利用多功能胎盘组织处理装置提取胎盘中造血干细胞的方法与流程

文档序号:15362868发布日期:2018-09-05 01:03阅读:322来源:国知局

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种的胎盘组织的处理方法。



背景技术:

受精卵着床与母体的子宫内膜后,逐渐发育成一个个体的过程中是通过胎盘获取营养和代谢废物的。胎盘组织是一个精密的结构,是哺乳动物生长过程中母体和婴儿之间的重要的保护作用和物质能量交换场所。一个足月的胎盘直径约160-200mm、厚度约20-25mm、重量450-650克,其结构包括了羊膜,叶状绒毛膜,底蜕膜三部分。在绒毛膜中,有大量的有胎儿静脉和动脉组成的突起的绒毛小叶,使得其比表面积大大增加至约14平方米,大大增加了胎儿与母体之间的物质交换面积,也因此赋予胎盘多种功能,包括:1.天然屏障作用。外界的物质通过胎盘组织的过滤、隔离作用,防止微生物和毒素等直接进入婴儿体内。2.营养交换功能。母体的糖分、脂肪、水分、矿物质、维生素、抗体、荷尔蒙、氨基酸等营养通过主动或者被动运输,送至胎盘中的毛细血管将营养带到绒毛小叶间隙,并由绒毛小叶中胎儿毛细血管吸收后向胎儿运输。而胎儿的尿素、尿酸、胆红素、电解质、hcg、progesterone、水分等则反向进入母体血液,从而实现了胎儿体内废物的排泄。3.气体交换场所。经过胎盘,母体将氧气输送给胎儿,将二氧化碳排除胎儿。4.荷尔蒙调节作用。胎盘的激素可以起到内分泌调节作用,在孕期的第2周,hcg在妊娠的第二周就开始分泌,到第8周到达分泌高峰;hcs在妊娠的第二个月开始表达,在第8个月达到高峰;胎盘在妊娠的第12周开始就分泌雌激素和孕酮,雌激素促进子宫肌膜和乳腺的发育;孕酮则可促进子宫粘膜内腺体生长,减少妊娠子宫的兴奋性,减少早期宫缩、调节免疫等作用。5.造血功能。胎儿肝脏造血向骨髓造血的转移是在34周前期已经完成,而脐带静脉血中含有高于动脉血的cd34阳性、cd38阴性、集落形成能力很强的原始造血干细胞和前体细胞,由此证明胎儿的部分造血功能是来自胎盘。组织学研究表明,胎盘中含有大量的干细胞,包括造血干细胞、造血前体细胞、间充质干细胞等,具有向血液细胞、成骨、成软骨和脂肪等分化能力,因此胎盘组织也成为重要的再生医学领域的组织材料。

胎盘中造血干细胞含量丰富,是脐带血中的3-5倍,因此可以作为血液性疾病和免疫性疾病治疗中的主要造血干细胞来源。胎盘组织剪碎后进行分离、培养、扩增后,获得的间充质干细胞其研究应用领域已经包括多种于组织损伤修复,例如肝硬化、软骨损伤、神经损伤、骨损伤、肌腱韧带损伤、皮肤损伤等,是机体再生修复的重要干细胞来源。

干细胞从胎盘组织中的获得,需要对胎盘组织进行各种处理,包括冲洗、消毒、组织剪小、造血干细胞收集、间充质干细胞培养等步骤。传统的方法是采用开放式操作方法,将胎盘组织放于一个无菌盘子中,在安全柜中,依次采用无菌水冲洗、移除、75%酒精浸泡消毒后移除、无菌水再次冲洗、组织手工剪刀剪碎、无菌水浸泡分离血液细胞等预处理过程,每一个过程都是开放过程,微生物污染风险非常大。同时此过程需要人工耗时高,所用器械也需要反复清洗、灭菌,因此成本高。



技术实现要素:

本发明的目的是要解决常规胎盘细胞清洗、分离时胎盘组织开放处理容易污染,处理过程中人工耗时,处理不完全、组织间隙细胞获得少的问题,而提供利用多功能胎盘组织处理装置提取胎盘中造血干细胞的方法。

利用多功能胎盘组织处理装置提取胎盘中造血干细胞的方法,具体是按以下步骤完成的:

一、清洗胎盘:

