大豆GmCYS20基因及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及参与调控豆科植物共生结瘤的半胱氨酸蛋白酶抑制剂GmCYS20基因及应用。

背景技术：

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)在生物体内广泛存在，是一类可以与半胱氨酸蛋白酶特异性结合，并抑制其蛋白水解酶活性的蛋白质。Cystatin蛋白首先被报道参与调控植物发育过程，包括严格控制植物体内蛋白质的降解，参与贮藏蛋白的沉积和调运等生理过程。此外，cystatin蛋白通过调控半胱氨酸蛋白酶的活性，从而延缓叶片衰老过程。近年来，研究发现cystatin基因在提高植物对非生物胁迫的抗性方面具有重要作用。水稻cystatin基因OC-I通过调控半胱氨酸蛋白酶活性影响植株对胁迫的抗性。拟南芥AtCYS4和AtCYS5基因受高温诱导表达，基因的过表达增强拟南芥的耐高温能力。苹果MpCYS2、MpCYS4和MpCYS5基因分别提高转基因拟南芥对干旱、ABA和盐胁迫的抗性。野生大豆cystatin蛋白GsCPI14通过与钙结合类受体蛋白激酶GsCBRLK相互作用，参与碱胁迫反应。另外，植物cystatin蛋白对鳞翅目、鞘翅目等有害昆虫的生长抑制作用以及cystatin参与植物对病原菌入侵的防御过程等方面也得到了较为深入的研究。

综上，大量证据表明植物cystatin基因在调控植株发育，提高植物对非生物胁迫和病虫害的抗性等方面具有重要作用。但关于该类基因在豆科植物共生结瘤过程中的功能研究报道较少。本发明分离并鉴定了1个大豆cystatin基因GmCYS20，该基因受根瘤菌诱导上调表达，并且在豆科植物百脉根中超表达此基因后，结瘤数明显增多，进而显著增强豆科植物固氮能力，因此该基因在农业以及生态学上具有很重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一个参与调控豆科植物共生结瘤的半胱氨酸蛋白酶抑制剂GmCYS20基因，所述基因的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，长度为291bp，位于大豆基因组20号染色体的8475315–8478532位，含有2个外显子和1个内含子。

本发明所述的半胱氨酸蛋白酶抑制剂GmCYS20基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

本发明的再一个目的是提供一种参与调控豆科植物共生结瘤的半胱氨酸蛋白酶抑制剂GmCYS20基因在调控豆科植物(百脉根、紫云英、苜蓿、大豆和花生等)根瘤数目中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一个参与调控豆科植物共生结瘤的半胱氨酸蛋白酶抑制剂GmCYS20基因的制备方法，其步骤是：栽培大豆W82种子表面灭菌后，种脐朝下平铺于无菌润湿滤纸上，28℃暗培养待萌发。收集新鲜大豆根尖组织，液氮速冻。参照RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，USA)说明书，提取大豆根尖组织总RNA。按照TIANGEN公司反转录试剂盒操作说明获得cDNA第一链。根据https://www.soybase.org/search/网站公布的大豆GmCYS20基因(Glyma.20g045500)序列设计引物F-GmCYS20和R-GmCYS20，PCR扩增GmCYS20目的基因。回收目的片段，连接T载体，送南京金斯瑞公司测序，得到该基因的全长。本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20长度为291bp，位于大豆基因组20号染色体的8475315–8478532位，含有2个外显子和1个内含子。序列分析表明，GmCYS20基因的CDS区编码97个氨基酸残基，蛋白质的等电点(PI)为5.83，N端无信号肽，三维结构包含2个α螺旋和6个β折叠。GmCYS20属于第III类cystatin蛋白，含有该家族共有的4个保守结构域GG、LARFAVE、QVVSG和SW。可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的GmCYS20基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。

一种参与豆科植物共生结瘤的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20在百脉根、紫云英、苜蓿、大豆和花生上的应用，通过遗传转化来实现。本发明构建GmCYS20基因的植物超表达载体，通过冻融法转入农杆菌LBA1334中，然后通过农杆菌介导的毛根转化转入豆科植物百脉根中，通过GUS鉴定得到阳性植株后，将阳性植株种在沙和蛭石1:1混合盆栽中，接种根瘤菌。结果表明超表达后，豆科植物百脉根结瘤数目明显提高，这是首次在百脉根中证实半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20正调控共生结瘤过程。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1.本发明利用反转录PCR技术在大豆根尖中分离到了一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20，并且通过同源蛋白多序列比对及保守结构域预测等方法证实了该基因是一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因；同时又通过超表达遗传转化的方法证实了该基因参与并正调控豆科植物的结瘤。这是首次证实大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20正调控豆科植物共生结瘤。

