一种利用哺乳动物胚胎培养液检测小RNA的方法与流程

本发明涉及生物医学和分子细胞生物学领域，具体涉及一种提取分析样本中微量rna的方法。

背景技术：

信使rna是dna的一条链作为模板转录的产物，信使rna携带的遗传信息能指导蛋白质的合成，包含了大量的遗传信息。故mrna的序列信息对了解基因表达是非常重要的。除了指导蛋白合成的信使rna，基因组中还有大量的模板是转录非编码rna的。其中包括各种小分子rna(mirna，sirna，piwirna，pirna，snorna，scarna，sdrna，tsrna等)，它们的长度大约为22-50nt不等，这些rna会影响多种生命进程，包括对胚胎发育的过程及干细胞分化的过程都有调节作用。超过半数的基因都会受到各种小分子rna的调控。小分子rna不仅存在于细胞内部，同时，细胞也会通过外泌体等其他方法将小分子rna释放到培养液中。由于1)信使rna包含大量转录组的信息；2)小分子rna有比较好的稳定性，同时表达量相对稳定，rna是一个潜在的无创检测的生物标记物。

例如，试管婴儿胚胎的无创检测就是重要的应用领域。我国平均每8对夫妻中就有一对遭遇生育困境,而且不能生育的夫妻呈年轻化趋势，25岁至30岁的患者居多。目前，中国不孕不育患者已超过4000万，占育龄人口的12.5％。在我国，需要辅助生殖助孕的育龄妇女大约有300万左右。而且不幸的是，这个数字仍在着年上升。庞大的试管婴儿需求量带来的是对试管婴儿技术的高要求。

试管婴儿的过程按顺序分别为促排卵、取卵、取精、体外受精、胚胎培养、胚胎移植、黄体支持以及妊娠检查。目前，试管婴儿的成功率不高，从胚胎植入到胎儿出生的成功率约为30％，低成功率很大一部分原因是由于不合格的受精卵所致。所以说，受精卵的质量至关重要。最根本的判断受精卵的质量的方法是形态学的判断方法。更进一步的基因层面的检测是通过有创的方法来实现的，体外受精卵的检测通常需要从胚胎中取一个细胞出来，再对单细胞进行单细胞测序，目前为止，科学家们发现一些特定小分子rna的表达量与胚胎的健康状况有一定的关联性。但是这样的操作可能会对出生以后婴儿的健康成长有负面的影响。不仅如此，从胚胎中取单细胞的过程需要再显微镜下精密操作，可以说是一个耗时耗力的工作。为了解决这个问题，人们开始通过检测胚胎培养液来判断对应胚胎的健康与否，是为胚胎的无创检测。因此，通过对培养液中rna的测定，有希望增加无创检测的准确率。但由于胚胎释放的rna数量有限，其检测成功率仍然与单细胞检测有一定的差距。

对于选取rna的生物标记物，最高效的方法是对培养液中有哪些rna进行定性定量的测定。然而现有的rna的提取及分析的技术有许多局限性：1)需要大量的起始小分子rna；2)由于小分子rna的链非常短，获取小分子rna及扩增存在困难；3)rna加接头连接效率过低；4)仅能扩增已知序列rna。因此，亟需找到一种提取分析细胞培养液中微量rna技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供一种提取检测微量rna的方法，特别是利用细胞培养液进行检测的方法，能够提高获取rna特别是小分子rna及扩增成功率，提高接头链接效率，提高微量rna的检测效率，本发明的方法操作简单，安全性和可靠性更高。

在本发明的第一方面，提供一种检测rna的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提供可能含有rna的样本；

(2)加入裂解液和rna消化酶抑制剂；

(3)加入dna消化酶消化样本中的dna；

(4)加入核糖体rna抑制引物；

(5)加入3’接头引物和rna连接酶，使之连接于样本中rna的3’端；

(6)加入反转录引物；

(7)加入5’接头引物和rna连接酶，使之连接于样本中rna的5’端；

(8)加入rna消化酶抑制剂及反转录酶进行反转录；

(9)加入rna消化酶消化样本中的rna；

(10)加入扩增引物和dna聚合酶进行pcr扩增反应；

(11)在步骤10反应结束后，加入扩增引物和dna聚合酶进行二次pcr扩增反应。

优选地，所述的含有rna的样本是细胞的培养液，更优选地是受精卵在形成8细胞前或囊胚期前培养大于等于24小时的培养液。

优选地，所述的rna抑制引物是5.8s核糖体rna抑制引物，其序列为seqidno：1，优选为seqidno：6，即引物3‘端含teg间臂的生物素修饰，更优选为seqidno：11。

