本发明属于生物科技技术领域，尤其是一种完全利用小分子诱导人源脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。
背景技术：
男性生殖健康离不开生殖系统的功能健全。目前，雄激素缺乏症的治疗方法仅停留在雄激素替代治疗。然而，长期的雄激素治疗会引起肝肾功能损伤、免疫力降低、水钠潴留等并发症，而且不受自身昼夜节律的调控。目前，医学研究一大热点是细胞替代疗法。虽然睾丸间质细胞(leydigcell,lcs)移植可以避免外源性雄激素替代治疗带来的某些并发症，但是睾丸间质细胞(leydigcell,lcs)来源不足和异体移植可能导致宿主免疫排斥反应限制了睾丸间质细胞(leydigcell,lcs)在临床上的应用。目前，诱导干细胞(全能干细胞和成体干细胞)分化为睾丸间质细胞，作为供体移植有望成为解决问题的突破口。
近年来，生物学家对脂肪间质干细胞的研究有了较大的突破和发展。如中国专利授权公告号为：cn104357387b所公开的《一种从脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法》所公开的“2001年，细胞生物学家通过脂肪抽吸术，在吸出的人体脂肪悬液中第一次分离得到了多向分化的干细胞，并发现它能分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、胰、神经等细胞；这种从人脂肪组织中发现的具有分化潜能的成体干细胞，被称为人脂肪干细胞”。如中国专利公开号为：cn104611290a的文件《诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞的方法》、中国专利公开号：cn104805051a的文件《诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法》、中国专利公开号：cn106350483a的文件《诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的培养方法》、如中国专利公开号：cn103805566b的文件《人脂肪干细胞经三维培养后分化成神经样干细胞的方法》等内容可知，脂肪干细胞(adscs)本身具有多向分化潜能，在一定的条件下，能够被诱导分化为多种细胞，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，神经细胞和肝细胞等。而且脂肪干细胞(adscs)不受时间限制，可以从任意年龄段患者自体抽脂分离获取，避免了免疫排斥，取材也相对容易且不会形成肿瘤。脂肪干细胞(adscs)经过多年研究，已经可以被诱导分化为多种细胞，但通过小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的技术却未见公开；因此，本专利将立足采用人源脂肪干细胞(hadscs)，采用小分子而非基因导入方法诱导脂肪干细胞(adscs)分化为功能的成熟睾丸间质细胞lcs(alcs)，为将来患者采用自体脂肪干细胞(adscs)分化的睾丸间质细胞(alc)移植治疗雄性激素缺乏症提供科学依据。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，该方法突破了现有技术中诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的技术空白；且诱导完全采用小分子，不依赖外源基因的导入，提高了未来用于临床应用的安全性。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①将获得的人源脂肪组织通过i型胶原酶分离出脂肪干细胞，该i型胶原酶按照质量体积比0.1％加入到dmem低糖(dmem-lg)培养基中，然后用含质量体积比为0.25％edta的胰酶消化获取传代培养的脂肪干细胞；②对获取的传代培养的脂肪干细胞进行流式细胞分析鉴定；③采用成脂诱导培养基诱导脂肪干细胞完成成脂分化鉴定；④采用成骨诱导培养基诱导脂肪干细胞完成成骨分化鉴定；⑤待脂肪干细胞完成步骤②-③的鉴定处理后，对脂肪干细胞进行免疫荧光处理：于室温进行膜通透化处理后直接加入一抗4℃孵育过夜，然后加入二抗室温孵育，接着染色室温孵育；⑥将脂肪干细胞接种培养5天后，进行分化培养，在分化培养过程中加入小分子促进脂肪干细胞分化成睾丸间质细胞，小分子成分包括sag、22ohc、li、pdgf-aa、fgf2、androgen、lh，然后手工剔除非睾丸间质细胞(alcs)样细胞，并富集分化得到的靶细胞(adsc-alcs)，并完成对靶细胞的免疫荧光鉴定和逆转录pcr检测鉴定分析。