2.豆科植物通过根瘤共生固氮来增加土壤的肥力，但是自然情况下豆科植物根中根瘤的数目有限，因此通过增加根瘤的数目，进而增加豆科植物的固氮能力来增加土壤的肥力，有效减少化肥等的使用，在农业以及生态学上都有着重大意义。本发明正是通过超表达技术证实了该基因正调控结瘤，由此可以通过转基因的手段使该基因在豆科植物中超量表达，这样就可以大大增加根瘤的数目，从而加强固氮能力，这在豆科作物固氮机制研究以及农业生产上具有一定的应用前景。

附图说明

图1为GmCYS20基因的克隆1A和编码氨基酸序列1B分析示意图。

图2为一种利用DNAMAN软件将GmCYS20基因预测的蛋白序列与GmCYS20同源蛋白序列比对示意图，其中:

Sequence source:Glycine soja，accession KHN35444.1

Sequence source:Vigna radiata，accession XP_014516943.1

Sequence source:Cajanus cajan，accession XP_020236689.1

Sequence source:Vigna angularis，accession XP_017411678.1

Sequence source:Cicer arietinum，accession XP_012574834.1

Sequence source:Medicago truncatula，accession XP_003599710.2

Sequence source:Lupinus angustifolius，accession XP_019419326.1

Sequence source:Medicago sativa，accession AAZ98791.1

Sequence source:Lotus japonicus，accession AFK41117.10

Sequence source:Arachis hypogaea，accession CBX19819.1

Sequence source:Arachis duranensis accession XP_020995318.1

Sequence source:Arachis ipaensis，Ai:accession XP_016197069.1

图3为一种超表达GmCYS20基因促进百脉根植株结瘤示意图，其中3A为超表达转基因植株与对照正常植株的结瘤情况对比；3B为超表达转基因植株与对照正常植株的单株平均结瘤数目对比。

图4为一种利用Real Time-PCR检测超表达转基因植株中GmCYS20基因的超表达效率以及共生标志基因的表达量示意图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图和本发明的优选实施例进行详细描述。

实施例1

一个参与豆科植物共生结瘤的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20的制备方法，其步骤是：

W82大豆种子表面灭菌后，种脐朝下平铺于无菌润湿滤纸上，28℃暗培养待萌发。收集新鲜大豆根尖组织，液氮速冻。参照RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，USA)说明书，提取大豆根尖组织总RNA。按照TIANGEN公司反转录试剂盒操作说明获得cDNA第一链。根据https://www.soybase.org/search/网站公布的大豆GmCYS20基因(Glyma.20g045500)序列设计引物F-GmCYS20和R-GmCYS20(表1)，PCR扩增GmCYS20目的基因(附图1所示)。回收目的片段，连接T载体，送南京金斯瑞公司测序验证。

表1本发明中所使用的引物

注：下划线区域为酶切位点序列

对基因编码的氨基酸序列进行分析，其步骤是：利用NCBI网站的Blastp工具寻找栽培大豆(Glycine max)GmCYS20蛋白(NP_001239817.1)的同源蛋白，包括野生大豆(Glycine soja，KHN35444.1)，绿豆(Vigna radiata，XP_014516943.1)，木豆(Cajanus cajan，XP_020236689.1)，赤豆(Vigna angularis，XP_017411678.1)，鹰嘴豆(Cicer arietinum，XP_012574834.1)，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula，XP_003599710.2)，狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius，XP_019419326.1)，紫花苜蓿(Medicago sativa，AAZ98791.1)，百脉根(Lotus japonicus，AFK41117.10)，栽培花生(Arachis hypogaea，CBX19819.1)，蔓花生(Arachis duranensis，XP_020995318.1)和落花生(Arachis ipaensis，XP_016197069.1)共12种不同豆科植物的cystatin同源蛋白。利用DNAMAN软件进行同源蛋白的多序列比对分析(附图2所示)。

实施例2

一种参与调控豆科植物共生结瘤的GmCYS20基因在调控豆科植物(百脉根、紫云英、苜蓿、大豆和花生等)根瘤数目中的应用，其步骤是：

为了研究GmCYS20在豆科植物百脉根中的生物学功能，本发明通过超表达的方法探索了GmCYS20的生物学功能(附图3所示)。主要涉及到超表达载体的构建和遗传转化，具体实施步骤如下：

超表达融合载体的构建：设计引入酶切位点EcoR I和Sma I的引物F-OX和R-OX(见表1)，将测序正确的目的基因插入植物表达载体p1302G(Gus基因作为筛选标记基因)中，构建p1302G-GmCYS20重组质粒，经冻融法转入发根农杆菌A.rhizogenes LBA1334(该菌株是国际上已公布的菌株，来自美国洪宗烈教授)中用于百脉根的毛根转化。百脉根毛根转化方法主要参考Lotus japonicus Handbook。