①、胎盘处理装置的处理器筒体下端与清洗液接收器的锥形处理液接收器上端螺纹连接在一起,将无菌采集的胎盘放入处理器筒体中,将无菌生理盐水通过封闭硅胶帽注入处理器筒体内,密封处理器筒体;所述无菌生理盐水的体积与处理器筒体的容积比为1:(16~40);所述胎盘的体积与处理器筒体的容积比为1:(10~20);

②、以处理器筒体横放形式将连接管和清洗液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上;开启电动控制器,使处理器筒体以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体纵向移动,且第一皮带向上移动时第二皮带向下移动,洗涤4min~6min;

③、从多功能电动支架上取下处理器筒体,并以封闭硅胶帽在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀,排除清洗液,关闭清洗液止流阀,将无菌生理盐水通过封闭硅胶帽注入处理器筒体内,密封处理器筒体;所述无菌生理盐水的体积与处理器筒体的容积比为1:(16~40);

④、以处理器筒体横放形式将连接管和清洗液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上;开启电动控制器,使处理器筒体以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体纵向移动,且第一皮带向上移动时第二皮带向下移动,洗涤4min~6min;

⑤、从多功能电动支架上取下处理器筒体,并以封闭硅胶帽在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀,排除清洗液,关闭清洗液止流阀,将质量分数为75%的酒精通过封闭硅胶帽注入处理器筒体内,密封处理器筒体;所述质量分数为75%的酒精的体积与处理器筒体的容积比为1:(15~30);

⑥、以处理器筒体横放形式将连接管和清洗液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上;开启电动控制器,使处理器筒体以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体纵向移动,且第一皮带向上移动时第二皮带向下移动,浸泡4min~6min;

⑦、从多功能电动支架上取下处理器筒体,并以封闭硅胶帽在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀,排除消毒后的酒精,将无菌生理盐水通过封闭硅胶帽注入处理器筒体内,密封处理器筒体;所述无菌生理盐水的体积与处理器筒体的容积比为1:(16~40);

⑧、以处理器筒体横放形式将连接管和清洗液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上;开启电动控制器,使处理器筒体以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体纵向移动,且第一皮带向上移动时第二皮带向下移动,洗涤4min~6min;

⑨、从多功能电动支架上取下处理器筒体,并以封闭硅胶帽在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀,排除清洗液,关闭清洗液止流阀;

二、破碎胎盘:胎盘剪碎底座的底座代替清洗液接收器的锥形处理液接收器与胎盘处理装置的处理器筒体螺纹连接在一起,将4℃的无菌生理盐水通过封闭硅胶帽注入处理器筒体内,然后以底座与附有平台的电磁搅拌机面接触形式置于多功能电动支架上,开启附有平台的电磁搅拌机,驱动磁力剪切刀转动,转速为80~100rpm,处理5min~6min;所述4℃的无菌生理盐水的体积与处理器筒体的容积比为1:(80~100);

三、胎盘造血干细胞收集:

①、造血细胞/组织收集器的锥形收集液接收器代替胎盘剪碎底座的底座与胎盘处理装置的处理器筒体螺纹连接在一起,以封闭硅胶帽在上形式竖直放置,打开收集液止流阀,收集富含造血干细胞的单细胞悬液,关闭收集液止流阀;

②、将胎盘组织酶解液通过封闭硅胶帽注入处理器筒体内,密封处理器筒体,然后以处理器筒体横放形式将连接管和收集液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上;开启电动控制器,使处理器筒体以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体纵向移动,且第一皮带向上移动时第二皮带向下移动,处理10min~15min,从多功能电动支架上取下处理器筒体,并以封闭硅胶帽在上形式竖直放置,打开收集液止流阀,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;所述胎盘组织酶解液中溶剂为pbs缓冲液,溶质为低分子量肝素钠注射液、i型胶原酶、ⅱ型胶原酶、iv型胶原酶和胰蛋白酶-edta,且低分子量肝素钠注射液的浓度为(2~30)iu/ml,i型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,ⅱ型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,iv型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,胰蛋白酶-edta的浓度为(0.05~0.25)mg/ml;所述胎盘组织酶解液的体积与处理器筒体的容积比为1:(20~40);

③、将胎盘组织酶解液通过封闭硅胶帽注入处理器筒体内,密封处理器筒体,然后以处理器筒体横放形式将连接管和收集液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上;开启电动控制器,使处理器筒体以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体纵向移动,且第一皮带向上移动时第二皮带向下移动,处理10min~15min,从多功能电动支架上取下处理器筒体,并以封闭硅胶帽在上形式竖直放置,打开收集液止流阀,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;所述胎盘组织酶解液中溶剂为pbs缓冲液,溶质为低分子量肝素钠注射液、i型胶原酶、ⅱ型胶原酶、iv型胶原酶和胰蛋白酶-edta,且低分子量肝素钠注射液的浓度为(2~30)iu/ml,i型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,ⅱ型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,iv型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,胰蛋白酶-edta的浓度为(0.05~0.25)mg/ml;所述胎盘组织酶解液的体积与处理器筒体的容积比为1:(20~40);

