本发明涉及基质金属蛋白酶-9多肽抑制剂及其应用，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶-9、具有抑制细胞侵袭，抑制肿瘤转移功能的多肽。
背景技术：
近年我国肿瘤的发病率和病死率不断增长。无限制生长、侵袭和转移是肿瘤的恶性标志和特征，也是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此，控制肿瘤的生长、侵袭和转移是改善预后，提高生存率的主要措施。肿瘤的转移(metastasis)是肿瘤引起死亡的主要原因之一。肿瘤转移是肿瘤细胞从原发灶向远处组织形成转移灶，它是高度恶性肿瘤的一个重要特征，肿瘤细胞与其生存的宿主组织基质的外环境的平衡性是肿瘤转移的关键因素。在参与肿瘤细胞的侵袭转移调控过程中，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，mmps)扮演了重要的角色，因为它们直接参与了肿瘤细胞与周围基质细胞和基质成份之间的酶解作用，从而导致肿瘤细胞的侵袭和迁移。
研究表明，人癌组织中mmps的表达量及活化程度都远高于正常组织，mmps可作为肿瘤标志物，通过对其抑制可在很大程度上实现对恶性肿瘤的治疗。鉴于mmps在肿瘤的转移进程中起着关键性的作用，对于mmps的治疗的研究开发是十分必要的。
基质金属蛋白酶是一组由20几种结构相似和功能相关的蛋白内切酶组成。它们可以发挥正常的生理功能，例如卵细胞着床，骨骼生长和器官发育等；这些酶还可以在诸如炎症、伤口愈合和肿瘤细胞转移中发挥病理作用。基质金属蛋白酶被看作是这些病理过程的调节因子。在基质金属蛋白酶家族中有两种明胶酶，其中，明胶酶a/基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2，mmp-2)可在多数组织细胞中恒定表达，以维持组织细胞的基本功能；而明胶酶b/基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，mmp-9)在tnf-a，il-6等的细胞外因素的作用下大量诱导表达。表达出胞外的基质金属蛋白酶9的酶活力又可以通过酶原的激活以及活性酶的抑制作用调节。
细胞外基质(extracellularma-tric，ecm)主要由间质胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、硫肝素蛋白多糖等组成，因mmps是目前已知的间质胶原蛋白唯一的基质降解酶，而且能降解除多糖外ecm的所有成分，故在涉及ecm降解的肿瘤细胞的增殖分化、肿瘤的侵袭转移、凋亡等生理活动中，mmps均发挥着重要作用。
肿瘤侵袭、转移时，肿瘤细胞首先与ecm表面的整合素受体及非整合素受体结合进而破坏ecm和基底膜(basementmembrane，bm)，穿过ecm缺损处侵入间质；瘤细胞在间质中移行并接触局部淋巴系统脉管及毛细血管，突破血管及其下bm进入血流；随血流及淋巴在远端部位突破毛细管结构进入组织并在组织中存活、增殖，形成新的转移灶。
ecm和bm为肿瘤细胞的恶性增殖提供微环境，并可调节肿瘤细胞的基因表达。ecm和bm由基本骨架iv型胶原蛋白及其他蛋白、多糖类成分组成，并处在持续代谢和重塑的动态平衡中。所以，肿瘤必须通过多次降解ecm和bm来破坏这种动态平衡来实现侵袭和转移。不同的ecm成分由不同的mmps降解，mmp-2和mmp-9是到目前发现的唯一能够降解iv型胶原的基质蛋白酶。
研究表明，mmp-9可使血胶原蛋白原降解为抗肿瘤的血管抑制素及类似片段，而只有活化的mmp-2才能诱导反应的进行。这表明mmp-2能活化ecm结构蛋白的潜在活性，在肿瘤细胞侵袭转移中具有重要作用。mmp-2能促进血管生成表型的转变，mmp-9能激活血管的生成，这两者是内皮细胞形成新生血管的先决条件。另外，mmp-2和mmp-9还能通过对其他细胞或血管因子的作用促进新生血管的生成。
有实验尝试抑制转移灶的mmp-9表达，结果发现其生长减缓，这表明mmps能产生生长启动信号。由此可见，mmps的活性与肿瘤细胞的增殖正相关。
表面存在特异性抗原的癌细胞，能被免疫活性细胞有效地识别并攻击，另一方面，癌细胞可利用mmps对细胞毒性t细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞的调节来逃避免疫监视，实现炎性侵润。mmps可通过激活转化生长因子β显著抑制t细胞对肿瘤的免疫应答。mmps还可作用于趋化因子，双向调节免疫细胞白细胞的生成。