具体实施步骤如下：

(1)植物材料培养：提前5天萌发百脉根MG20种子。用砂纸将种子磨毛(比一般萌发种子磨得轻些)，放在液氮中冷冻1分钟，75％(质量体积比)乙醇浸泡1分钟，5％(有效氯浓度)NaClO浸泡15分钟，无菌水冲洗5-6次，除去残留的NaClO。种子表面消毒完成后，留少许无菌水刚好淹没种子，黑暗条件下4℃春化处理1天，然后转到MS不加蔗糖的固体培养基上23℃暗培养2天，后置于光照培养箱(16h光照，8h黑暗)中23℃继续培养2天，待用。

(2)菌株和质粒准备：所用菌株为A.rhizogenes LBA1334(壮观霉素抗性)，将含目的基因的质粒通过电转化方法导入农杆菌A.rhizogenes LBA1334，鉴定后-70℃保存菌株备用。提前2天，取保存菌种划平板(含质粒抗性平板)活化。

(3)侵染转化：第一天：下午，挑单菌落接种于5ml LB培养基(含质粒抗性)，28-30℃振荡培养16-24小时。第二天：将前一天接种的小量菌扩大培养，1：100比例接种，28-30℃振荡培养8小时左右。将大量培养的菌液以6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，用无菌水重悬菌体，使其OD600＝0.8左右。将幼苗的下胚轴基部切断，有子叶的部分用此重悬菌液浸泡30分钟，捞出外植体，用滤纸吸干，置于MS不加蔗糖培养基上共培养。

(4)共培养：先避光共培养3-5天。然后把外植体转入HRE和300μgmL-1cefotaxime的培养基上继续培养10天，这期间毛根从下胚轴切口处长出。

(5)阳性转基因根鉴定：剪取根尖处约0.5cm长的根段放入GUS染液中，37℃暗培养过夜，显蓝的根为阳性转基因根。

(6)炼苗和移栽：鉴定后，剪去非转化的根，把苗放在装有水的平皿中(不加盖)炼苗1天，然后移栽到花盆中于光照培养箱(16h光照，8h黑暗)23℃培养。花盆中事先加入蛭石(vermiculite)和沙(sand)按1:1比例混合的基质。每3天浇一次无氮营养液。

(7)结瘤统计：百脉根根瘤菌MAFF303099(来源于中国科学院华南植物园吴国江教授实验室，见遗传资源表)在YMA平板上活化后，接入液体TY培养基中，28℃振荡培养24-36h；培养好的根瘤菌转入无菌的离心管中，4℃，7000r/min离心5min，收集菌体；以无菌Fahraeus无氮营养液洗涤并离心2次；加入无氮营养液重悬菌体，接种于百脉根幼苗根部。每天浇灌无氮营养液1次。接种4周后，对植株结瘤表型进行统计拍照。根据单株结瘤数和样本量(n)，计算单株平均结瘤数，试验重复两次，取平均值。

(8)基因表达检测：利用表1中GmCYS20和结瘤相关基因NIN、ENOD40-1和ENOD40-2的荧光定量引物检测复合体植株阳性发状根中各基因的转录水平，百脉根UBI基因作为内参。按照Takara公司PrimeScript RT reagent Kit操作说明进行荧光定量PCR检测，根据相对定量法(2-⊿⊿Ct)公式计算结果。试验重复3次，试验数据采用Excel 2007和SPSS 13.0软件进行分析，并绘制图表(附图4所示)。

上述步骤的培养基及试剂配方如下：

1)MS培养基：MS basal salt mixture(Sigma)4.3g，MS vitamin powder 0.103g，0.7-0.8％(质量体积比)琼脂粉，ddH2O定容至1000mL，调节至pH 5.8。

2)YMA培养基：10.0g甘露醇(或蔗糖)，0.4g Yeast Extract，0.5g K2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.1g CaCl2·6H2O，0.1g NaCl，4mL Rh微量元素液，ddH2O定容至1000mL，调节至pH 6.8-7.0，115℃灭菌20min。

3)Rh微量元素液：5.0g H3BO3，5.0g Na2MoO4，ddH2O定容至1000mL。

4)Fahraeus无氮营养液：0.10g CaCl2·2H2O，0.12g MgSO4·7H2O，0.10g KH2PO4，0.15g Na2HPO4·12H2O，1mL Gibson微量元素液，5mg柠檬酸铁，ddH2O定容至1000mL。

5)Gibson微量元素液：2.86g H3BO3，0.22g ZnSO4·7H2O，2.03g MnSO4·4H2O，0.13g Na2MoO4·2H2O，0.08g CuSO4·5H2O，ddH2O定容至1000mL。

