本发明涉及5号染色体上与水稻耐盐qtl紧密连锁的ssr标记的挖掘及应用，属于农业科学技术领域。
背景技术：
从进入21世纪后，科学技术以及工农业的迅速发展，使人们生活水平提高的同时，也带来了不容忽视的弊端，如气候变化、环境污染、土壤退化以及水土流失等。尤其是在我国，人口的不断增长，直接引起现有耕地面积的不断减少，同时也加剧了土壤的结构破坏与土地盐碱化。土壤盐碱化己成为全球农业化生产的一个日益严重的问题，不仅导致可利用耕地面积逐年减少，也使农作物的生长受到严重的影响。根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地面积有9.54亿hm2，分布在世界各大洲干旱地区。中国地域辽阔，气候多样，盐碱土分布也遍布各地，我国盐碱地面积为9913万hm2，仅次于澳大利亚、苏联，居世界第三位，我国盐碱地的分布区域主要集中在沿海地带以及东北、西北、华北的内陆地区。这些地区的盐碱土地成分也各不相同，主要是滨海盐碱土、平原盐碱土以及草原盐碱土，并有逐渐扩大的趋势。全球盐碱地的面积正在逐年增加，分布范围也在扩大。越来越多的农业用地受到盐碱胁迫并已严重影响我国的水稻产量，成为土壤盐碱化区域稳产的主要限制因素。
盐碱地的形成改变了土壤的结构成分，便会对植物产生盐胁迫。盐胁迫是指土壤中可溶性盐含量过多对植物生长发育所产生的危害。当土壤中盐含量过高时，便会给植物带来生理干旱、离子毒害、生理代谢紊乱等危害。水稻是一种对盐胁迫中度敏感的作物，盐胁迫成为盐碱稻区水稻正常生长的主要制约因素。研究发现，盐胁迫会严重影响水稻的生长发育，细胞代谢活性显著下降，内质网损坏和质壁分离，细胞质中高电子密度的蛋白质积累，光合作用和呼吸作用受到严重影响，最终导致产量损失甚至死亡。其中，粳稻耐盐性中等以上，而籼稻耐盐性较差，严重时播种后不能出苗。水稻作为重要的粮食资源，土壤盐渍化会对水稻生产的稳定发展带来严重的危害，从而影响我国的粮食安全。
目前，农业上治理盐碱地的方法主要有物理改良措施、水利改良措施、化学改良措施和生物改良措施四种。物理改良措施是指种植农作物前可通过平整土地、及时松土、微区改土等可提高土壤的渗水通气性，抑制水分的蒸发，也可掺入些客土或者砂石，改善土质，降低土壤的碱性。这些措施可有效促进盐碱地土壤结构的改良与优化；水利改良措施是指对处于淡水河附近或地下水资源丰富的地区，可采用泡田洗盐的方法，挖沟引流，淡水灌溉，使土壤表层的盐分随水流入土壤深层，进而可使种植层达到作物生长的先决条件，还可通过机械排水、暗管排水、竖井排水等方法有效排出盐碱地的盐分；化学改良措施是指为了降低土壤的酸碱度与含盐量，提高土壤中微生物和酶的活性，可以向盐碱地中加入酸性盐类物质改变盐碱地的性质，对于碱化土壤可加入含钙物质置换土壤胶体表面吸附的钠，石膏作为一种传统的化学改良剂，不仅可降低土壤的碱化度、ph值以及土壤的坚实度，还可提高土壤的渗透速率以及脱盐率，同时，为了更好地改善盐碱土土壤性质，可将石膏、粉煤灰与糠醛澄混合得到组合改良剂，能更好的提高土壤的渗透速度与总孔隙度，此外，改良盐碱土还可用工业副产品硫酸，也可取得明显的效果；生物改良措施主要包括提高盐碱地植物的耐盐能力，引进耐盐植物以及培育耐盐新品种和转抗盐基因作物三种方法，国内外多项研究表明，通过生物措施进行改良、开发和利用盐碱地是目前最有效的途径。美国学者通过种植盐生植物来控制土壤中的盐分。澳大利亚科学家在澳洲沿海地区发现了名为滨藜的盐生灌木，该植物喜盐，具有降水，吸收土壤盐分的作用，运用生物方法降水排盐，并结合畜牧业，休耕免耕相结合等措施，使澳大利亚的盐碱地改良步入可持续发展的轨道。另外，巴基斯坦也注意到种植耐盐植物，不仅成本低，而且收效快，可达到盐碱地改良与利用相结合的目的。
四种盐碱地治理方法相比，培育和种植耐盐植物的生物治理方法是修复盐碱化土地改善板结土壤生态，发展农业生产，增加农民收入，推动农业经济可持续发展的最直接、有效、同时具有投资小见效快的最有效措施。为了改良与充分利用盐碱地，中国也选育出了小麦、花生等耐盐农作物，刺槐、怪柳等耐盐能力较强的树种，另外，水稻也是改良盐碱地的先锋作物，可以有效地将重度盐碱地改良为中、轻度盐碱地。但目前公开报道的耐盐碱种质资源较少。因此，开展盐碱地水稻品种资源的筛选和耐盐水稻品种的培育和种植，在盐碱地种植耐盐水稻品种结合栽培措施的优化，对于发展盐碱地农业，有效治理盐碱地，促进农民增收，都将起到积极作用。