进一步的，所述步骤⑥中对脂肪干细胞进行分化培养的过程中，将接种培养基换成分化培养基时，此时间点定义为分化第0天，然后在分化第0至7天，每隔2天向分化培养基中外加0.5μmsag、2μm22ohc、10mmli促进分化，在分化第7至14天，每隔2天向分化培养基中外加促增殖因子10ng/mlpdgf-aa和10ng/mlfgf2，以及加入促分化因子20μmandrogen，在分化第14至18天，每隔2天向分化培养基中外加促成熟因子50ng/mllh和0.5μmsag；脂肪干细胞在分化培养基adsc-dim中共诱导18天，每2天换1次分化培养基。
再进一步的，在诱导分化18天后，采用自制玻璃细胞刮在显微镜下手动剔除非睾丸间质样细胞，剩余贴壁细胞采用质量体积比为0.25％edta消化后1000转/分钟离心5分钟富集，采用富集培养基enrichmentmedium重悬后转移至预先用体积百分比1％matrigelcoating处理即37℃孵育1小时以上的6孔板中富集培养7天，即第25天，所述富集培养基enrichmentmedium包括dmem-f12、体积百分比1％fbs、sodiumpyruvate、glutamax。
进一步的，所述步骤⑥中分化培养时采用的分化培养基包括dmem-f12、its、10ng/mllh、0.2μmsag、2μm22ohc和5mmli。
再进一步的，所述步骤③中的成脂诱导培养基包括含100u/mlp/s和体积百分比10％fbs的dmem/lg、10μm的胰岛素、0.5mm的异丁基甲基黄嘌呤、1μm的地塞米松、200μm的吲哚美辛。
进一步的，所述步骤③中的成脂诱导培养基包括含100u/mlp/s和10％fbs的dmem/lg、10μm的胰岛素、0.5mm的异丁基甲基黄嘌呤、1μm的地塞米松、200μm的吲哚美辛。
进一步的，所述步骤④中成骨诱导培养基包括含100u/ml双抗(p/s)和体积百分比10％胎牛血清(fbs)的dmem/lg、50μm抗坏血酸磷酸盐、1μm地塞米松、100μm甘油磷酸盐。进一步的，所述步骤⑤中一抗包括兔单克隆cyp11a1抗体、兔多克隆cyp17a1抗体、兔多克隆hsd3b1抗体、鼠单克隆cd29抗体，兔单克隆cyp11a1抗体与稀释液按体积比1:350稀释，兔多克隆cyp17a1抗体与稀释液按体积比1:100稀释，兔多克隆hsd3b1抗体与稀释液按体积比1:500稀释，鼠单克隆cd29抗体与稀释液按体积比1:500稀释；二抗包括cy3标记羊抗兔igg抗体、cy3标记羊抗鼠igg抗体、fitc标记羊抗兔igg抗体，cy3标记羊抗兔igg抗体与稀释液按体积比1:500稀释，cy3标记羊抗鼠igg抗体与稀释液按体积比1:500稀释，fitc标记羊抗兔igg抗体与稀释液按体积比1:500稀释。
采用上述方案，本发明的反应机理如下：1)分离获取高纯度人源脂肪干细胞；2)按照本专利公开配比方案进行最佳诱导分化。本发明采用小分子诱导分化的有益效果如下：1)选用脂肪间充质干细胞作为诱导种子细胞，较其他干细胞来源广泛大量，且可以从自体组织中获取，规避了免疫排斥反应；2)分化过程未引入外源基因，完全采用小分子诱导，提高了未来临床应用的安全性；3)小分子诱导过程灵活可控，避免了过度诱导，提高了诱导效率；4)诱导方法可操作性强，重复性好，可稳定诱导出大量能分泌睾酮的睾丸间质细胞，从而更适用于未来临床应用。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
附图1为分离和培养的脂肪干细胞(adscs)；其中，(a)为原代培养的adscs(p0)；(b)为一代培养的adscs(p1)；(c)为二代培养的adscs(p2)；(d)为三代培养的adscs(p3)；
附图2为脂肪干细胞(adscs)的流式鉴定；其中，(a)为流式分析脂肪干细胞(adscs)表面抗原的表达情况；(b)为柱状图统计流式分析数据图；
附图3为脂肪干细胞(adscs)的成脂成骨诱导鉴定；其中，(a)为未经过成脂诱导培养基处理的脂肪干细胞(adscs)阴性对照组；(b)为油红o染色经过成脂诱导培养基分化处理的adscs成阳性(黑色箭头)；(c)为未经过成骨诱导培养基处理的adscs阴性对照组；(d)为碱性磷酸酶染色经过成骨诱导培养基分化处理的adscs成阳性(黑色箭头)；