④、将pbs缓冲液通过封闭硅胶帽注入处理器筒体内,密封处理器筒体,以处理器筒体横放形式将连接管和收集液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上;开启电动控制器,使处理器筒体以40~60rpm的速度逆时针转动,处理4min~6min;从多功能电动支架上取下处理器筒体,并以封闭硅胶帽在上形式竖直放置,打开收集液止流阀,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;所述pbs缓冲液的体积与处理器筒体的容积比为1:(10~20);

⑤、合并步骤三①~④收集的富含造血干细胞的单细胞悬液,即完成胎盘组织酶解分离干细胞提取;

所述多功能胎盘组织处理装置包括多功能电动支架、胎盘处理装置、清洗液接收器、胎盘剪碎底座和造血细胞/组织收集器,

所述多功能电动支架包括第一皮带、附有平台的电磁搅拌机、第二皮带和电动控制器,附有平台的电磁搅拌机设置在电动控制器上,第一皮带和第二皮带设置在电动控制器两侧,在第一皮带和第二皮带上均设置弧形部,第一皮带和第二皮带同步逆时针轴向转动,但第一皮带和第二皮带上下移动呈反向;

所述胎盘处理装置包括封闭硅胶帽、连接管、处理器盖、处理器筒体和两个挡板,连接管设置在处理器盖顶部,连接管的端口设置封闭硅胶帽,处理器盖的下端与处理器筒体上端通过螺纹连接在一起,两个挡板相对设置在处理器筒体内壁上;

所述清洗液接收器包括锥形处理液接收器、200微米漏网、清洗液导流管、清洗液乳胶管和清洗液止流阀,200微米漏网设置在锥形处理液接收器内,在锥形处理液接收器底端设置清洗液导流管,清洗液导流管末端密封连接清洗液乳胶管,在清洗液乳胶管上设置清洗液止流阀;

所述胎盘剪碎底座包括底座和磁力剪切刀,底座上端开口、下端封闭,在底座内底部上设置磁力剪切刀;

所述造血细胞/组织收集器包括锥形收集液接收器、70微米漏网、收集液导流管、收集液乳胶管和收集液止流阀;70微米漏网设置在锥形收集液接收器内,在锥形收集液接收器底端设置收集液导流管,收集液导流管末端密封连接收集液乳胶管,在收集液乳胶管上设置收集液止流阀;

当多功能胎盘组织处理装置用于清洗胎盘时,胎盘处理装置的处理器筒体下端与清洗液接收器的锥形处理液接收器上端螺纹连接在一起,以处理器筒体横放形式将连接管和清洗液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上;

当多功能胎盘组织处理装置用于破碎胎盘时,胎盘处理装置的处理器筒体下端与胎盘剪碎底座的底座上端螺纹连接在一起,以底座与附有平台的电磁搅拌机面接触形式置于多功能电动支架上;

当多功能胎盘组织处理装置用于胎盘造血细胞/组织收集时,胎盘处理装置的处理器筒体下端与造血细胞/组织收集器的锥形收集液接收器上端螺纹连接在一起,以处理器筒体横放形式将连接管和收集液导流管分别置于多功能电动支架的第一皮带和第二皮带的弧形部上。

