检测抗小麦白粉病Pm57基因的通用分子标记、引物、检测方法及应用与流程

本发明属于小麦基因检测技术领域，具体涉及一种检测抗小麦白粉病Pm57基因的通用分子标记、引物、检测方法及应用。

背景技术：

Pm57基因是我们从西尔斯山羊草(Aegilops searsii,2n＝2x＝14,S^SS^S)转移到普通小麦的一个抗白粉病新基因，可有效预防小麦白粉病的发生，在小麦育种领域具有广泛的应用前景。因此，研究Pm57基因的功能与应用具有重要的生物学意义。Pm57基因位于西尔斯山羊草2S^S#1染色体长臂近端部，小麦-西尔斯山羊草染色体2S^S#1添加系2011-400和易位系89(6)88、89(5)69、89-346所具有的2S^S片段上都含有抗白粉病Pm57基因。

但是由于每个小麦品种的基因型不同，目前尚没有能够同时检测小麦-西尔斯山羊草染色体2S^S#1添加系2011-400和易位系89(6)88、89(5)69、89-346这几种材料所含Pm57基因的通用分子标记的报导。虽然现有技术中已有与Pm57基因连锁的分子标记X2L4g9p4/HaeIII，但开发X2L4g9p4/HaeIII标记的全长cDNA(AK331687)位于小麦第二同源群长臂的FL0.86-0.91之间，该分子标记不能检测89(6)88抗病材料所携带的Pm57基因，不具有通用性，在分子标记辅助选择方面应用有限。因此，研发一种能够同时检测出小麦-西尔斯山羊草染色体2S^S#1添加系2011-400和易位系89(6)88、89(5)69、89-346这几种材料所含Pm57基因的通用分子标记尤为必要。

技术实现要素：

本发明提供的一种检测抗小麦白粉病Pm57基因的通用分子标记、引物、检测方法及应用，该通用分子标记能够同时检测出小麦-西尔斯山羊草染色体2S^S#1添加系2011-400和易位系89(6)88、89(5)69、89-346这几种材料所含Pm57基因，检测效率高，降低了工作繁琐度。

本发明的第一个目的是提供一种检测抗小麦白粉病Pm57基因的通用分子标记，所述通用分子标记为分子标记X185442，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种用于扩增所述通用分子标记的引物，所述引物的序列为：

上游引物185442F：5’-GCACGGTGGGTGTGTTCC-3’

下游引物185442R：5’-CTCACTATGATGTGTGAGGTTCTT-3’。

本发明的第三个目的是提供一种利用所述引物检测抗小麦白粉病Pm57基因的方法，具体包括以下步骤：

S1，提取待检测小麦的基因组DNA；

S2，以所述小麦的基因组DNA为模板，以上游引物185442F和下游引物185442R为引物进行PCR扩增；

S3，琼脂糖凝胶电泳检测：用1×TAE缓冲液和琼脂糖配制浓度为3.0％的琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭至溴化乙锭终浓度为0.5μg/ml，在额定电压150V下电泳70min，后用紫外光透射仪记录观察电泳结果；如果检测到210bp的扩增条带，则说明待测小麦的基因组DNA中含有特异分子标记X185442，且含有抗小麦白粉病Pm57基因；如果检测不到210bp的扩增条带，则说明待测小麦的基因组DNA中不含特异分子标记X185442，不含抗小麦白粉病Pm57基因。

优选的，利用所述引物检测抗小麦白粉病Pm57基因的方法中，所述PCR扩增使用的反应体系为：

基因组DNA 2μL，上游引物185442F 1.5μL，下游引物185442R 1.5μL，2×Es Tap Master Mix 7.5μL，ddH2O 2.5μL；总体积15μL；上游引物185442F和下游引物185442R的浓度均为5μM；