附图4为脂肪干细胞(adscs)在分化培养基(adsc-dim)中被诱导分化为睾丸间质细胞(alcs)；其中，(a)为诱导分化示意图；(b)为不同时间点诱导分化靶向细胞明场形态；(c)为放射免疫法测定在lh刺激3小时后adscs(阴性对照)，adsc-alcs(分化组)和alcs(阳性对照)培养基上清中睾酮水平；
附图5为免疫荧光鉴定诱导分化的靶细胞(adsc-alcs)；其中，免疫荧光检测adscs(阴性对照)，lcs(阳性对照)和adsc-alcs(实验组)标记蛋白cyp11a1，cyp17a1，hsd17b3和cd29表达。
具体实施方式
本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。
本发明的具体实施例如图1-4所示是小分子诱导脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其包括如下步骤，
①获得人脂肪干细胞：严格按照无菌操作要求，在超净工作台里将来自六位女性腹部抽提得到的脂肪(或者从现有脂肪库中提取)依次转入50ml离心管中，静止10分钟待组织液与脂肪分层后，使用巴氏管将处于离心管底层的组织液去除。然后脂肪组织按照体积比1:1的比例加入用dmem低糖(dmem-lg)稀释为质量体积比0.1％的i型胶原酶，在恒温37℃，100转/分钟摇床孵育45分钟。离心力300g离心15分钟分层后，小心去除掉上层消化液，为进一步去除混合在脂肪细胞中的大量血细胞，加入10ml体积百分比为0.3％的生理盐水，在恒温37℃，100转/分钟摇床孵育15分钟，重复2-3次直至离心后看不见红色沉淀物为止。然后加入5mlpbs缓冲液，重悬细胞后用100目钢网过滤，取滤液300g离心5分钟，细胞由于离心力沉积于离心管底部，接着加入提前配置的adsc培养液即adscmedium重悬细胞，该adsc培养液包括dmem-lg、体积百分比10％胎牛血清(fbs)、体积百分比1％双抗(p/s)，经细胞计数后，以5×104个/ml密度接种于培养瓶中。将培养瓶转移至恒温为37℃，体积百分比5％co2的培养箱中进行培养，3天后细胞换液，进一步去除不能贴壁的杂质、死细胞以及血细胞。之后每间隔3天更换培养基1次，待细胞增殖融合至80％～90％时，使用含质量体积比0.25％edta胰酶消化后进行传代培养，获得脂肪干细胞。
实验结果显示，adscs可以顺利的通过i型胶原酶消化法从抽脂的脂肪组织中提取出来。一般来说，在培养后的第5天，通过每隔2天连续换液去除悬浮的血细胞，大部分贴壁生长的原代adscs(p0)能呈现出良好的长梭型细胞形态(图1a)。细胞继续培养，很快能增殖达到80-90％融合状态。采用质量体积比0.25％edta胰蛋白酶消化获取传代培养的第一代adscs(p1)(图1b)，第二代adscs(p2)(图1c)和第三代adscs(p3)(图1d)。
②流式细胞分析脂肪干细胞(adscs)：将脂肪干细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔培养板上，待细胞长满后。用含质量体积比0.25％edta胰蛋白酶消化细胞，1500转/分钟离心5分钟收集adscs。pbs清洗1次，然后加入500μl体积百分比4％多聚甲醛4℃固定过夜，弃固定液，2ml毫升pbs震荡重悬，离心弃上清。用2ml体积百分比5％的fbs-pbs室温封闭10分钟，离心弃上清，同时设置同型对照组。按体积比1：50加入荧光抗体fitc-cd29，fitc-cd44，fitc-cd59，pe-cd105，pe-cd34，pe-cd45和pe-hla-dr工作液100微升(5μl抗体每100μl细胞体积)，室温避光孵育20分钟，离心去上清，加入500μlpbs清洗3次，最后用200μlpbs重悬，过滤并上机检测。
结果显示，p1代adscs流式表面抗原检测结果显示，分离的adscs能阳性的表达cd44，cd59和cd29，低水平表达cd105和cd34，阴性表达cd45和hla-dr(图2a)，并对数据进行定量分析后作图(图2b)。