本发明优点:一、本发明一种多功能胎盘组织处理装置是集胎盘组织清洗、消毒、剪切、造血干细胞分离、胎盘组织块分离一身的多功能处理器。此装置可以做成无菌封闭的处理方式。胎盘处理过程的清洗、消毒、剪切等过程,传统的方法都是在开放的盘子中进行的,这些步骤中包括多步骤、不同试剂的加入,试剂的移除,在开放的环境中容易因为人员的操作或者环境的控制等问题带入污染,对后期造血干细胞、间充质干细胞的无菌分离和培养造成威胁。二、本发明一种多功能胎盘组织处理装置是自动化的胎盘剪切方式。传统的胎盘造血干细胞分离方式包括静脉灌注或者手动胎盘组织剪碎、压碎两种方式。灌注方式获得的造血干细胞或者前体细胞较少,因此大多数工艺会采取后一种手工剪碎或者压碎方式,这种方式造成的人工耗时长,组织块大小不均且无法达到预期的尺度,同时也有人要操作的污染风险以及后期操作台清理、剪切工具清洗等大量手工工作。采用自动化剪切方式,可以完全解决这些缺点。三、本发明一种多功能胎盘组织处理装置采用轴向转动和不同步上下翻动的电动混合方式,有利于清洗液与样本、消毒液与样本、收集液与样本的重复接触,实现高效的清洗和细胞回收功能。四、本发明一种多功能胎盘组织处理装置将造血干细胞和组织干细胞同时分离。本方法一次性可以获得富含造血干细胞/前体细胞的单细胞悬液,同时分离出可以直接用于贴壁法培养的富含间充质干细胞的组织块,操作简便。五、本发明一种多功能胎盘组织处理装置结构简单,造价低廉,使用后清洗方便,内有挡板可以实现组织和液体的重复接触,且处理器筒体、锥形处理液接收器和锥形收集液接收器均为半透明环氧树脂材料,不仅方便观察容器内胎盘清洗消毒过程和剪碎程度,重复使用前可在121℃条件下高压灭菌避免微生物污染。六、本发明方法可有效提高有核细胞收获总量,当单次处理胎盘的体积为500ml时,本发明单次有核细胞收获总量为(1-2)×1010个的比例达到13%以上,有核细胞收获总量(2-5)×1010个的比例达到28%以上,有核细胞收获总量>5×1010个的比例达到57%以上,cd34阳性造血干细胞数量均值达3.2×108以上;常规方法有核细胞收获总量范围为(2~4)×109个,cd34阳性造血干细胞数量最多为2.8×107个,所以本发明采用柔和的自动化切碎胎盘组织、收集液和胎盘组织在特定皮带转动方式下充分接触,解决了组织间隙细胞获得少的问题。七、由于柔和的切碎过程以及处理时间的缩短,通过本发明方法可有效提高有核细胞活率和cd34阳性细胞占比,当单次处理胎盘的体积为500ml时(p<0.01),本发明与常规方法比较细胞活率平均上升7%,证明本发明对细胞的损伤小;本发明cd34阳性细胞占比达到0.54%以上,较常规方法比较cd34阳性细胞占比上升90%以上;八、本发明方法可有效降低微生物阳性率,当单次处理胎盘的体积为500ml时,常规方法微生物阳性率达到28%以上,而本发明微生物阳性率仅为4.5%左右,下降趋势明显;九、通过细胞克隆形成能力对比(集落形成数量),本发明于常规方法对比存在显著优势(p<0.05);十、本发明大大缩短了胎盘中有核细胞分离的时间,采用本发明后,平均处理时间为60min,常规方法平均处理时间为120分钟。节约的时间主要来自自动切碎胎盘、多个清洗过程的自动化操作(p<0.01)。

附图说明

图1是本发明多功能胎盘组织处理装置的多功能电动支架结构示意图,图中1表示第一皮带,2表示附有平台的电磁搅拌机,3表示第二皮带,4表示电动控制器;

图2是本发明多功能胎盘组织处理装置的胎盘处理装置结构示意图,图中5表示封闭硅胶帽,6表示连接管,7表示处理器盖,8表处理器筒体,9表示挡板;

图3是本发明多功能胎盘组织处理装置的清洗液接收器结构示意图,图中10表示锥形处理液接收器,11表示200微米漏网,12表示清洗液导流管,13表处清洗液乳胶管,14表示清洗液止流阀;

图4是清洗胎盘时胎盘处理装置与清洗液接收器组合结构示意图,图中5表示封闭硅胶帽,6表示连接管,7表示处理器盖,8表处理器筒体,9表示挡板,10表示锥形处理液接收器,11表示200微米漏网,12表示清洗液导流管,13表处清洗液乳胶管,14表示清洗液止流阀;

图5是本发明多功能胎盘组织处理装置的胎盘剪碎底座结构示意图,图中15表示底座,16表示磁力剪切刀;

图6是本发明多功能胎盘组织处理装置的造血细胞/组织收集器结构示意图,图中17表示锥形收集液接收器,18表示70微米漏网,19表示收集液导流管,20表处收集液乳胶管,21表示收集液止流阀。

图7是细胞活率及cd34阳性细胞表达率柱形图,图中a表示实施例1细胞活率柱形图,a表示常规方法细胞活率柱形图,b表示实施例1cd34阳性细胞表达率柱形图,a表示常规方法cd34阳性细胞表达率柱形图;

