmol·l-1的乙酰丁香酮(as)，继续振荡直至菌液od600值为0.6。室温条件下，4000×g离心7min，弃上清液，另加30mlms(含100μmol·l-1乙酰丁香酮)液体培养基重悬菌体，得侵染液，其od600值为0.6。
四、灯盏细辛叶片侵染及毛状根的诱导
灯盏细辛无菌苗叶片去边缘，切成0.4～0.6cm2大小的叶盘后，将部分叶盘用农杆菌c58c1做侵染处理，以作对照，剩余叶盘转至事先制备好的od600值为0.6的c58c1工程菌菌液(即步骤三制备的侵染液)中，28℃，100r·min-1，振荡10min后捞出，无菌纸吸干叶盘表面残留菌液，置ms固体培养基上25℃恒温暗培养2d。后将叶盘转至筛选培养基【配方：含500mg·ml-1头孢噻污钠(cef)及2.5mg·ml-1潮霉素b(hyg)的1/2ms固体培养基】上，25℃暗培养10～15d后，叶盘边缘可见发根，之后每隔15～20d继代1次。共进行三次继代。进行第一次继代时，所采用的继代培养基是在1/2ms固体培养基中终浓度为300mg·ml-1的头孢噻污钠以及终浓度为2.5mg·ml-1的潮霉素b后得的培养基。进行第二次继代时，所采用的继代培养基是在1/2ms固体培养基中加入终浓度为100mg·ml-1的头孢噻污钠以及终浓度为2.5mg·ml-1的潮霉素b后得的培养基。进行第三次继代时，所采用的继代培养基是在1/2ms固体培养基中加入终浓度为2.5mg·ml-1的潮霉素b(不加入头孢噻污钠)后得到的培养基。继代时cef浓度逐次降低外，其他成分均不变，这是为了保证除菌完全，筛选出阳性毛状根，并按照如下公式计算灯盏细辛毛状根的诱导率：
毛状根诱导率(％)＝发根叶盘数/叶盘总数×100％
分别用c58c1及c58c1工程菌菌液侵染灯盏细辛叶片，经侵染过的灯盏细辛叶盘(图1中b)，15d(图1中c)后在叶盘边缘处诱导产生毛状根，40～50d(图1中d)后开始出现分支，在抗性筛选过程中，未转化成功的毛状根会逐渐黄化死亡，而阳性毛状根总体长势良好，平均诱导率为34％(表1)。
表1灯盏细辛转基因毛状根诱导率
五、叶盘发根的pcr鉴定
取长势良好的发根约100mg，ctab法提取发根基因组dna，以发根基因组dna为样品模板，同时以c58c1工程菌为阳性对照，以非转基因毛状根为阴性对照，用引物gfp-f、gfp-r(具体序列同上)对发根基因组dna中是否含c58c1工程菌质粒的gfp基因进行pcr鉴定。pcr扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
结果显示：上述方法对经除菌筛选完全的发根基因组dna进行pcr鉴定，得到与gfp基因片段大小一致(758bp)的条带，表明gfp基因已成功转化至灯盏细辛毛状根基因组中。具体见图2。
六、转基因毛转根的gfp荧光检测
取经步骤五pcr鉴定阳性转基因灯盏细辛毛状根约2cm，制成临时装片，于双光子显微镜下观察灯盏细辛毛状根中绿色荧光蛋白的表达情况。
结果显示：在双光子显微镜下观察，可见成功插入目的基因的从灯盏细辛转基因毛状根(图3中的a和c)在488nm发射出强烈而稳定的绿色荧光(520nm)，证实了外源的gfp基因在灯盏细辛毛状根中成功表达。
七、转基因毛状根的扩大培养
将鉴定阳性的毛状根在1/2ms液体培养基中进行扩大培养。转基因毛状根的生长周期约为9～10周，在其生长周期的前3周，转基因毛状根生长比较缓慢(图4中b)，从第4周开始表现出明显的生长趋势，肉眼可见众多分支(图4中c)，扩大培养至第8～9周以后生长基本进入停滞期，10周之后转基因毛状根开始变硬，部分根尖产生褐化现象(图4中d)。
该实施例的结果表明gfp基因已成功地整合到到灯盏细辛毛状根基因组中，并能够稳定表达。本发明为进一步探究外源基因在灯盏细辛毛状根遗传转化体系中的高效表达奠定基础。