③脂肪干细胞成脂分化：将脂肪干细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔培养板上，待细胞贴壁后，加入成脂诱导培养基进行诱导2周，成脂诱导培养基主要成分包括：100u/ml双抗(p/s)、体积百分比10％胎牛血清(fbs)的dmem/lg、10μm胰岛素、0.5mm异丁基甲基黄嘌呤、1μm地塞米松和200μm吲哚美辛。然后用pbs洗涤脂肪干细胞3遍，加入10％的甲醛室温固定30分钟。接着再用pbs洗涤脂肪干细胞3遍，加入2％的油红o溶液室温染色10分钟。最后用体积百分比70％的乙醇洗涤染色液并倒置显微镜下观察拍照。
结果显示，经过2周的成脂诱导，诱导后形成的脂肪颗粒能被油红o染成红色(图3b)，说明adscs被成功诱导分化为脂肪细胞。
④脂肪干细胞成骨分化：将脂肪干细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔培养板上，待细胞贴壁后，加入成骨诱导培养基进行诱导2周，成骨诱导培养基主要成分包括：含100u/ml双抗(p/s)和体积百分比10％胎牛血清(fbs)的dmem/lg、50μm抗坏血酸磷酸盐、1μm地塞米松、100μm甘油磷酸盐。然后用pbs洗涤脂肪干细胞3遍，加入体积百分比4％的多聚甲醛室温固定10分钟。接着脂肪干细胞再用pbs洗3遍，加入碱性磷酸酶溶液37℃染色15分钟。最后用去离子水洗涤染色液并倒置显微镜下观察拍照。
结果显示，经过2周的成骨诱导，诱导后细胞分泌产生钙化的富含胶原的ecm，通过碱性磷酸酶染色成阳性显蓝色(图3c)，说明adscs被成功诱导分化为骨细胞。
上述成脂成骨诱导分化的这些数据说明，成上述过程已经成功地从脂肪组织中提取出adscs。
⑤小分子诱导脂肪干细胞(adscs)分化为睾丸间质细胞(adsc-alc)将脂肪干细胞以1×105个/孔的密度接种到12孔培养板上，待培养5天细胞长满。培养基采用分化培养基adsc-dim：dmem-f12，its，10ng/mllh，0.2msag，2m22ohc和5mmli，此时间点定义为分化第0天。然后在分化第0至7天，每隔2天向分化培养基中外加0.5msag，2m22ohc，10mmli促进分化。在分化第7至14天，每隔2天向分化培养基中外加促增殖因子10ng/mlpdgf-aa和10ng/mlfgf2，以及促分化因子20mandrogen。在分化第14至18天，每隔2天向分化培养基中外加促成熟因子50ng/mllh和0.5msag。adscs在分化培养基adsc-dim中共诱导18天，每2天换1次分化培养基。诱导分化18天后，采用自制玻璃细胞刮在显微镜下手动剔除非alc样细胞，剩余贴壁细胞采用质量体积比0.25％edta消化后1000转/分钟离心5分钟富集，采用富集培养基(enrichmentmedium)：dmem-f12、质量体积比1％fbs、sodiumpyruvate、glutamax重悬后转移至预先体积百分比1％matrigelcoating处理(37℃孵育1小时以上)的6孔板中富集培养7天，即第25天。然后分化得到的靶细胞进行后续鉴定分析。
上述采用特定的分化培养基adsc-dim：dmem-f12，its，10ng/mllh，0.2μmsag，2μm22ohc和5mmli，诱导adscs向alcs分化。同时在不同时间点向分化培养基中外加一定量小分子包括：sag,22ohc,li,pdgf-aa,fgf2,androgen,lh促进细胞增殖和分化，最后采用手工剔除非alcs样细胞富集分化的靶细胞(adsc-alcs)，具体分化流程见图4a。当adscs培养基adscmedium更换为分化培养基adsc-dim时定义为分化第0天，此时细胞呈致密梭形结构，生长状态良好。在诱导分化第7天，细胞形态发生显著变化，呈卵泡状，折光性强。诱导分化第14天，细胞形态呈圆形及椭圆形混合状态，折光性下降。在诱导分化第18天，细胞形态呈多种形态混合状态(图4b)。诱导分化后经过手工富集的adsc-alcs，在培养基中加入100ng/mllh(最大刺激浓度)培养3小时，收集培养基，测量培养基上清睾酮，结果显示adsc-alcs可以分泌睾酮，且高于阴性对照adscs，但是低于阳性对照alcs(图4c)。