图8是细胞集落总数柱形图,图中a表示实施例1细胞集落总数柱形图,a表示常规方法细胞集落总数柱形图。

具体实施方式

具体实施方式一:本实施方式是利用多功能胎盘组织处理装置提取胎盘中造血干细胞的方法,具体是按以下步骤完成的:

一、清洗胎盘:

①、胎盘处理装置的处理器筒体8下端与清洗液接收器的锥形处理液接收器10上端螺纹连接在一起,将无菌采集的胎盘放入处理器筒体8中,将无菌生理盐水通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8;所述无菌生理盐水的体积与处理器筒体8的容积比为1:(16~40);所述胎盘的体积与处理器筒体8的容积比为1:(10~20);

②、以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,洗涤4min~6min;

③、从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀14,排除清洗液,关闭清洗液止流阀14,将无菌生理盐水通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8;所述无菌生理盐水的体积与处理器筒体8的容积比为1:(16~40);

④、以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,洗涤4min~6min;

⑤、从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀14,排除清洗液,关闭清洗液止流阀14,将质量分数为75%的酒精通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8;所述质量分数为75%的酒精的体积与处理器筒体8的容积比为1:(15~30);

⑥、以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,浸泡4min~6min;

⑦、从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀14,排除消毒后的酒精,将无菌生理盐水通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8;所述无菌生理盐水的体积与处理器筒体8的容积比为1:(16~40);

⑧、以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,洗涤4min~6min;

⑨、从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀14,排除清洗液,关闭清洗液止流阀14;

二、破碎胎盘:胎盘剪碎底座的底座15代替清洗液接收器的锥形处理液接收器10与胎盘处理装置的处理器筒体8螺纹连接在一起,将4℃的无菌生理盐水通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,然后以底座15与附有平台的电磁搅拌机2面接触形式置于多功能电动支架上,开启附有平台的电磁搅拌机2,驱动磁力剪切刀16转动,转速为80~100rpm,处理5min~6min;所述4℃的无菌生理盐水的体积与处理器筒体8的容积比为1:(80~100);

三、胎盘造血干细胞收集:

①、造血细胞/组织收集器的锥形收集液接收器17代替胎盘剪碎底座的底座15与胎盘处理装置的处理器筒体8螺纹连接在一起,以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开收集液止流阀21,收集富含造血干细胞的单细胞悬液,关闭收集液止流阀21;

②、将胎盘组织酶解液通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8,然后以处理器筒体8横放形式将连接管6和收集液导流管19分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,处理10min~15min,从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开收集液止流阀21,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;所述胎盘组织酶解液中溶剂为pbs缓冲液,溶质为低分子量肝素钠注射液、i型胶原酶、ⅱ型胶原酶、iv型胶原酶和胰蛋白酶-edta,且低分子量肝素钠注射液的浓度为(2~30)iu/ml,i型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,ⅱ型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,iv型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,胰蛋白酶-edta的浓度为(0.05~0.25)mg/ml;所述胎盘组织酶解液的体积与处理器筒体8的容积比为1:(20~40);

③、将胎盘组织酶解液通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8,然后以处理器筒体8横放形式将连接管6和收集液导流管19分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以40~60rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,处理10min~15min,从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开收集液止流阀21,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;所述胎盘组织酶解液中溶剂为pbs缓冲液,溶质为低分子量肝素钠注射液、i型胶原酶、ⅱ型胶原酶、iv型胶原酶和胰蛋白酶-edta,且低分子量肝素钠注射液的浓度为(2~30)iu/ml,i型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,ⅱ型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,iv型胶原酶的浓度为(0.05~0.5)mg/ml,胰蛋白酶-edta的浓度为(0.05~0.25)mg/ml;所述胎盘组织酶解液的体积与处理器筒体8的容积比为1:(20~40);

④、将pbs缓冲液通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8,以处理器筒体8横放形式将连接管6和收集液导流管19分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以40~60rpm的速度逆时针转动,处理4min~6min;从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开收集液止流阀21,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;所述pbs缓冲液的体积与处理器筒体8的容积比为1:(10~20);

⑤、合并步骤三①~④收集的富含造血干细胞的单细胞悬液,即完成胎盘组织酶解分离干细胞提取;

所述多功能胎盘组织处理装置包括多功能电动支架、胎盘处理装置、清洗液接收器、胎盘剪碎底座和造血细胞/组织收集器;