在上述任一优选例中，所述的。最优选地，所述的。

在另一优选例中，所述的3‘接头引物的序列为seqidno:3，更优选地，为seqidno：7，即引物seqidno：7的5‘端为腺苷酰化修饰，3’端为双脱氧胞苷修饰。

在另一优选例中，所述步骤(6)反转录引物，其序列为seqidno：8，即5’端含有生物素修饰。

在另一优选例中，所述的5’接头引物，其序列为seqidno：9，优选为seqidno：10，其5’端含有氨基修饰。

在另一优选例中，所述步骤(9)的rna消化酶包括rnasea和rnaset1中任一个酶或其组合。

在另一优选例中，所述步骤(10)的扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，优选地正向扩增引物序列为seqidno：3，反向扩增引物序列为seqidno：4。

在另一优选例中，所述步骤(10)扩增反应的程序为：

在另一优选例中，所述步骤(11)二次扩增反应的程序为：

在另一优选例中，所述步骤(2)是加入0.01％-0.2％tritonx-100做为裂解液，及重组rna消化酶抑制酶，37℃孵育5-60分钟。

在另一优选例中，所述步骤(3)是加入dna消化酶i和tris-hcl，37度孵育15-60min。

在另一优选例中，所述步骤(4)是加入序列为seqidno：11的5.8s核糖体rna抑制引物，72℃孵育10-45分钟。

在另一优选例中，所述步骤(5)是加入seqidno：7的3‘接头引物，peg8000，t4rna连接酶2，truncatedkq，tris-hcl，mgcl2，dtt，30℃孵育3-8小时；之后加入2-5单位重组rna消化酶抑制酶，4℃孵育5-16小时。

在另一优选例中，所述步骤(6)是加入seqidno：8的反转录引物，30℃孵育5-45分钟；和/或，lambda外切酶，脱腺苷化酶，37℃孵育5-45分钟。

在另一优选例中，所述步骤(7)是加入序列为seqidno：10的5’接头引物，atp，t4rna连接酶，trishcl，mgcl2，dtt，37℃孵育20-60分钟。

在另一优选例中，所述步骤(8)是加入tris-hcl，kcl，dtt，dntp，重组rna消化酶抑制酶，42℃孵育20-75分钟；加入反转录酶，75℃孵育5-30分钟。

在另一优选例中，所述步骤(9)是加入rna消化酶rnasea和rnaset1，tris-hcl，37℃孵育5-60分钟。

在另一优选例中，所述步骤(10)是加入mgcl2，dna聚合酶，dntp，加入的正向扩增引物序列为seqidno：3，反向扩增引物序列为seqidno：4，将混合液置于扩增仪中进行扩增反应，扩增程序为：

所述步骤(11)是加入在步骤(10)反应结束后，吸出部分原反应液置于新的容器中，加入mgcl2，dna聚合酶，dntp，加入的扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物序列为seqidno：3，反向扩增引物序列为seqidno：4；和/或将混合液置于扩增仪中进行扩增反应，扩增程序为：

在另一优选例中，所述的方法还可以包括对权利要求1-10获得的样本进行纯化并进行测序，检测样本中的rna种类及表达量。

在本发明的第二方面，提供一种用于上述rna提取检测方法中的试剂盒,包括：

(1)一种或多种重组rna消化酶抑制酶；和/或

(2)dna消化酶i；和/或

(3)5.8s核糖体rna抑制引物；和/或

(4)3‘接头引物；和/或

(5)5‘接头引物；和/或

(6)反转录引物；和/或

(7)一种或多种rna消化酶。

本发明的有益效果在于，方便便捷简便，无需采用组织或细胞进行检测，提取检测效率高，能够检测到常规方法没有检测到的小分子rna等。

实验步骤

细胞培养液的获得：通过单精子法获得受精卵，在形成8细胞前或囊胚期前培养大于等于24小时，吸出一定量的培养液，如9μl培养液，作为检测的起始材料。

在9μl培养液中加入3μl裂解液(0.01％-0.2％tritonx-100,；2-5单位重组rna消化酶抑制酶，takara或者neb；)，37℃孵育5-60分钟。

在步骤2反应后加入0.01-1单位dnasei，neb；10-200pmoltris-hcl，37度孵育15-60min。

在步骤3反应后加入2μl5.8s核糖体rna抑制引物(2-8pmol)，如seqidno：1或者seqidno：6，引物3‘端可含或者不含teg间臂的生物素修饰，72℃孵育10-45分钟。

