本发明属于黄芪多糖活性研究领域，涉及抗肿瘤活性的研究，尤其是一种黄芪醇溶低聚糖及其制备方法及其在抗肿瘤中的应用。
背景技术：
黄芪多糖具有多种生物功能，如调节免疫、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗炎、抗病毒、肝保护、抗动脉粥样硬化、造血和神经保护。黄芪多糖的来源广，毒副作用低，体内无残留，无耐药性，因此在药品和营养食品领域黄芪多糖具有很大的发展前景。
黄芪多糖的分离提取方法较多。目前黄芪多糖的提取技术主要有水煮提取法、碱水提取法、超声波、微波辅助萃取法等，其中采用较多的是水溶醇沉法，将乙醇不溶的多糖进行分离纯化，并研究其各种生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化和抗菌等。但是这种方法所得到的多糖得率低、分子量分布广泛、无生物活性的组分含量较高，且水溶性较差。然而，对溶解于乙醇的低分子量多糖，在过去的研究和开发中未被重视，造成资源浪费。
本发明在水溶醇沉法被抛弃的乙醇内发现了一种分子量分布非常均匀的低聚糖，该低聚糖组成简单，水溶性好，通过动物实验发现其具有显著地体内增强免疫和抗肿瘤的生物活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有的水溶醇沉技术中多糖结构复杂，得率和活性低等不足，提供一种黄芪醇溶抗肿瘤低聚糖及其制备方法，所得低聚糖结构简单，生物活性强，生产质量高。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种黄芪醇溶低聚糖，该低聚糖为α-吡喃聚糖。
一种黄芪醇溶低聚糖的制备方法，步骤如下：
(1)将黄芪根切片加入到的蒸馏水中，室温浸泡，抽滤，取上清，离心，弃沉淀，经真空旋转蒸发仪进行浓缩，得到黄芪浓缩液；
(2)向步骤(1)得到的浓缩液中，加入无水乙醇溶液，混匀后冰箱放置过夜，离心，弃沉淀后再次旋蒸去除乙醇，再利用透析袋进行透析，冻干后得到黄芪醇溶低聚糖。
而且，步骤(1)室温浸泡12～24h。
而且，步骤(1)离心后的滤渣经过2～4次重复提取，与第一次提取的上清液混合再浓缩。
而且，步骤(2)所述冰箱温度设置为3～6摄氏度。
而且，步骤(2)所述透析袋为1000da透析袋。
一种黄芪醇溶低聚糖在抗肿瘤领域的应用。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明提供了一种黄芪醇溶低聚糖，该低聚糖为α-吡喃聚糖，分子量为2107da，具有典型的多糖特征，含有少量糖醛酸，极少量的蛋白质，单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖(1.00：1.60：4.90：3.02)，经小鼠体内抗肿瘤实验得到其200mg/kg的灌胃剂量时对h22荷瘤小鼠抑瘤率可达52.22％。
2、本发明高效利用了水溶醇沉工艺中的醇溶废弃物，对其中的低聚糖进行提取分离，结果表明这部分醇溶低聚糖不仅得率高，而且结构简单，生物活性强，生产质量高。
附图说明
图1为本发明黄芪醇溶低聚糖的红外光谱图；
图2为本发明黄芪醇溶低聚糖的高效液相色谱图；
图3(a)为单糖及糖醛酸标品的离子色谱图；
图中：1.岩藻糖2.阿拉伯糖3.半乳糖4.葡萄糖5.甘露糖6.木糖7.果糖8.半乳糖醛酸9.葡萄糖醛酸
图3(b)为黄芪醇溶低聚糖的离子色谱图；
图中：1.阿拉伯糖2.半乳糖3.葡萄糖4.甘露糖5.半乳糖醛酸6.葡萄糖醛酸
图4为本发明黄芪醇溶低聚糖的质谱检测图；
图5为本发明黄芪醇溶低聚糖的的1h谱；
图6为本发明黄芪醇溶低聚糖的的13c谱；
图7为本发明黄芪醇溶低聚糖对小鼠体重的影响；
图8(a)为本发明黄芪醇溶低聚糖对小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响(cd3/cd19散点图)；
图8(b)为本发明黄芪醇溶低聚糖对小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响(cd4/cd8散点图)；
图9为本发明黄芪醇溶低聚糖对小鼠胸腺淋巴细胞亚群的影响；
图10(a)为小鼠胸腺的h&e染色(4x)(空白组)；
图10(b)为小鼠胸腺的h&e染色(4x)(模型组)；
图10(c)为小鼠胸腺的h&e染色(4x)(低剂量组)；
图10(d)为小鼠胸腺的h&e染色(4x)(高剂量组)；
图11(a)为小鼠脾脏的h&e染色(4x)(空白组)；
图11(b)为小鼠脾脏的h&e染色(4x)(模型组)；
图11(c)为小鼠脾脏的h&e染色(4x)(低剂量组)；
图11(d)为小鼠脾脏的h&e染色(4x)(高剂量组)；
图12为黄芪醇溶低聚糖对nk细胞活性的影响；
