本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及一种抑制鸡sox5基因表达的shrna序列及其应用。
背景技术：
：sox基因家族是一类y染色体性别决定区域相关基因构成的基因家族，编码一系列sox家族的转录因子。在人和小鼠上，sox基因家族分为9类，在个体发育过程中广泛参与了早期胚胎和神经发育过程。sox5基因属于soxd基因家族，研究证实其编码的转录因子参与调控软骨形成过程中细胞生长、增殖及分化。但是在鸡中，关于该基因的功能鲜见报道。rnai干扰技术是研究基因功能的重要技术，通过设计靶向目的基因mrna的干扰片段，可以抑制其表达，进而通过细胞表型或其他相关基因的变化，推测基因的功能。短发卡rna(shorthairpinrna，shrna)是可以克隆到表达载体并表达短的干扰rna(sirna，19-21个核苷酸的双链rna)的dna分子，包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，由poliii启动子控制，随后再连上5-6个t作为rna聚合酶iii的转录终止子。通过载体将“短干涉rna”输送入细胞或活体组织中，被细胞机制切割成sirna，由sirna发挥作用达到沉默靶基因表达的作用。慢病毒以其较低的转染条件(可转染分裂和非分裂细胞)和较高的转染效率被广泛应用于基因表达的研究中。随着rna干扰技术的不断深入发展，将设计合成的shrna构建到慢病毒表达系统，进而感染特定的靶细胞，特异性沉默相关基因表达，已经成为研究基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径。shrna慢病毒表达系统有效克服了以往人工合成的sirna转染效率低、持续时间短等不足，已经逐步发展成为在原代细胞及体内研究基因功能的有效途径之一。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提出一种抑制鸡sox5基因表达的shrna序列及其应用，该shrna干扰序列可以有效降低鸡sox5基因的表达量，对于鸡sox5基因的功能研究具有广泛的应用前景。基于上述目的，本发明提供的一种抑制鸡sox5基因表达的shrna序列，包括正义链和反义链，正义链和反义链序列如下所示：sox1312-a正义链：5’-ccggcggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccgtttttg-3’，其为seqidno:1所示；sox1312-b反义链：5’-aattcaaaaacggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccg-3’，其为seqidno:2所示；其中，ctcgag为loop序列。本发明还提供了一种抑制鸡sox5基因表达的shrna序列，包括正义链和反义链，正义链和反义链序列如下所示：sox1635-a正义链：5’-ccgggaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctctttttg-3’，其为seqidno:3所示；sox1635-b反义链：5’-aattcaaaaagaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctc-3’，其为seqidno:4所示；其中，ctcgag为loop序列。本发明还提供了一种抑制鸡sox5基因表达的shrna序列，包括正义链和反义链，正义链和反义链序列如下所示：sox628-a正义链：5’-ccggcaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctgtttttg-3’，其为seqidno:5所示；sox628-b反义链：5’-aattcaaaaacaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctg-3’，其为seqidno:6所示；其中，ctcgag为loop序列。本发明根据genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中鸡sox5基因的mrna序列(nm_001004385)以及shrna的引物设计原则，设计了3条针对鸡sox5基因的干扰序列，非靶向sox5基因表达的对照shrna序列采用普适性阴性对照序列。上述3条针对鸡sox5基因的干扰序列分别命名为：sox1312、sox1635和sox628，这三条干扰序列的信息如下所示：sox1312-a正义链：5’-ccggcggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccgtttttg-3’，其为seqidno:1所示；sox1312-a正义链同时也为sox1312干扰序列所对应的上游引物；sox1312-b反义链：5’-aattcaaaaacggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccg-3’，其为seqidno:2所示；sox1312-b反义链同时也为sox1312干扰序列所对应的下游引物；sox1312-a正义链的5’端添加了ccgg(agei酶切位点)，sox1312-b反义链的5’端添加了aattc(ecori酶切位点)。sox1635-a正义链：5’-ccgggaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctctttttg-3’，其为seqidno:3所示；sox1635-a正义链同时也为sox1635干扰序列所对应的上游引物；sox1635-b反义链：5’-aattcaaaaagaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctc-3’，其为seqidno:4所示；sox1635-b反义链同时也为sox1635干扰序列所对应的下游引物；sox1635-a正义链的5’端添加了ccgg(agei酶切位点)，sox1635-b反义链的5’端添加了aattc(ecori酶切位点)。sox628-a正义链：5’-ccggcaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctgtttttg-3’，其为seqidno:5所示；sox628-a正义链同时也为sox628干扰序列所对应的上游引物；sox628-b反义链：5’-aattcaaaaacaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctg-3’，其为seqidno:6所示；sox628-b反义链同时也为sox628干扰序列所对应的下游引物。sox628-a正义链的5’端添加了ccgg(agei酶切位点)，sox628-b反义链的5’端添加了aattc(ecori酶切位点)。