所述PCR扩增使用的反应条件为：

94℃ 10min；

降落10个循环：

94℃ 20s

63℃→58.5℃ 20s，每个循环减0.5℃

72℃ 2min

继续补充的35个循环：

94℃ 20s

58℃ 20s

72℃ 2min

终延伸：

72℃ 10min

16℃ forever。

本发明的第四个目的是提供一种所述的通用分子标记在检测抗小麦白粉病Pm57基因或者在培育抗小麦白粉病小麦品种中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种所述的引物在检测抗小麦白粉病Pm57基因或者在培育抗小麦白粉病小麦品种中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种检测抗小麦白粉病Pm57基因的通用分子标记、引物、检测方法及应用，具有以下有益效果：

本发明提供的通用分子标记X185442能够同时检测出小麦-西尔斯山羊草染色体2S^S#1添加系2011-400和易位系89(6)88、89(5)69、89-346这几种材料所含Pm57基因，是通用性高的特异性分子标记，检测效率高，降低了工作繁琐度。同时我们对分子标记X185442的PCR扩增体系进行优化，获得了与该分子标记X185442配套的高效的PCR体系及检测方法，在抗小麦白粉病小麦品种中也具有良好的应用前景。

附图说明

图1为comp185442_c0基因在URGI数据库进行基因序列BLAST比对图；

图2为对携带Pm57基因的材料和无Pm57基因的中国春材料进行PCR的结果图；

其中M为marker，1至5号泳道分别为中国春、2011-400、89(6)88、89(5)69和89-346；

图3为2011-400、89(6)88、89(5)69、89-346和22个国内小麦品种PCR扩增结果图；

其中1-26号泳道分别为2011-400、89(6)88、89(5)69、89-346、中国春、西农979、繁6、平安602、平安0518、贵农22、郑州366、宁麦9号、网93、苏夫、杨麦5号、杨麦16、杨麦17、杨麦23、杨麦13、镇02168、南农0686、南农9918、苏麦3号、望水白、杨麦14、偃展4110。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了一种检测抗小麦白粉病Pm57基因的通用分子标记，所述通用分子标记为分子标记X185442，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：

AGAGGTGTTCGATGTGGAGCTCGTAGGACGGGAGCAGAAGGATGGCGAAGAGAGCATGGTGATATTTCTGCAGCTCGCCGTAGACTGTTGCAGTCAAGA其中，前段的斜体加下划线部分为上游引物185442F结合位置，后段的斜体加下划线部分为下游引物185442R结合位置。

上述分子标记X185442获得方式如下：

以抗病材料2011-400和易位系89(6)88、89(5)69、89-346(这些材料名称参见Homoeologous recombination-based transfer and molecular cytogenetic mapping of powdery mildew-resistant gene Pm57from Aegilops searsii into wheat，W Liu.et al，Theoretical&Applied Genetics，2017，130(4)：841-848)当阳性对照，用不含抗白粉病Pm57基因的感病品种中国春(CS)当阴性对照，在一叶一心苗期接种白粉病混合菌种，在接种白粉病0h、12h、24h、48h时分别取叶片进行RNA-Seq De novo测序；从转录组中发现comp185442_c0基因(comp185442_c0基因是Pm57基因的候选基因，根据comp185442_c0基因获得的分子标记可作为Pm57基因的诊断型分子标记)在中国春中表达量(rpkm)为0，但在2011-400、89(6)88、89(5)69、89-346四种材料都表达；将comp185442_c0基因在URGI数据库进行基因序列BLAST比对，发现该基因序列与小麦2BL上的一段序列类似，但只有86％一致性，结果参见图1。在comp185442_c0与2BL序列差异碱基位点设计序列特异的上下游引物(185442F，185442R)，并交由公司进行引物合成；利用合成的引物，用上述五种小麦的基因组DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增出在2011-400、89(6)88、89(5)69、89-346四种材料都有的210bp大小的扩增条带，但在中国春无对应扩增条带，结果见图2，其中M为marker，1至5号泳道分别为中国春、2011-400、89(6)88、89(5)69和89-346，图2中白色小箭头所指为Pm57基因特异分子标记X185442的210bp条带，该PCR产物即为Pm57的特异分子标记X185442。