综上所述，mmps参与ecm的降解、新血管生成、肿瘤细胞的生长和凋亡等重要过程，在肿瘤侵袭、转移的复杂过程中起了关键性的作用，这就使其抑制剂timp在肿瘤治疗中的地位显得举足轻重。当今的研究主要集中在合成的mmps抑制剂在肿瘤治疗中的应用，随着研究的深入，mmps在肿瘤中的作用将会得到新的认识，利用mmps的生理性质治疗癌症也将取得新突破。
基质金属蛋白酶9的抑制剂包括大分子和小分子。大分子抑制剂的制备和使用限制了它们的发展，例如重组人基质金属蛋白酶组织抑制因子3的体内半衰期只有4分钟。很多成功的小分子抑制剂，例如marimastat，可以在纳摩尔水平上抑制基质金属蛋白酶的活力。
本发明通过化学方法合成了多肽抑制剂。这三条多肽抑制剂可以选择性的抑制基质金属蛋白酶9，在用肿瘤细胞的侵袭实验检测多肽抑制剂体外活力的实验中，多肽抑制剂能够通过抑制基质金属蛋白酶9酶活性，从而抑制不同肿瘤细胞系的转移侵袭。
目前，国际上开发出的多种基质金属蛋白酶抑制剂已进入临床试验，本专利中的多肽抑制剂已证明在肿瘤增殖和侵袭及炎症反应中有效，具有开发的前景。
技术实现要素：
发明目的
本发明提供全新的序列，这些序列均为基质金属蛋白酶9抑制剂，治疗炎症和抑制肿瘤增殖和转移侵袭具有很好的疗效。多肽i、多肽ii、多肽iii均为全新的多肽序列，其特征在于所述多肽序列均为全新的序列。
以前发明的基质金属蛋白酶抑制剂的多肽序列中常含有半胱氨酸，容易氧化生成二聚体，降低或失去抑制活性，稳定性差；而本发明提供的多肽抑制剂序列中不包含有半胱氨酸，稳定性明显优于以前发明的基质金属蛋白酶多肽抑制剂。
所述的多肽序列，其特征在于所述的多肽序列在制备以抑制基质金属蛋白酶9从而治疗炎症和抑制肿瘤的增殖和侵袭转移药物中的应用。
本发明所述的肿瘤，可以为胃癌，肺癌，肝癌，肠癌，白血病，乳腺癌，神经胶质瘤，淋巴癌等癌症。
本发明所述的炎症，可以为关节炎，类风湿关节炎，牙周炎等炎症。
具体来说：
多肽i：proargtrpphe(d-bip)(d-arg)glyglu(bip是二苯基丙氨酸)；
多肽ii：proarghisgly(d-his)(d-bip)(d-arg)glyglu(bip是二苯基丙氨酸)；
多肽iii：proargtyrhisgly(d-his)(d-bip)(d-arg)glyglu(bip是二苯基丙氨酸)。
有益效果
利用固相合成法化学合成基质金属蛋白酶9多肽抑制剂，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制基质金属蛋白酶9。在肿瘤细胞侵袭实验中抑制了相关肿瘤细胞的侵袭。在肿瘤侵袭转移中，肿瘤细胞释放大量基质金属蛋白酶，其中基质金属蛋白酶9，可以切割并破坏机体组织，造成损伤。我们发现的多肽抑制剂可以抑制基质金属蛋白酶9，从而抑制了肿瘤的侵袭转移，保护机体并延长肿瘤患者的生存期。
附图说明
附图1基质金属蛋白酶9切割多肽产生荧光的动力学曲线。
附图2多肽抑制剂对基质金属蛋白酶9的抑制曲线。
附图3多肽抑制剂对肿瘤坏死因子释放酶的抑制曲线。
附图4多肽抑制剂对人胃癌细胞(mgc803)侵袭的抑制作用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
一般性说明：
实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都是符合cfda临床研究申报要求的实验方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
本发明的材料：本申请中提及的细胞株、培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
实施例1多肽的化学合成方法
多肽采用固相合成，采用高效液相色谱法纯化，并采用ms测定多肽的分子量，hplc测定多肽的纯度。
(一)方法：多肽用fmoc化学方法合成。合成反应从c端向n端进行，rink介质(可在advancedchemtech公司购得)上有自由氨基，顺序连接g1u，gly，d-arg，d-bip，phe，trp，arg和pro。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的hbtu，hobt，diea和fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/n-甲基咪唑(4∶1∶0.5)的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10min。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的fmoc基团去掉，去fmoc基团使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肽用98％三氟乙酸从介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。