对照shrna序列的信息如下所示：对照-a正义链：5’-ccggttctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaatttttg-3’，其为seqidno:7所示；对照-a正义链同时也为对照shrna所对应的上游引物；对照-b反义链：5’-aattcaaaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaa-3’，其为seqidno:8所示；对照-b反义链同时也为对照shrna所对应的下游引物。本发明将上述设计的干扰序列和对照的shrna引物常规退火后合成双链，得到退火片段；双酶切gv248质粒，将退火片段分别与酶切后的gv248载体连接；将连接产物转化感受态细胞。挑取单菌落进行pcr及测序鉴定，得到了阳性的克隆和质粒。本发明将对照与携带3条干扰基因的工具载体质粒gv248，病毒包装辅助质粒(helper1.0)和病毒包装辅助质粒(helper2.0)分别转染到鸡胚成纤维细胞系中，结果显示：sox628，sox1635和sox1312能够显著降低sox5基因的表达，sox1312的干扰效果最好，使鸡胚成纤维细胞系中sox5基因的表达量降低了90％；sox1635的干扰效果次之，使鸡胚成纤维细胞系中sox5基因的表达量降低了80％；sox628使鸡胚成纤维细胞系中sox5基因的表达量降低了62％。同时，转染了sox1312的鸡胚成纤维细胞系，细胞增殖在转染后24h有显著停滞。以上结果显示本发明所设计的sox628，sox1635和sox1312能够有效抑制鸡sox5基因的表达。因此，本发明还提供了所述的shrna序列在抑制鸡sox5基因表达中的应用。另一方面，本发明还提供了一种慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体含有所述的抑制鸡sox5基因表达的shrna序列。进一步的，本发明还提供了所述的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别合成抑制鸡sox5基因表达的shrna序列的正义链和反义链；(2)将正义链和反义链序列混合进行退火，以形成带有粘性末端的双链dna；(3)将慢病毒载体双酶切后，得到线性化的慢病毒载体；(4)将步骤(2)中的双链dna和步骤(3)中的线性化的慢病毒载体进行连接，转入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有抗生素的平板上，挑取平板上的单克隆进行测序验证，构建得到慢病毒表达载体。在本发明的一些实施例中，所述慢病毒载体为gv248载体。更进一步的，本发明还提供了所述的慢病毒表达载体在抑制鸡sox5基因表达中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首次报道了抑制鸡sox5基因表达的shrna序列，并构建了相应的shrna慢病毒表达载体。本发明的三种shrna序列(分别为sox628，sox1635和sox1312)均可有效降低鸡sox5基因的表达量，在基因水平的抑制效率分别为62％、80％和90％。将所述抑制鸡sox5基因表达的shrna构建于慢病毒载体上，适用于体内及体外研究。同时，对于深入研究鸡sox5基因的功能等具有重要的科学意义及应用前景。附图说明图1为本发明实施例中gv248载体图谱；图2为载体酶切电泳图谱，其中，1﹟：gv112vector，2﹟：经过ageⅰ和ecorⅰ酶切的gv112vector，3﹟：1kbdnaladder(条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)；图3为phelper1.0载体图谱；图4为phelper2.0载体图谱；图5为慢病毒包装载体转染鸡胚成纤维细胞系；其中，图5a为鸡胚成纤维细胞系转染慢病毒包装载体，图5b为鸡胚成纤维细胞系为转染任何慢病毒；图6为转染表达干扰序列的慢病毒72小时后鸡胚成纤维细胞系中sox5基因表达情况；图7为转染了sox1312序列的鸡胚成纤维细胞系的增殖情况。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并结合附图，对本发明进一步详细说明。实施例1rnai慢病毒克隆的制备(1)设计针对genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中鸡sox5基因序列信息(nm_001004385)，设计三个干扰序列，序列信息如表1所示。表1name5’stemloopstem3’sox628ccggcaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctgtttttgsox1635ccgggaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctctttttgsox1312ccggcggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccgtttttg对照ccggttctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaatttttg(2)利用限制性内切酶消化获得线性化载体目的慢病毒载体的载体名称：gv248，其载体图谱如图1所示。根据如下表2，配制50μl酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3个小时或者过夜，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图2，回收目的条带。表2试剂体积(μl)ddh2o4110×cutsmartbuffer5纯化的质粒dna(1μg/μl)2agei(10u/μl)1ecori1合计50(3)病毒载体构建框架表3根据已选靶点序列设计shrna干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。在正义链的5’端添加了ccgg(agei酶切位点)，在反义链的5’端添加了aattc(ecori酶切位点)，g：酶切位点互补序列。除此之外，在正义链的3’端添加ttttt终止信号，在反义链的5’端添加终止信号互补序列。(4)合成单链条引物表4no.sequence(5’-3’)sox628-accggcaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctgtttttgsox628-baattcaaaaacaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctgsox1635-accgggaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctctttttgsox1635-baattcaaaaagaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctcsox1312-accggcggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccgtttttgsox1312-baattcaaaaacggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccg对照-accggttctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaatttttg对照-baattcaaaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaa(5)引物退火形成双链dna合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温，配对结果如表4所示。