在步骤4反应后加入10-50pmol3‘接头引物，如seqidno：2，其序列为5’atctaattctcgnnnnnnatgc3‘，或者seqidno：7，其序列为5’rapptctaattctcgnnnnnnatgc-ddc3‘，5‘端为腺苷酰化修饰，3’端为双脱氧胞苷修饰；0.1-0.2μlpeg8000；10-100单位t4rna连接酶2，truncatedkq，neb；50-100pmoltris-hcl；10-50pmolmgcl2；1-10pmoldtt；2-5单位重组rna消化酶抑制酶，takara或者neb。第一步30℃孵育3-8小时。第二步4℃孵育5-16小时。

在步骤5反应后加入50-500pmol反转录引物，如seqidno：8，其序列为5‘biotin-gcatnnnnnncgagaattagra3‘，5’端含有生物素修饰；1-5单位lambda外切酶，neb；5-50单位脱腺苷化酶，neb。第一步30℃孵育5-45分钟。第二步37℃孵育5-45分钟。

在步骤6反应后加入20-100pmol5‘接头引物，如seqidno：9或者seqidno：10；1-5pmolatp；2-10单位t4rna连接酶，thermofisher；5-50pmoltrishcl；1-10pmolmgcl2；0.1-2pmoldtt。37℃孵育20-60分钟。

在步骤7反应后加入100-500pmoltris-hcl；200-1500pmolkcl；20-100pmoldtt；1-10pmoldntp；2-5单位重组rna消化酶抑制酶；50-500单位反转录酶，thermofisher，进行反转录。第一步42℃孵育20-75分钟。第二步75℃孵育5-30分钟。

在步骤8反应后加入0.01-1单位rnasea，thermofisher；0.01-2单位rnaset1，thermofisher；10-200pmoltris-hcl，37℃孵育5-60分钟。

在步骤9反应后加入10-200pmolmgcl2；1-50单位dna聚合酶；1-20pmoldntp；0.01-2pmol扩增引物，可以包括正向扩增引物和反向扩增引物，例如可以分别为seqidno：3和seqidno：4。将混合液置于扩增仪中进行扩增反应，扩增程序为：

在步骤10反应结束后，吸出1-5μl原反应液置于新的试管中，再加入10-100pmolmgcl2；0.1-10单位dna聚合酶；1-20pmoldntp；0.001-2pmol扩增引物。将混合液置于扩增仪中进行扩增反应，扩增程序为：

扩增产物按照常规方法进行纯化，之后进行二代测序以鉴定培养液中含有的小分子rna的种类及表达量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.本发明检测方法示意图。

图2.mir-372的表达量为55rpm。

图3.mir-515的表达量为66rpm。

图4.mir-603的表达量为82rpm。

图5.mir-191的表达量为76rpm。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中如无特别说明，所用试剂和实验仪器和方法如下所述：

细胞培养：可以采用常规细胞培养的方法。囊胚培养的方法是通过单精子注射方法获得受精卵，将其培养至第3天卵裂球期之后转移至新制备的囊胚培养液中进行囊胚培养。

主要试剂、耗材：rna消化酶抑制酶，takara或者neb公司；dnasei，neb；t4rna连接酶2，truncatedkq，neb公司；lambda外切酶，neb公司；脱腺苷化酶，neb；t4rna连接酶，thermofisher公司或者neb公司；反转录酶，thermofisher；rnasea，thermofisher公司；rnaset1，thermofisher公司；dna聚合酶，neb公司。

主要仪器：离心机，eppendorf5424r，pcr热循环仪，eppendorfnexusgx2

illuminanovaseq6000等。

说明书提及的试剂、设备或服务均可从商业途径购买。

实施例1

本发明方法参见图1：

胚胎培养液的获得：通过单精子法获得受精卵，在形成囊胚期前培养24小时的培养液吸出9μl，作为检测的起始材料；

在9μl培养液中加入3μl裂解液(0.15％tritonx-100,3单位重组rna消化酶抑制酶，takara)

在步骤2反应后加入0.5μl(0.05单位)dnasei，neb；0.5μl(20pmol)tris-hcl，37度孵育20min。

在步骤3反应后加入2μl5.8s核糖体rna抑制引物(4pmol)，如seqidno：1或者seqidno：6，引物3‘端可含或者不含teg间臂的生物素修饰，72℃孵育30分钟。

在步骤4反应后加入0.2μl(20pmol)3‘接头引物，如seqidno：2，其序列为5’atctaattctcgnnnnnnatgc3‘，或者seqidno：7，引物5‘端为腺苷酰化修饰，3’端为双脱氧胞苷修饰；0.15μlpeg8000；0.25μl(50单位)t4rna连接酶2，truncatedkq，neb；0.4μl(80pmol)tris-hcl；0.6μl(15pmol)mgcl2；0.3μl(2pmol)dtt；0.1μl(4单位)重组rna消化酶抑制酶，takara。第一步30℃孵育4小时。第二步4℃孵育12小时。