传统的育种技术如杂交、理化诱变、组织培养和远缘杂交等，已被广泛用于水稻耐盐性的改良。由于水稻耐盐性是多种耐盐生理生化反应的综合表现，是由多个基因控制的数量性状，遗传基础复杂，采用传统育种方法改良水稻耐盐性的难度较大，进展缓慢。利用分子标记辅助选择和基因工程技术可以加快水稻耐盐品种培育的进程。因此，鉴定水稻耐盐主效数量性状位点（qtl）、克隆耐盐关键基因、解析水稻耐盐机理至关重要，可以为利用分子设计育种技术培育优异耐盐品种奠定基础。
技术实现要素：
本发明从一个优良的水稻耐盐品种海湘030材料内挖掘到了在5号染色体上与水稻耐盐qtl紧密连锁的两个ssr标记，通过检测5号染色体上该2个引物标记的带型数据，可以预测该植株的耐盐性，大大加快了耐盐水稻的筛选效率，从而加快了水稻耐盐育种进程。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
5号染色体上与水稻耐盐qtl紧密连锁的ssr标记的挖掘及应用，其特征在于：用ssr标记rm593引物：seqidno.1/seqidno.2，或者用ssr标记rm574引物：seqidno.3/seqidno.4扩增水稻耐盐鉴定材料，如果用ssr标记rm593引物：seqidno.1/seqidno.2能够扩增出205bp的扩增片段，或用ssr标记rm574引物：seqidno.3/seqidno.4能够扩增出160bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻材料内存在耐盐位点qpfw-2。
所述水稻优良耐盐资源的qtl挖掘包含以下步骤：
（1）以水稻优良耐盐资源海湘030为母本，盐敏感水稻品种连粳4号为父本，配制杂种f1，构建了包含189个单株的f2分离群体，f2单株自交获得f2:3家系；
（2）对f2:3家系采用稻池盐害鉴定方法，检测指标选择水稻分蘖盛期时植株鲜重（plantfreshweight，pfw），获得各个家系和亲本的耐盐指数；
（3）采用sds粗提法提取亲本、f1及f2:3定位群体单株的dna，用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的368对ssr引物，对亲本、f1及f2:3定位群体进行pcr扩增，检测多态性引物，用筛选到的162对多态性ssr引物检测f2:3家系；
（4）根据f2:3家系各单株ssr引物多态性检测结果和耐盐表型参数，用mapmaker/exp3.0软件进行ssr标记的定位连锁分析，利用kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离（cm），采用基于复合区间作图法软件windowsqtlcartographerv2.5检测水稻耐盐qtl，lod值的阈值定为2.0，按p＝0.005概率值检测抗性qtl的数目及其在染色体上的位置；
（5）获得水稻优良耐盐资源海湘030耐盐qtl位点qpfw-2，位于第5号染色体分子标记rm593与rm574之间，通过检测5号染色体上该2个引物标记的带型数据，可以预测该植株的耐盐性，加快了耐盐水稻的筛选效率。
所述的扩增耐盐位点qpfw-2的ssr标记引物选自ssr标记rm593引物：seqidno.1/seqidno.2和ssr标记rm574引物：seqidno.3/seqidno.4。
所述的稻池盐害鉴定方法具体方案为：
（1）盐池准备：采用不锈钢材料建造盐池，盐池为高35cm、宽35cm、长2.5m的长槽，底部和周围均密封，长槽周边采用钢筋焊接固定，将非盐化泥土粉碎、过筛后晒干，每个盐池均加入等量200kg的非盐化泥土，分别设置盐害处理组和对照组，盐害处理组采用0.5%的nacl盐溶液80kg浸土，对照组采用等量普通自来水浸土；