6)GUS染液：100mM sodium phosphate buffer,pH 7.0，0.1％Triton X-100，0.1％N-laurylsarcosine，10mM Na2EDTA，1mM铁氰化钾(K3Fe(CN)6)，1mM亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)和0.5mg/mL X-GluC。

7)HRE培养基：20X的SH-A盐，20X的UM-C维生素，10g蔗糖，3mL 1M MES，0.7-0.8％(质量体积比)琼脂粉，ddH2O定容至1000mL，调节至pH 5.8。110℃灭菌30min。

20X的SH-A盐：

用100mL无菌水分别溶解FeSO4·7H2O和NaEDTA，其它盐溶于700mL无菌水中，然后混合定容至1000mL，分装为50mL每管，-20℃保存。

20X的UM-C维生素：

ddH2O定容至1000mL，分装为50mL每管，-20℃保存。

MES(2-[N-Morpholino]ethane-sulfonic acid),1M储存液：

称29.28g MES(Sigma)用ddH2O定容至150mL，调节至pH 5.8，分装为6mL每管，-20℃保存。

实施例3

实施例3与实施例2基本相同，其不同之处在于，

具体实施步骤(1)中植物材料培养分别为提前5天萌发苜蓿；步骤(7)中根瘤菌接种为苜蓿根瘤菌Sinorhizobium meliloti 1021(该菌株是国际上已公布的菌株，Juan等，Comparison of Developmental and Stress-Induced Nodule Senescence in Medicago truncatula.Plant Physiol,152:1574-1584，2010)。

实施例4

实施例4与实施例2基本相同，其不同之处在于，

具体实施步骤(7)中根瘤菌接种为紫云英根瘤菌Rhizobium huakuii(该菌株是国际上已公布的菌株，Li等Anodule-specific plant cysteine proteinase,AsNODF32,is involved in nodule senescence and nitrogen fixation activity of the green manure legume Astragalus sinicus.New phytologist 180:185-192 2008)。

实施例5

实施例5与实施例2基本相同，其不同之处在于，

具体实施步骤(7)中根瘤菌接种为大豆根瘤菌Rhizobium fredii HN01lux(该菌株是国际上已公布的菌株，陈昌斌等，组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux结瘤固氮效率的促进作用，科学通报，44(5)1999)。

实施例6

实施例6与实施例2基本相同，其不同之处在于，

具体实施步骤(7)中根瘤菌接种为花生根瘤菌Spr(该菌株是国际上已公布的菌株，于景丽等，celB基因标记法研究酸性土花生接种及施钼效果，植物营养与肥料学报,12(2):250-253，2006)。

所述的豆科(Leguminosae sp.)为双子叶植物乔木、灌木、亚灌木或草本，直立或攀援，常有能固氮的根瘤植物。模式属：Faba P.Miller。约650属，18000种，广布于全世界。中国有172属，1485种，13亚种，153变种，16变型；各省区均有分。该科具有重要的经济意义，它是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜的重要来源之一。本发明所述的豆科植物具体为百脉根(Lotus japonicus)、苜蓿(Medicago truncatula)、紫云英(Astragalus sinicus)、大豆(Soybean)和花生(Peanut)等。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 信阳师范学院

<120> 大豆GmCYS20基因及应用

<141> 2018-03-28

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 294

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 1

atggcagcac ttggtgggaa tcgtgatgtg acaggaagcc agaacagcgt tgagatcgat 60

gctctagctc gctttgctgt tgaagaacac aacaaaaaac agaatgccct tttggagttt 120

gaaaaggtgg taactgcgaa acagcaagtg gtttctggta ccttgtacac catcactttg 180

gaggcaaaag atggtgggca aaagaaggtt tatgaagcca aagtttggga gaagtcatgg 240

ttgaacttca aggaggtgca agagttcaag cttgttggag atgcacctgc atag 294

<210> 2

<211> 97

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2

Met Ala Ala Leu Gly Gly Asn Arg Asp Val Thr Gly Ser Gln Asn Ser

1 5 10 15

Val Glu Ile Asp Ala Leu Ala Arg Phe Ala Val Glu Glu His Asn Lys

20 25 30

Lys Gln Asn Ala Leu Leu Glu Phe Glu Lys Val Val Thr Ala Lys Gln

35 40 45

Gln Val Val Ser Gly Thr Leu Tyr Thr Ile Thr Leu Glu Ala Lys Asp

50 55 60

Gly Gly Gln Lys Lys Val Tyr Glu Ala Lys Val Trp Glu Lys Ser Trp

65 70 75 80

Leu Asn Phe Lys Glu Val Gln Glu Phe Lys Leu Val Gly Asp Ala Pro

85 90 95

Ala