本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与动脉粥样硬化和老年性痴呆病有关的apoe基因型别的引物和方法。
背景技术：
载脂蛋白e(apolipoproteine，apoe)为299个氨基酸的蛋白质，分子量34kda。是一种主要的胆固醇载体，有支持脂质转运和修复脑损伤的功能。apoe基因位于19号染色体长臂上，全长约3.7kb，有4个外显子，第4外显子表现出基因多态性，使apoe基因有e2、e3、e43种等位基因，可组合产生6种基因型：三种纯合子(e2/2、e3/3、e4/4)和三种杂合子(e3/2、e4/2、e4/3)。apoe基因具有异构体特异性，即不同基因编码的蛋白质功能具有差异性，从而导致不同蛋白质对脂质的代谢能力不同、抗氧化及抗炎症能力不同。apoe的氨基酸序列的第112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(arg)和半胱氨酸(cys)的变异决定了其基因型别。apoe4在这两个位置上都是arg；apoe2都是cys；112位为cys和158位是arg者为apoe3。自然人群中，基因频率e3分布最高，apoe3/3表型分布占比约70％。
阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是一种起病隐匿的进行性发展的致死性神经系统退行性疾病。病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。在美国所有死亡的人群中排第六，估计65岁以上的人大约13％，85岁以上的大约45％有ad。因此，探讨ad发病的危险因素对易感人群的早发现、预防和控制有重要意义。
在过去的数十年中，研究发现，apoe基因型别与ad的发病有关，apoe基因型别是ad发病风险的主要遗传决定因素。一般认为apoee2为保护性因素而apoee4为危险性因素。
冠心病(coronaryatheroscleroticheartdisease，chd)是全球范围内最常见的死亡原因，ldl-c水平升高是chd的最重要的病因。有效降低ldl-c水平可以阻止动脉粥样硬化进展，从而降低chd的发病率及死亡率。他汀类药物是目前最有效的降低血浆ldl-c水平从而降低心血管疾病风险的药物。研究表明，他汀类药物的药动学存在显著的个体差异，且这种差异可能对他汀类药物的疗效及不良反应的发生产生影响。这种差异与apoe基因型别也有密切关系。apoe2的作用是降低胆固醇浓度，对冠状动脉硬化的发展有一定的防护作用，而apoe4则会使血浆ldl-c、tc浓度升高，易诱发chd。
apoe基因型别还与动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)的早期发生及发展密切相关。大量人群调查发现apoee4可以显著地升高健康人的总胆固醇浓度，使之易患动脉粥样硬化，相反，apoee2能降低胆固醇浓度。
对apoe基因型别的检测可以帮助患者疾病的诊断和指导个体化用药，提高患者的预后水平。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测apoe基因型别的引物，采用pcr技术，可用于快速检测动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病和老年性痴呆病患者体内apoe基因型别。所述检测apoe基因型别的引物，包括：
apoe-exon4-f：aacaactgaccccggtggcg
apoe-exon4-r：acctgctccttcacctcgtc
还包括测序引物，其碱基序列为：
测序引物1：aacaactgaccccggtggcg
测序引物2：acctgctccttcacctcgtc
本发明提供了检测apoe基因型别的方法，包括以下步骤：
1.抽提外周血中的基因组dna；
2.用pcr扩增步骤1中提取的dna；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定apoe基因型别：
本发明还提供了一种检测apoe基因型别的试剂盒，包括全血基因组dna抽提试剂、检测体系pcr反应液和测序体系试剂；扩增引物序列为：
apoe-exon4-f：aacaactgaccccggtggcg
apoe-exon4-r：acctgctccttcacctcgtc。
其中用于pcr的反应体系为：总体积20ul，2*pcrbuffer10ul，dntp(2mm)4ul，apoe-exon4-f(10um)0.5ul，apoe-exon4-r(10um)0.5ul，kodfx(1u/ul)0.4ul，templatedna1ul，ddh2o3.6ul。
所述试剂盒用于pcr的反应体系中templatedna最低浓度为10ng/μl。
所述试剂盒用于pcr的反应条件为：
有益效果：由于apoe多态性具有生物学重要性，对apoe多态性的研究是目前医学的热门话题。apoe基因型别的检测方法很多，多年来先后采用等电聚焦电泳和基因分析术进行检测。而本方法简便，成本低，效果好。只需要一对引物就能判定apoe基因型别。而且相较其他方法而言对结果的判定比较简单。易于推广。
附图说明
图1为检验一例正常人群外周血apoe基因引物效果的凝胶电泳图，共20个重复，m为markerdl2000，如图1所示，引物扩增有效，且条带单一。
图2为退火温度的优化的电泳图：apoe基因梯度pcr凝胶电泳结果。m为markerdl1000，如图2所示，最适宜的退火温度为69℃。
图3为三个平行样本的模板浓度的优化的电泳图，m为markerdl2000，由上图的电泳结果可知，引物在模板浓度为1ng/μl处出现条带非常暗或无条带，因而最低模板浓度为10ng/μl。(图中的1代表样本1、2代表样本2、3代表样本3)
图4临床样本的apoe基因第112位氨基酸位点一代测序结果，如图4所示，388位碱基位点为t。
图5临床样本的apoe基因第158位氨基酸位点一代测序结果，如图5所示，526位碱基位点为c。
综合图4和图5结果可知apoe基因型别为e3。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1检测apoe基因型别的引物及是结合