（2）将催芽后的水稻种子播于盐池中：将待鉴定水稻材料一起浸种、发芽，取出出芽一致的供试材料分别播种于盐害处理组和对照组中的盐池中，每槽种植2行，行距10cm，点播间距8cm，每份材料点播50粒，生产管理方式采用常规直播栽培管理方式，不移栽；待水稻分蘖盛期时将植株挖出，洗净根部泥土，控水后分别称量每份材料盐害组和对照组植株鲜重（plantfreshweight，pfw），每份材料盐害组和对照组各称量30株；
（3）计算耐盐指数：计算每份材料的pfw平均值，进一步计算耐盐指数，耐盐指数=盐害处理组单株鲜重均值/对照处理组单株鲜重均值；用每份材料的耐盐指数作为定位群体的表型参数。
所述的对亲本、f1及f2:3定位群体进行pcr扩增的pcr反应体系为：总体积为20µl，反应液组成为10×pcrbuffer（200mmol/ltris-hclph8.0，500mmol/lkcl，15mmol/lmgcl2，stabilizers）2µl，10mmol/ldntps1.2µl，引物各50ng，基因组dna50ng，1.0utaqdna聚合酶，补水至20µl；pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，55℃退火复性1min，72℃延伸50-90s，共35个循环；最后72℃保温10min；扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）银染检测。
所述的应用指的是在滨海滩涂盐土地、内陆盐土地、黄淮海平原盐土地、松嫩平原盐碱土地和青新漠境盐土地的水稻种植与新品种培育。
本发明所提供的5号染色体上与水稻耐盐qtl紧密连锁的ssr标记的挖掘及应用，具有以下优点：
（1）本发明采用稻池盐害鉴定方法，选择水稻分蘖盛期时植株鲜重作为检测指标，通过对水稻分蘖盛期时植株鲜重与成熟期水稻材料产量的耐盐性对应性分析发现，选择水稻分蘖盛期时植株鲜重作为检测指标，其耐盐性差异与产量差异非常吻合，而表型鉴定时间大大缩短；
（2）本发明ssr标记定位的水稻耐盐qtl位点位置明确，鉴定方便。本发明通过检测5号染色体上两个引物标记的带型数据，可以预测该植株的耐盐性，加快了耐盐水稻的筛选效率，加快了水稻耐盐育种进程。
附图说明
图1所示5号染色体上与水稻耐盐qtl紧密连锁的ssr标记在染色体上的位置。
图2应用5号染色体上与水稻耐盐qtl紧密连锁的ssr标记预测植株水稻耐盐性的电泳图谱。m：mark；1：海湘030；2：连粳4号；3：f1；4-9：耐盐子代；10-15：盐敏感子代。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。
实施例1
2015年4月初，选择多年大田种植初步判断耐盐差异明显的12个水稻品种在东辛农场温室内进行进行稻池盐害鉴定，检测指标分别选择水稻3叶期、分蘖盛期、抽穗期时植株鲜重、熟期单株产量，获得12个水稻品种的耐盐指数。
稻池盐害鉴定方法为：（1）盐池准备：采用不锈钢材料建造盐池，盐池为高35cm、宽35cm、长2.5m的长槽，底部和周围均密封，长槽周边采用钢筋焊接固定，将非盐化泥土粉碎、过筛后晒干，每个盐池均加入等量200kg的非盐化泥土，分别设置盐害处理组和对照组，盐害处理组采用0.5%的nacl盐溶液80kg浸土，对照组采用等量普通自来水浸土；
（2）将催芽后的水稻种子播于盐池中：将待鉴定水稻材料一起浸种、发芽，取出出芽一致的供试材料分别播种于盐害处理组和对照组中的盐池中，每槽种植2行，行距10cm，点播间距8cm，每份材料点播200粒，生产管理方式采用常规直播栽培管理方式，不移栽；每份材料盐害处理组和对照组分别在水稻3叶期、分蘖盛期、抽穗期时各挖取30株，洗净根部泥土，控水后分别称量每份材料盐害组和对照组在水稻3叶期、分蘖盛期、抽穗期时的植株鲜重（plantfreshweight，pfw），待鉴定材料结实后，每份材料再分别计算单株产量；
（3）计算耐盐指数：计算每份材料在水稻3叶期、分蘖盛期、抽穗期时的pfw平均值和单株产量均值，进一步计算每份材料在这四个时期的耐盐指数，耐盐指数=盐害处理组pfw或单株产量均值/对照处理组pfw或单株产量均值，12份材料在不同时期的耐盐指数测量值如下表1。