该引物退火后形成带有粘性末端的双链dna，带有粘性末端的双链dna与线性化克隆载体两末端含有相同的酶切位点。(6)退火产物与载体进行连接通过t4dnaligase将双酶切线性化的载体和退火双链dna连接，16℃连接1-3h，或者过夜。反应体系如下表5所示。表5试剂体积(μl)线性化载体(100ng/μl)1双链dna(100ng/μl)110×t4dnaligase缓冲液2t4dnaligase1ddh2o15(7)转化将10μl连接反应产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μllb培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。(8)菌落pcr鉴定挑取平板上的单克隆进行pcr鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μl鉴定体系中，吹打混匀，置于pcr仪中进行反应。表6pcr反应体系试剂体积(μl)ddh2o9.22×taqplusmastermix10上游引物(10μm)0.4下游引物(10μm)0.4单菌落-total20表7pcr反应条件(8)根据pcr结果，将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含氨苄西林的lb液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序验证。(9)质粒抽提将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄西林的lb液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，详细步骤如下：1.收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；2.弃上清，加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；3.加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶k，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，使菌体裂解澄清；4.加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；5.10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5mlep管；6.12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清液转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；7.加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；8.在超净台中将回收柱转至新的1.5mlep管中，静置10-20min，自然晾干；9.往回收柱中加入95μlnuclease-freewater，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。实施例2慢病毒包装与质量检测病毒包装共涉及三个质粒，分别为携带靶点序列的工具载体质粒gv248(参见实施例1)，病毒包装辅助质粒(helper1.0)和病毒包装辅助质粒(helper2.0)，分别如图3和图4所示。1.质粒的制备以qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒dna，质粒dna溶于除菌的te中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒dna的a260/a280在1.8-2.0之间。2.质粒转染与慢病毒收获(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5×106细胞/15ml，重新接种于直径10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时用于转染；(2)转染前2h更换为无血清培养基；(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各dna溶液(gv载体质粒20μg、phelper1.0载体质粒15μg、phelper2.0载体质粒10μg)，不相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；(4)混合液缓慢滴加至293t细胞培养液中，混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养；(5)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；(6)缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48-72h。3.慢病毒浓缩与纯化(1)根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可计为0h)的293t细胞上清液；(2)于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；(3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(4)分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内，25000rpm，离心2h，离心温度控制在4℃；(5)离心结束后，弃去上清，去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用pbs戒细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；(6)经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清分装；(7)准备样品待检测。4.