在步骤5反应后加入2.2μl(220pmol)反转录引物，如seqidno：8，其序列为5‘biotin-gcatnnnnnncgagaattagra3‘，引物5’端含有生物素修饰；0.6μl(3单位)lambda外切酶，neb；0.2μl(10单位)脱腺苷化酶，neb。第一步30℃孵育15分钟。第二步37℃孵育30分钟。

在步骤6反应后加入0.5μl(50pmol)5‘接头引物，seqidno：9或者seqidno：10，引物5’端含有氨基修饰；0.2μl(2pmol)atp；0.5μl(5单位)t4rna连接酶，thermofisher；0.2μl(20pmol)trishcl；0.4μl(4pmol)mgcl2；0.4μl(0.4pmol)dtt。37℃孵育60分钟。

在步骤7反应后加入2μl(200pmol)tris-hcl；2μl(800pmol)kcl；1μl(50pmol)dtt；0.9μl(3pmol)dntp；0.1μl(4单位)重组rna消化酶抑制酶；1μl(200单位)反转录酶，thermofisher，进行反转录。第一步42℃孵育60分钟。第二步75℃孵育15分钟。

在步骤8反应后加入0.5μl(0.05单位)rnasea，thermofisher；0.5μl(0.05单位)rnaset1，thermofisher；50pmoltris-hcl，37℃孵育30分钟。

在步骤9反应后加入10μl(50pmol)mgcl2；0.5μl(1单位)dna聚合酶，thermofisher；16μl(16pmol)dntp；8μl(0.08pmol)正向扩增引物。将混合液置于扩增仪中进行扩增反应，扩增程序为：

在步骤10反应结束后，吸出2μl原反应液置于新的试管中，再加入10μl(50pmol)mgcl2；0.25μl(0.5单位)dna聚合酶，thermofisher；10μl(20pmol)dntp；2.5μl(0.05pmol)反向扩增引物；0.5μl(0.005pmol)正向扩增引物。将混合液置于扩增仪中进行扩增反应，扩增程序为：

扩增产物按照常规方法进行纯化，之后进行二代测序以鉴定培养液中含有的小分子rna的种类及表达量。

扩增产物使用zymoresearch文库纯化试剂盒或者neb文库纯化试剂盒进行纯化，之后在illuminanovaseq测序仪上机利用pe150策略进行二代测序以鉴定培养液中含有的小分子rna的种类及表达量。

常规rna提取检测方法：提供细胞培养液样本，加入裂解液和rna消化酶抑制剂，加入核糖体rna抑制引物；加入3’接头引物和rna连接酶，加入反转录引物，加入5’接头引物和rna连接酶，反转录引物进行反转录，随后进行pcr。

实验结果：

通过二代测序的数据分析，该实验方法检测到了培养液中95种小分子rna的含量及表达量，包括各种小分子rna如mirna，sirna，piwirna，pirna，snorna，scarna，sdrna，tsrna等。以下为检测到的小分子rna的示例，如mir-372、mir-515、mir-603和mir-191。而未采用本发明的方法无法检测到相应rna。而采用常规rna提取检测方法或者单细胞rna提取检测方法，仅检测到培养液中5种小分子rna的含量及表达量，未检测到mir-372、mir-515、mir-603和mir-191。

mir-372优化后的表达量为55rpm优化前检测不到，参见图2。mir-515优化后的表达量为66rpm优化前检测不到，参见图3。mir-603优化后的表达量为82rpm优化前检测不到，参见图4。mir-191优化后的表达量为76rpm优化前检测不到，参见图5。

本发明中所用序列如下表所示：

注：“n”指任一碱基，teg-biotin指间臂生物素。nh2指氨基修饰。rapp指腺苷酰化修饰。ddc指双脱氧胞苷修饰。biotin指生物素修饰。“r”指核糖核酸修饰。nh2c6指c6位的氨基修饰。“h”指a或c或t碱基。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>顶探科技（北京）有限公司

<120>一种利用哺乳动物胚胎培养液检测小rna的方法

<130>p2018-0613

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>76

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>5.8s核糖体rna抑制引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(57)..(76)

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atcggcaagcgacgctcagacaggcgtagccccgggaggaacccggggccgcaagtnnnn60

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>3‘接头引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(18)

<223>nisa,c,g,toru

<400>2

atctaattctcgnnnnnnatgc22

<210>3

<211>52

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向扩增引物

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<211>63

<212>dna

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<223>反向扩增引物

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<212>dna

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<220>

<223>5.8s核糖体rna抑制引物

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atcggcaagcgacgctcagacaggcgtagccccgggaggaacccggggccgcaagtgcgt60

tcgaagtgtcgatgat76