所述多功能电动支架包括第一皮带1、附有平台的电磁搅拌机2、第二皮带3和电动控制器4,附有平台的电磁搅拌机2设置在电动控制器4上,第一皮带1和第二皮带3设置在电动控制器4两侧,在第一皮带1和第二皮带3上均设置弧形部,第一皮带1和第二皮带3同步逆时针轴向转动,但第一皮带1和第二皮带3上下移动呈反向;

所述胎盘处理装置包括封闭硅胶帽5、连接管6、处理器盖7、处理器筒体8和两个挡板9,连接管6设置在处理器盖7顶部,连接管6的端口设置封闭硅胶帽5,处理器盖7的下端与处理器筒体8上端通过螺纹连接在一起,两个挡板9相对设置在处理器筒体8内壁上;

所述清洗液接收器包括锥形处理液接收器10、200微米漏网11、清洗液导流管12、清洗液乳胶管13和清洗液止流阀14,200微米漏网11设置在锥形处理液接收器10内,在锥形处理液接收器10底端设置清洗液导流管12,清洗液导流管12末端密封连接清洗液乳胶管13,在清洗液乳胶管13上设置清洗液止流阀14;

所述胎盘剪碎底座包括底座15和磁力剪切刀16,底座15上端开口、下端封闭,在底座15内底部上设置磁力剪切刀16;

所述造血细胞/组织收集器包括锥形收集液接收器17、70微米漏网18、收集液导流管19、收集液乳胶管20和收集液止流阀21;70微米漏网18设置在锥形收集液接收器17内,在锥形收集液接收器17底端设置收集液导流管19,收集液导流管19末端密封连接收集液乳胶管20,在收集液乳胶管20上设置收集液止流阀21;

当多功能胎盘组织处理装置用于清洗胎盘时,胎盘处理装置的处理器筒体8下端与清洗液接收器的锥形处理液接收器10上端螺纹连接在一起,以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;

当多功能胎盘组织处理装置用于破碎胎盘时,胎盘处理装置的处理器筒体8下端与胎盘剪碎底座的底座15上端螺纹连接在一起,以底座15与附有平台的电磁搅拌机2面接触形式置于多功能电动支架上;

当多功能胎盘组织处理装置用于胎盘造血细胞/组织收集时,胎盘处理装置的处理器筒体8下端与造血细胞/组织收集器的锥形收集液接收器17上端螺纹连接在一起,以处理器筒体8横放形式将连接管6和收集液导流管19分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上。

具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一的不同点是:所述第一皮带1弧形部的直径为20cm,第二皮带3弧形部直径为20cm。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是:所述附有平台的电磁搅拌机2的平台直径为20cm。其他与具体实施方式一或二之相同。

具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是:所述处理器盖7下端设置内螺纹,且直径为20cm;处理器筒体8的上下均设置外螺纹,且直径为20cm,高为25cm。其他与具体实施方式一至三之相同。

具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是:所述锥形处理液接收器10上端设置内螺纹,且直径为20cm;锥形收集液接收器17上端设置内螺纹,且直径为20cm。其他与具体实施方式一至四之相同。

具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是:所述两个挡板9呈长方形,且长为10cm,宽为4cm。其他与具体实施方式一至五之相同。

具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是:所述底座15的上端设置内螺纹,且直径为20cm。其他与具体实施方式一至六之相同。

具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是:所述磁力剪切刀16呈十字交叉,且长为8cm,高为3cm。其他与具体实施方式一至七之相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容,其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

采用下述试验验证本发明效果

实施例1:利用多功能胎盘组织处理装置提取胎盘中造血干细胞的方法,具体是按以下步骤完成的:

一、清洗胎盘:

①、胎盘处理装置的处理器筒体8下端与清洗液接收器的锥形处理液接收器10上端螺纹连接在一起,将无菌采集的500ml胎盘放入处理器筒体8中,将250ml无菌生理盐水通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8;

②、以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以50rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,洗涤5min;

③、从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀14,排除清洗液,关闭清洗液止流阀14,将250ml无菌生理盐水通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8;

④、以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以50rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,洗涤5min;

⑤、从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀14,排除清洗液,关闭清洗液止流阀14,将250ml质量分数为75%的酒精通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8;

⑥、以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以50rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,浸泡5min;

⑦、从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀14,排除消毒后的酒精,将250ml无菌生理盐水通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8;

⑧、以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以50rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,洗涤5min;