慢病毒质量检测①物理指标检测1)颜色判定：通过肉眼判定，慢病毒保存液呈粉红色澄清液体状；2)粘稠度判定：用20-200μl移液器缓慢吸收50μl慢病毒保存液体，无明显粘稠感或吸液滞后现象；②无菌检测将病毒加入293t细胞验证，正常培养24h后镜检，无任何细菌及真菌污染情况，同时参照空细胞组，细胞间隙无明显颗粒存在，培养基澄清透明。③滴度检测1)测定前一天，使用293t贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4×104个细胞，体积100μl；2)根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的ep管，每管中加入90μl无血清培养基；3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；4)选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；5)24h后，加入完全培养基100μl，小心操作，不要吹起细胞；6)4天后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。实施例3慢病毒感染鸡胚成纤维细胞系将上述3种shrna重组慢病毒和对照shrna的慢病毒颗粒转染鸡胚成纤维细胞系(df-1)，该细胞表达sox5基因，利用荧光显微镜技术检测不同shrna的感染效率。(1)试验分组：试验分为未转染任何慢病毒组(空白对照组)、转染了sox628干扰序列的慢病毒组、转染了sox1635干扰序列的慢病毒组、转染了sox1312干扰序列的慢病毒组和转染了对照非靶向序列的慢病毒组(对照组)，共5组，所有组的细胞数量和培养条件均相同。(2)细胞感染试验方法：将鸡胚成纤维细胞系以1×106细胞/孔接种于6孔板中，混匀后37℃、5％co2培养箱培养24h；24h后更换为无抗生素的培养基，取慢病毒原液以moi＝10的比例加入慢病毒，同时加入终浓度为0.5μg/ml的聚凝胺(polybrene)以促进慢病毒感染。于37℃、5％co2条件下培养6h，更换培养基，然后继续培养至96h。(3)细胞感染的48h，采用荧光显微镜进行观察并拍照，同时采用明场观察总细胞并拍照。如图5所示，各组细胞在48h的感染效率达70％以上。以上说明含有所设计合成的三种干扰序列及对照序列的慢病毒均能有效感染鸡胚成纤维细胞系。实施例4重组慢病毒对鸡胚成纤维细胞系中sox5基因基因表达的抑制作用采用real-timepcr检测三种shrna对鸡胚成纤维细胞系中sox5基因表达水平的影响。(1)试验分组：试验分为未转染任何慢病毒组(空白对照组)、转染了sox628干扰序列的慢病毒组、转染了sox1635干扰序列的慢病毒组、转染了sox1312干扰序列的慢病毒组和转染了对照非靶向序列的慢病毒组(对照组)，共5组，所有组的细胞数量和培养条件均相同。(2)rna提取及real-timepcr检测：细胞感染72h后，采用trizola+裂解细胞，并采用氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总rna，并将所提取的mrna逆转录为cdna，逆转录条件为：37℃60min。取各组细胞的cdna作为模板，以β-actin作为内参，采用real-timepcr检测sox5基因的表达。如图6所示，三种shrna序列均对鸡胚成纤维细胞中sox5基因的表达表现出抑制作用，与非靶向的对照序列相比，sox628，sox1635和sox1312能够显著降低sox5基因的表达，其中sox1312的干扰效果最好，在基因水平的抑制效率分别为62％、80％和90％。实施例5sox1312抑制sox5基因的表达对鸡胚成纤维细胞增殖的影响采用cck8试剂盒检测鸡胚成纤维细胞不同时间的细胞数量，以衡量sox1312抑制sox5基因的表达对鸡胚成纤维细胞增殖的影响，具体方法如下：以2×104/孔的细胞数接种于96孔板中，每组10个复孔，共铺6块板，置于37℃、5％co2培养箱中培养。24h后分别将转染了sox1312干扰序列的慢病毒和转染了对照非靶向序列的慢病毒感染每块板的鸡胚成纤维细胞，分别于感染后的0h、24h、48h、72h和96h采用cck8试剂盒对细胞数量进行检测，结果如图7所示。发现与对照组相比，试验组细胞增殖在转染后24h有显著停滞。从上述内容可知，本发明首次报道了抑制鸡sox5基因表达的shrna序列，并构建了相应的shrna慢病毒表达载体。本发明的三种shrna序列(分别为sox628，sox1635和sox1312)均可有效降低鸡sox5基因的表达量，在基因水平的抑制效率分别为62％、80％和90％。将所述抑制鸡sox5基因表达的shrna构建于慢病毒载体上，适用于体内及体外研究。同时，对于深入研究鸡sox5基因的功能等具有重要的科学意义及应用前景。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所<120>一种抑制鸡sox5基因表达的shrna序列及其应用<130>fi180097<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>58<212>人工序列<223>sox1312-a正义链<400>1ccggcggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccgtttttg58<210>2<211>58<212>人工序列<223>sox1312-b反义链<400>2aattcaaaaacggcagatgaaggagcaacttctcgagaagttgctccttcatctgccg58<210>3<211>58<212>人工序列<223>sox1635-a正义链<400>3ccgggaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctctttttg58<210>4<211>58<212>人工序列<223>sox1635-b反义链<400>4aattcaaaaagaggaagatccttcaagccttctcgagaaggcttgaaggatcttcctc58<210>5<211>58<212>人工序列<223>sox628-a正义链<400>5ccggcaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctgtttttg58<210>6<211>58<212>人工序列<223>sox628-b反义链<400>6aattcaaaaacaggaacagattgcaagacaactcgagttgtcttgcaatctgttcctg58<210>7<211>54<212>人工序列<223>对照-a正义链<400>7ccggttctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaatttttg54<210>8<211>57<212>人工序列<223>对照-b反义链<400>8aattcaaaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaa57当前第1页12