基于同一种发明构思，本发明还提供了一种用于扩增所述通用分子标记的引物所述引物的序列为：

上游引物185442F：5’-GCACGGTGGGTGTGTTCC-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示

下游引物185442R：5’-CTCACTATGATGTGTGAGGTTCTT-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

为了验证上述分子标记、引物及检测方法的可行性，我们用携带Pm57基因的材料2011-400、89(6)88、89(5)69、89-346和22个国内小麦品种进行PCR扩增，验证特异分子标记X185442的适用性。本发明还提供的利用所述引物(上游引物185442F和下游引物185442R)检测抗小麦白粉病Pm57基因的方法，具体包括以下步骤：

S1，提取待检测小麦的基因组DNA，本发明实施例采用CTAB法；

S2，以所述小麦的基因组DNA为模板，以上游引物185442F和下游引物185442R为引物进行PCR扩增；

所述PCR扩增使用的反应体系为：

基因组DNA 2μL，上游引物185442F 1.5μL，下游引物185442R 1.5μL，2×Es Tap Master Mix(康为世纪)7.5μL，ddH2O 2.5μL；总体积15μL；上游引物185442F和下游引物185442R的浓度均为5μM；

所述PCR扩增使用的反应条件为：

94℃ 10min；

降落10个循环：

94℃ 20s

63℃→58.5℃ 20s，每个循环减0.5℃

72℃ 2min

继续补充的35个循环：

94℃ 20s

58℃ 20s

72℃ 2min

终延伸：

72℃ 10min

16℃ forever。

S3，琼脂糖凝胶电泳检测：用1×TAE缓冲液和低电渗高纯度的琼脂糖配制浓度为3.0％的琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭(EB)至溴化乙锭终浓度为0.5μg/ml，在额定电压150V下电泳70min，后用紫外光透射仪记录观察电泳结果；如果检测到210bp的扩增条带，则说明待测小麦的基因组DNA中含有特异分子标记X185442，且含有抗小麦白粉病Pm57基因；如果检测不到210bp的扩增条带，则说明待测小麦的基因组DNA中不含特异分子标记X185442，不含抗小麦白粉病Pm57基因。

2011-400、89(6)88、89(5)69、89-346和22个国内小麦品种PCR扩增结果如图3所示，其中1-26号泳道分别为2011-400、89(6)88、89(5)69、89-346、中国春、西农979、繁6、平安602、平安0518、贵农22、郑州366、宁麦9号、网93、苏夫、杨麦5号、杨麦16、杨麦17、杨麦23、杨麦13、镇02168、南农0686、南农9918、苏麦3号、望水白、杨麦14、偃展4110只有2011-400、89(6)88、89(5)69、89-346四种携带Pm57基因的材料能够扩增出来210bp的特异条带，而其它22个小麦品种小麦都无对应扩增条带。证实分子标记X185442能够同时对含有Pm57基因的材料进行Pm57基因检测，并且在其他小麦品种中没有该标记产生，确定该标记为Pm57基因的通用诊断型特异分子标记。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120> 检测抗小麦白粉病Pm57基因的通用分子标记、引物、检测方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 216

<212> DNA

<213> 小麦

<400> 1

gatttggcac ggtgggtgtg ttccgttgta cgtgaggagt ggacggcaga ggtgttcgat 60

gtggagctcg taggacggga gcagaaggat ggcgaagaga gcatggtgat atttctgcag 120

ctcgccgtag actgttgcag tcaagatgcc gacaggaggc catcaatgtc tgaagtcgtg 180

atgcagatcg agaagaacct cacacatcat agtgag 216

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcacggtggg tgtgttcc 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcactatga tgtgtgaggt tctt 24