⑨、从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开清洗液止流阀14,排除清洗液,关闭清洗液止流阀14;

二、破碎胎盘:胎盘剪碎底座的底座15代替清洗液接收器的锥形处理液接收器10与胎盘处理装置的处理器筒体8螺纹连接在一起,将100ml4℃的无菌生理盐水通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,然后以底座15与附有平台的电磁搅拌机2面接触形式置于多功能电动支架上,开启附有平台的电磁搅拌机2,驱动磁力剪切刀16转动,转速为90rpm,处理5min;

三、胎盘造血干细胞收集:

①、造血细胞/组织收集器的锥形收集液接收器17代替胎盘剪碎底座的底座15与胎盘处理装置的处理器筒体8螺纹连接在一起,以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开收集液止流阀21,收集富含造血干细胞的单细胞悬液,关闭收集液止流阀21;

②、将200ml胎盘组织酶解液通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8,然后以处理器筒体8横放形式将连接管6和收集液导流管19分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以50rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,处理10min,从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开收集液止流阀21,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;所述胎盘组织酶解液中溶剂为pbs缓冲液,溶质为低分子量肝素钠注射液、i型胶原酶、ⅱ型胶原酶、iv型胶原酶和胰蛋白酶-edta,且低分子量肝素钠注射液的浓度为15iu/ml,i型胶原酶的浓度为0.2mg/ml,ⅱ型胶原酶的浓度为0.2mg/ml,iv型胶原酶的浓度为0.2mg/ml,胰蛋白酶-edta的浓度为0.1mg/ml;

③、将200ml胎盘组织酶解液通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8,然后以处理器筒体8横放形式将连接管6和收集液导流管19分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以50rpm的速度逆时针转动,同时处理器筒体8纵向移动,且第一皮带1向上移动时第二皮带3向下移动,处理10min,从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开收集液止流阀21,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;所述胎盘组织酶解液中溶剂为pbs缓冲液,溶质为低分子量肝素钠注射液、i型胶原酶、ⅱ型胶原酶、iv型胶原酶和胰蛋白酶-edta,且低分子量肝素钠注射液的浓度为15iu/ml,i型胶原酶的浓度为0.2mg/ml,ⅱ型胶原酶的浓度为0.2mg/ml,iv型胶原酶的浓度为0.2mg/ml,胰蛋白酶-edta的浓度为0.1mg/ml;

④、将200mlpbs缓冲液通过封闭硅胶帽5注入处理器筒体8内,密封处理器筒体8,以处理器筒体8横放形式将连接管6和收集液导流管19分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;开启电动控制器4,使处理器筒体8以50rpm的速度逆时针转动,处理5min;从多功能电动支架上取下处理器筒体8,并以封闭硅胶帽5在上形式竖直放置,打开收集液止流阀21,收集富含造血干细胞的单细胞悬液;

⑤、合并步骤三①~④收集的富含造血干细胞的单细胞悬液,即完成胎盘组织酶解分离干细胞提取;

所述多功能胎盘组织处理装置包括多功能电动支架、胎盘处理装置、清洗液接收器、胎盘剪碎底座和造血细胞/组织收集器;

所述多功能电动支架包括第一皮带1、附有平台的电磁搅拌机2、第二皮带3和电动控制器4,附有平台的电磁搅拌机2设置在电动控制器4上,第一皮带1和第二皮带3设置在电动控制器4两侧,在第一皮带1和第二皮带3上均设置弧形部,第一皮带1和第二皮带3同步逆时针轴向转动,但第一皮带1和第二皮带3上下移动呈反向;

所述胎盘处理装置包括封闭硅胶帽5、连接管6、处理器盖7、处理器筒体8和两个挡板9,连接管6设置在处理器盖7顶部,连接管6的端口设置封闭硅胶帽5,处理器盖7的下端与处理器筒体8上端通过螺纹连接在一起,两个挡板9相对设置在处理器筒体8内壁上;

所述清洗液接收器包括锥形处理液接收器10、200微米漏网11、清洗液导流管12、清洗液乳胶管13和清洗液止流阀14,200微米漏网11设置在锥形处理液接收器10内,在锥形处理液接收器10底端设置清洗液导流管12,清洗液导流管12末端密封连接清洗液乳胶管13,在清洗液乳胶管13上设置清洗液止流阀14;

所述胎盘剪碎底座包括底座15和磁力剪切刀16,底座15上端开口、下端封闭,在底座15内底部上设置磁力剪切刀16;