(二)结果测定：应用上述化学条件可合成并获得多肽i、ii和iii，合成的多肽经高效液相色谱hplc进行纯度鉴定，纯度均大于95％，其中，多肽i的纯度鉴定结果为98.40％。
实施例2多肽抑制剂体外对几种靶点酶(基质金属蛋白酶-9及肿瘤坏死因子释放酶)的抑制
(一)方法：
(1)重组人基质金属蛋白酶-9由sf9昆虫细胞表达。酶活力的检测是通过切割荧光产生多肽底物mca-pro-leu-gly-leu-dpa-ala-arg-nh2并检测产生的荧光值实现的(激发波长＝328nm，检测波长＝392nm)。基质金属蛋白酶-9切割底物后荧光值的快速增加，而抑制剂会降低基质金属蛋白酶-9切割底物的活性，荧光值缓慢或不增加。所用的缓冲液为100mmtris/hcl，ph7.4，100mmnacl，10mmcacl2and0.01％tween-20。所有的检测在37℃下100μl反应体系中进行。检测时向反应体系中先加10μl重组人基质金属蛋白酶9(0.92ng/μl)，再加入不同浓度(1μm、5μm、10μm)的多肽抑制剂溶液，最后每孔加入10μl荧光底物。加入之后，快速混匀。在328nm激发波长，392nm发射波长下，用酶标仪检测荧光信号的变化情况。
(2)肿瘤坏死因子释放酶的活力是通过切割荧光产生底物mca-pro-leu-ala-gln-ala-val-dpa-arg-ser-ser-ser-arg-nh检测的(激发波长＝320nm，发射波长＝405nm)。肿瘤坏死因子释放酶切割底物后荧光值的快速增加，而抑制剂会降低肿瘤坏死因子释放酶切割底物的活性，荧光值缓慢或不增加。反应在37℃下100μl反应体系中进行。检测时向反应体系中先加4μl肿瘤坏死因子释放酶(1ng/μl)，再加入不同浓度(1μm、5μm、10μm)的多肽抑制剂溶液，最后每孔加入10μl荧光底物。加入之后，快速混匀。在320nm激发波长，405nm发射波长下，用酶标仪检测荧光信号的变化情况。
(二)结果测定：见图1-3；图1为无多肽抑制剂和多肽抑制剂i、ii和iii对基质金属蛋白酶9的抑制效果。由图2、3分别为多肽抑制剂i、ii和iii对基质金属蛋白酶9和肿瘤坏死因子释放酶的抑制效果图。
(三)结果分析：由图1可知，从分子水平上看，与无多肽抑制剂组相比，多肽抑制剂i、ii和iii对基质金属蛋白酶9均有明显的抑制作用。由图2、3可知，多肽抑制剂i、ii和iii对基质金属蛋白酶9和肿瘤坏死因子释放酶的均有一定的抑制效果。
实施例3mmp抑制性多肽对人胃癌细胞(mgc803)的侵袭抑制试验
(一)方法：
(a)将10mg/mlmatrigel(bd公司，usa)用dmem培养基以1∶2稀释，涂布于transwell小室膜上，室温风干。
(b)将培养到对数生长期的mgc803细胞消化，收集，计数，将细胞浓度调整到1×105个/ml。
(c)将细胞接种到transwell小室中，每孔100μl，并且将各组试验用液(多肽i-iii)加入小室中。24孔板中加入0.6ml含5％胎牛血清的细胞培养液刺激细胞迁移，于5％co2，37℃培养24h。
(d)弃去孔中培液，细胞固定，染色，清水漂净，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。
按照公式计算迁移抑制率(migrationinhibition，mi)：
mi(％)＝1-ntest/ncontrol×100％
其中ntest时为测试组的细胞迁移数，ncontrol为空白对照组的细胞迁数。
(二)结果测定：
表1.mmp抑制剂多肽对人胃癌细胞(mgc803)侵袭抑制作用
表1a：*p＜0.05，**p＜0.01.
见图4，其中图中多肽ii对人胃癌细胞(mgc803)细胞侵袭的实验结果图。其中，多肽0μg/ml为阴性对照组，其他组为不同药物浓度的实验组，与对照组相比，1.56μg/ml实验组可显著地降低其侵袭和迁移能力。
(三)结果分析：
mmp抑制剂多肽i、ii、iii可抑制人胃癌细胞(mgc803)的迁移，在1.5μg/ml剂量下其抑制率分别为67.80％、47.45％、45.58％，多肽i、ii和iii均在该剂量下的细胞侵袭数与对照组比有显著性差异：即该多肽i、ii和iii可通过抑制基质金属蛋白酶9的活性，从而抑制肿瘤细胞的细胞侵袭和转移能力。