根据表1，通过对比3叶期时12份水稻材料的盐害处理组与对照处理组pfw可以发现，不同水稻材料盐害处理组与对照处理组pfw对比获得的耐盐指数差异并不大，因此，在水稻盐害处理的幼苗期通过对比植株鲜重获得的耐盐指数并不是分析水稻材料耐盐性的优良时期。而当植株生长到水稻分蘖盛期后，不同水稻材料之间的植株鲜重差异明显，耐盐指数差异较大，分蘖盛期获得的耐盐指数与成熟期测量盐害组和对照组单株产量进而计算得的耐盐指数具有良好的对应关系，反映出分蘖盛期进行检测盐害组和对照组单株鲜重差异获得的耐盐指数是区别不同水稻材料耐盐性的良好时期，虽然水稻进行生长至抽穗期测量水稻单株鲜重获得的耐盐指数一致性也良好，但选择分蘖盛期进行表型鉴定无疑大大缩短了试验时间。
实施例2
2015年正季，选择优良的水稻耐盐品种海湘030为母本，盐敏感品种连粳4号为父本，杂交获得杂种f1，2016年海南南繁加代，构建了包含189个单株的f2分离群体，2016年正季f2单株自交获得f2:3家系。
2017年5月对f2:3家系采用稻池盐害鉴定方法，检测指标选择水稻分蘖盛期时植株鲜重（plantfreshweight，pfw），6月份水稻材料生长至分蘖盛时调查获得各个家系和亲本的耐盐指数。
取海湘030×连粳4号亲本、f1及f2:3定位群体的叶片，采用sds粗提法提取dna，用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的368对ssr引物，对亲本、f1及f2:3定位群体进行pcr扩增（pcr扩增的pcr反应体系为：总体积为20µl，反应液组成为10×pcrbuffer（200mmol/ltris-hclph8.0，500mmol/lkcl，15mmol/lmgcl2，stabilizers）2µl，10mmol/ldntps1.2µl，引物各50ng，基因组dna50ng，1.0utaqdna聚合酶，补水至20µl；pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，55℃退火复性1min，72℃延伸50-90s，共35个循环；最后72℃保温10min；扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）银染检测），检测多态性引物，共筛选出162对多态性引物，用筛选到的多态性ssr引物检测f2:3家系。
根据f2:3家系各单株ssr引物多态性检测结果和耐盐表型参数，用mapmaker/exp3.0软件进行ssr标记的定位连锁分析，利用kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离（cm），采用基于复合区间作图法软件windowsqtlcartographerv2.5检测水稻耐盐qtl，lod值的阈值定为2.0，按p＝0.005概率值检测抗性qtl的数目及其在染色体上的位置。
在5号染色体上检测到1个水稻耐盐qtl，lod值为3.71，贡献率为19.9%，命名为qpfw-2，位于位于第5号染色体分子标记rm593与rm574之间，如图1。
用ssr标记rm593引物或者用ssr标记rm574引物扩增水稻耐盐鉴定材料，如果用ssr标记rm593引物能够扩增出205bp的扩增片段，或用ssr标记rm574引物能够扩增出160bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻材料内存在耐盐位点qpfw-2，如图2。
通过检测5号染色体上该2个引物标记的带型数据，可以预测该植株的耐盐性，加快了耐盐水稻的筛选效率，加快了水稻耐盐育种进程。
上述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
序列表
<110>江苏强农农业技术服务有限公司
<120>5号染色体上与水稻耐盐qtl紧密连锁的ssr标记的挖掘及应用
<160>4
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<213>人工序列(artificialsequence)
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