⑥对分化靶细胞(adsc-alcs)进行免疫荧光鉴定：待脂肪干细胞处理好后，吸弃上清，pbs洗1遍，加入体积百分比4％多聚甲醛室温下孵育15分钟，然后pbs洗3遍，每遍5分钟，再加入含有质量体积比0.1％triton-x100和质量体积比3％的牛血清白蛋白(bsa)的pbs，室温进行膜通透化处理1小时。然后不洗涤直接加入一抗：兔单克隆cyp11a1抗体(体积比1:350)，兔多克隆cyp17a1抗体(体积比1:100)，兔多克隆hsd3b1抗体(体积比1:500)，和鼠单克隆cd29抗体(体积比1:500)4℃孵育过夜。然后pbs洗3次，每次5分钟，接着加入二抗：cy3标记羊抗兔igg抗体(体积比1:500)，cy3标记羊抗鼠igg抗体(体积比1:500)和fitc标记羊抗兔igg抗体(体积比1:500)室温孵育2小时。之后pbs洗3次，每次5分钟，接着加入dapi染色液室温避光孵育15分钟。最后pbs洗3次，每次5分钟，直接倒置荧光显微镜下观察拍照。
上述对分化靶细胞(adsc-alcs)进行免疫荧光鉴定，检测睾丸间质细胞相关标志蛋白cyp11a1，cyp17a1，hsd17b3，以及脂肪干细胞表面特异性标记蛋白cd29的表达情况。结果显示阴性对照组脂肪干细胞adscs可阳性表达cd29，但阴性表达cyp11a1，cyp17a1，hsd17b3。阳性对照组leydig细胞lcs可阳性表达cyp11a1，cyp17a1，hsd17b3，阴性表达cd29。实验组诱导分化靶细胞adsc-alcs部分细胞能阳性表达睾丸间质细胞相关标记蛋白cyp11a1，cyp17a1，hsd17b3，阴性表达脂肪干细胞相关标记蛋白cd29(图5)。
⑦逆转录pcr(rt-pcr)检测
利用trizol(英潍捷基，美国)提取各组细胞总的rna，并测定od，保证提取各组的rnaod260/od280值在1.8和2.1之间，以保证其纯度。然后总rna利用逆转录试剂盒(东洋纺，日本)进行反转录成cdna，反应体系和反应程序参照产品说明书。cdna用来做rt-pcr，引物序列采用：
cyp11a1-f:gcagtgtctcgggacttcg
cyp11a1-r:ggcaaagcggaacaggtca
hsd3b1-f:cacatggcccgctccatac
hsd3b1-r:gtgccgccgtttttcagattc
cyp17a1-f:tatggccccatctattcggtt
cyp17a1-r:gcgatacccttacggttgttg
hsd17b3-f:gtcaacaatgtcggaatgcttc
hsd17b3-r:tgatgttacaatggatgaggctc
sf-1-f:ggaggcttgcgaaggagaag
sf-1-r:agcttacccaacggcgtg
cd29-f:ggagtcgcggaacagca
cd29-r:agcaaacacacagcaaactgaa
cd44-f:ctgccgctttgcaggtgta
cd44-r:cattgtgggcaaggtgctatt
gadph-f:acaactttggtatcgtggaagg
gadph-r:gccatcacgccacagtttc
反应体系参考sybr试剂盒(宝日，日本)说明书，瞬离后上机，95℃预变性3分钟，反应35个循环(95℃,10秒；60℃,30秒)。反应后根据ct值统计分析，绘制标准曲线，使用基于ct(2-ct)方法进行定量分析。
同时逆转录pcr(rt-pcr)检测结果显示，诱导分化靶细胞adsc-alcs能阳性表达睾丸间质细胞相关标记基因cyp11a1，hsd3b1，cyp17a1，hsd17b3和sf-1，阴性表达脂肪干细胞相关标基因cd29和cd44。
血清睾酮测定(放免法)
配制tbs-g溶液：1ggelatin，4.4gtrizmahcl，2.65gtrizmabase，5.84nacl和1gnaazide溶于1l双蒸水。在标记tc管(不用活性炭吸附，测完整放射值)中加500μltbs-g。在标记nbs管(不加抗体，用于测量非特异性结合值)中加500μltbs-g。在标记样品管中加200μltbs-g和100μl样品。在标记标准品管的管中加300μl不同浓度的标准品(10-2000pg/100μl，8个浓度)。除tc管和nbs管外，每管加200μl睾酮抗体。每管加300μltracer(3h-睾酮-tbs-g溶液)，振荡，4℃过夜。除tc管外，每管加200μl活性碳/葡萄聚糖(用于吸附与抗体结合的睾酮)并放置20分钟，振荡，1800g离心10分钟。将上清小心加入到含有5μl液闪液瓶中，其过程中注意不让活性碳进入液闪瓶，然后上下颠倒混匀。液闪测量。检测的内部效应和外部效应差异为15％。
综上，此部实验结果提示，在分化培养基adsc-dim基础上，外加sag,22ohc,li,pdgf-aa,fgf2,androgen,lh小分子能够成功诱导脂肪干细胞(adscs)分化为睾丸间质细胞(alcs)。