所述造血细胞/组织收集器包括锥形收集液接收器17、70微米漏网18、收集液导流管19、收集液乳胶管20和收集液止流阀21;70微米漏网18设置在锥形收集液接收器17内,在锥形收集液接收器17底端设置收集液导流管19,收集液导流管19末端密封连接收集液乳胶管20,在收集液乳胶管20上设置收集液止流阀21;

当多功能胎盘组织处理装置用于清洗胎盘时,胎盘处理装置的处理器筒体8下端与清洗液接收器的锥形处理液接收器10上端螺纹连接在一起,以处理器筒体8横放形式将连接管6和清洗液导流管12分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上;

当多功能胎盘组织处理装置用于破碎胎盘时,胎盘处理装置的处理器筒体8下端与胎盘剪碎底座的底座15上端螺纹连接在一起,以底座15与附有平台的电磁搅拌机2面接触形式置于多功能电动支架上;

当多功能胎盘组织处理装置用于胎盘造血细胞/组织收集时,胎盘处理装置的处理器筒体8下端与造血细胞/组织收集器的锥形收集液接收器17上端螺纹连接在一起,以处理器筒体8横放形式将连接管6和收集液导流管19分别置于多功能电动支架的第一皮带1和第二皮带3的弧形部上。

本实施例所述第一皮带1弧形部的直径为20cm,第二皮带3弧形部直径为20cm。

本实施例所述附有平台的电磁搅拌机2的平台直径为20cm。

本实施例所述处理器盖7下端设置内螺纹,且直径为20cm;处理器筒体8的上下均设置外螺纹,且直径为20cm,高为25cm。

本实施例所述锥形处理液接收器10上端设置内螺纹,且直径为20cm;锥形收集液接收器17上端设置内螺纹,且直径为20cm。

本实施例所述两个挡板9呈长方形,且长为10cm,宽为4cm。

本实施例所述底座15的上端设置内螺纹,且直径为20cm。

本实施例所述磁力剪切刀16呈十字交叉,且长为8cm,高为3cm。

重复实施例1操作,获取100份富含造血干细胞的单细胞悬液;采用现有常规方法,以无菌采集的500ml胎盘为初始原料,同样获取100份富含造血干细胞的单细胞悬液;统计有核细胞收获总量,实施例1有核细胞收获总量为(1-2)×1010个的比例为13.5%,有核细胞收获总量(2-5)×1010个的比例为28.6%,有核细胞收获总量>5×1010个的比例为57.9%,cd34阳性造血干细胞数量均值达3.2×108个以上;常规方法如“从胎盘组织中提取造血干细胞用于造血干细胞库的新方法”有核细胞收获总量范围为(2~4)×109个,cd34阳性造血干细胞数量最多为2.8×107个。

对实施例1获取100份富含造血干细胞的单细胞悬液和常规方法获取100份富含造血干细胞的单细胞悬液进行细胞活率及cd34阳性细胞表达率统计,如图7所示,图7是细胞活率及cd34阳性细胞表达率柱形图,图中a表示实施例1细胞活率柱形图,a表示常规方法细胞活率柱形图,b表示实施例1cd34阳性细胞表达率柱形图,a表示常规方法cd34阳性细胞表达率柱形图;通过图7可知,由于柔和的切碎过程以及处理时间的缩短,通过本发明方法可有效提高有核细胞活率和cd34阳性细胞占比,与常规方法比较细胞活率平均上升7%,证明本发明方法比常规方法对细胞的损伤小;cd34阳性细胞占比达到0.54%以上,较常规方法比较cd34阳性细胞占比上升90%以上。

对实施例1获取100份富含造血干细胞的单细胞悬液和常规方法获取100份富含造血干细胞的单细胞悬液进行染菌率(微生物阳性率)统计,实施例1的染菌率为4.88%,而常规方法的染菌率达到28.13%,通过对比可知本发明可有效降低微生物阳性率。

取富含造血干细胞的单细胞悬液100微升进行红细胞裂解、洗涤、计数后加入人全系甲基纤维素基础培养基中37℃、5%co2饱和湿度环境下培养14~16天,用倒置显微镜下观察并记录结果,计算出每万个细胞可分化出的集落细胞数量。如图8所示,图8是细胞集落总数柱形图,图中a表示实施例1细胞集落总数柱形图,a表示常规方法细胞集落总数柱形图,通过图8证明本发明较传统方法获取的有核细胞中干/祖细胞含量多且功能保存完好,干/祖细胞的分化成血液细胞的能力强。

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