一种检测apoe基因型别的引物，该引物的设计是针对apoe第4外显子设计的扩增引物：
apoe-exon4-f：aacaactgaccccggtggcg
apoe-exon4-r：acctgctccttcacctcgtc
测序引物为：
测序引物1：aacaactgaccccggtggcg
测序引物2：acctgctccttcacctcgtc
一种检测apoe基因-型别的试剂盒，包括
(i)全血基因组dna抽提试剂；
(ii)检测体系pcr反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，外周血基因组dna提取可采用天根生物科技有限公司的试剂盒，血液/细胞/组织基因组dna抽提可参照试剂盒(天根生物)的操作流程。
实施例2检测apoe基因型别的方法
检测apoe基因型别的方法，包括以下步骤：
(1)全血基因组dna提取
1)于1.5ml离心管底部加入20μlqiagenprotease(或proteinasek)。.
2)离心管中加入200μl血浆。
3)加入200μlbufferal，振荡15s。(注意：不可将qiagenprotease或proteinasek直接加入到bufferal中。若样本量较大，则qiagenprotease和bufferal按比例增加。)
4)56℃水浴10min，之后短暂离心，以除去离心管盖内沿的液体。
5)加入200μl乙醇(96％-100％)，振荡15s，短暂离心，以去除离心管盖内沿液体。
6)小心将以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到qiaampminispincolumn中(withoutwettingtherim)将离心柱放入2ml收集管中，盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体。
7)小心加入500μlbufferaw1到qiaampminispincolumn中(withoutwettingtherim)。盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体。
8)小心加入500μlbufferaw2到qiaampminispincolumn中(withoutwettingtherim)。盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min。
9)将qiaampminispincolumn置入一支新的2ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体。全速离心1min。
10)将qiaampminispincolumn置入一支洁净1.5ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体。小心在qiaampminispincolumn中加入100μlbufferae或蒸馏水。室温下(15-25℃)静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min。将收集管盖好，保存于-20℃。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份19μl分装：
x＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：在分装好的pcr反应管中加入dna，空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。加样要求如下：
(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：
pcr所用kodfox由toyobo公司提供。引物由上海英潍捷基公司合成。
pcr扩增体系试剂配制方法如下：
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，25min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带单一。
(6)sanger测序：
取9μlpcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将2μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心40min；倒置离心15sec，加入50μl冰冻75％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心20min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhi-di后进行变性试验。变性程序：95℃5min，4℃5min变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与apoe基因参考序列(genbankaccn：ng_007084)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3：临床样本的apoe基因型别检测
取待检的临床组织样本1例，按照实施例1和2中的方法进行apoe基因基因型别分析，结果如表4和5所示。如图4所示，388位碱基位点为t。如图5所示，526位碱基位点为c。综合图4和图5结果可知apoe基因型别为e3。
序列表
<110>南昌艾迪康医学检验实验室有限公司
<120>检测apoe基因型别的引物和方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aacaactgaccccggtggcg20
<210>2
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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acctgctccttcacctcgtc20