图13为黄芪醇溶低聚糖对荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种黄芪醇溶抗肿瘤低聚糖的制备方法，将黄芪根切片100g置于1000ml蒸馏水中，室温浸泡12h，抽滤，取上清，3500r/min离心15min，弃沉淀。对抽滤后的滤渣再次提取一次，步骤同上，将两次得到上清液混合后，经旋转蒸发仪50℃真空条件下进行浓缩，得到黄芪浓缩液，待其冷却至室温后，加入4倍体积的无水乙醇，混匀后4℃冰箱放置过夜，最后3500r/min离心15min，弃沉淀后将上清再次旋蒸去除乙醇，而后利用1000da纤维素透析袋低温条件下进行透析48h以除掉小分子单糖等无生物活性的物质，最后经过冻干，制得黄芪醇溶低聚糖。
采用考马斯亮蓝法检测黄芪醇溶低聚糖中的蛋白含量，计算得黄芪醇溶低聚糖中的蛋白质含量为0.5％。采用咔唑硫酸比色法测定黄芪醇溶低聚糖中的糖醛酸含量，计算得黄芪醇溶低聚糖中的糖醛酸含量为10.67％。
使用傅里叶红外光谱仪分析多糖结构，结果如图1所示。图中可以看出样品在波长为3405、2927和1420cm-1处分别为羟基吸收峰，c-h伸缩振动峰和c-h弯曲振动峰，为多糖具有的特征吸收峰，说明该检测样品具有明显的多糖特征。1676cm-1和1630cm-1处为o-h弯曲振动峰；在波长为1138cm-1和1050cm-1处的吸收峰分别为多糖分子中的c-o-c和c-o-h伸缩振动峰，表明样品分子中存在c-o键，即表明样品分子中存在吡喃糖环；923cm-1为糖的吡喃环振动，在866cm-1的吸收峰为α-型吡喃醛糖环的g-h直立键的吸收峰。以上结果初步得出该黄芪醇溶低聚糖为α-型吡喃糖。
使用高效液相色谱法检测黄芪醇溶低聚糖的分子量，结果如图2所示。由图可以看出，多糖样品吸收峰的出峰时间为17.806min，且只有一个峰，说明黄芪醇溶低聚糖为分子量均一的纯化糖，根据标准公式计算黄芪醇溶低聚糖的分子量约为2000da。
使用离子色谱仪分析多糖中的单糖组分，结果如图3所示。图3(a)为单糖及糖醛酸标品的离子色谱图，其出峰顺序从左至右依次为：岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。图3(b)为黄芪醇溶低聚糖的离子色谱图，对比图3(a)，结果显示黄芪醇溶低聚糖的单糖组成为：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，且样品中各个单糖的摩尔比为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：甘露糖＝1.00：1.60：4.90：3.02。
由于液相所采用的葡聚糖t系列标品分子量较大，因此采用maldi-tof质谱仪进一步测定多糖分子量，结果如图4所示。多糖不容易离子化，因此采用强度较大的激光，从而使得多糖更加容易形成[m+h]。图4中在m/z2107处有一个强吸收峰，说明黄芪醇溶低聚糖的分子量为2107da。
通过1h核磁共振波谱和13c核磁共振波谱分析多糖的h原子和c原子分布，从而推断多糖可能的结构。nmr分析的结果如图5和图6所示。
图5为多糖的1h谱。一般来说多认为糖的异头质子的信号峰主要在δ为4.3-5.9区域，α-糖苷异头碳的质子信号在δ为5.0-6.0区域。图中在δ为5.325和5.335处有两个较弱的信号峰，说明多糖中存在α型吡喃糖，这与红外的结果相吻合；δ为4.723处为d2o的溶剂峰，可能由于多糖溶液中的多糖浓度较低，导致溶剂峰的强度较大；δ为3.5-4.1处可能为2h-5h的信号峰区域。
图6为多糖的13c谱。从图中可以看到多糖的13c谱的信号峰区域主要在δ为60-110之间，相较于1h谱，其信号范围更广。一般来说，13c谱的异头碳信号峰的区域主要在δ为90-110之间。图中可以看出多糖在90-110范围之间有5个主要的信号峰，在98-103区域范围内，为α-吡喃糖的异头碳信号峰区域，表示多糖中存在α型吡喃糖，与红外和1h谱的结果相吻合；675之间为多糖的c2-c5重叠区域，其中，60-62之间是c6的信号峰。
对黄芪醇溶低聚糖的体内抗肿瘤作用分析如下：
一、小鼠的基本生理指标采集
1、体重变化
将小鼠分为空白组、模型组、低剂量组和高剂量组，连续灌胃两周之后，在每只小鼠的右下肢腋下注射接种h22肝癌细胞，继续灌胃4周，试验期间，每5天称重一次，结果如图7所示，灌胃前两周各组之间小鼠体重缓慢上升，各组没有明显的差异，小鼠毛发和进食情况也基本相似，这说明黄芪醇溶低聚糖没有对小鼠身体健康造成不良影响；然而灌胃2周后，模型组小鼠的体重较空白组小鼠明显升高，这可能是由于肿瘤细胞的恶性增殖，使肿瘤的体积增大，从而造成体重的大幅增长；而灌胃组(低剂量组和高剂量组)的小鼠由于灌胃多糖抑制了肿瘤的增长，因此灌胃组小鼠的体重增长趋势更加接近于空白组。这说明黄芪醇溶低聚糖可以一定程度上维持小鼠生理指标的稳定，抑制肿瘤的增长。
2、肿瘤体积变化
小鼠灌胃2周后，接种h22肿瘤细胞，待出现可接触的实体瘤后，每隔1天用游标卡尺测量肿瘤长度和宽度，按照公式计算肿瘤体积，结果如表1所示。接瘤6天后，模型组的小鼠首先出现可以触摸到的肿瘤，而灌胃组小鼠出现的时间较模型组小鼠的晚，随着天数的增加，模型组的肿瘤体积大幅组增长，并且增长速度越来越快，灌胃组小鼠的实体瘤有的没有出现，有的出现后，体积增长较慢，后期的增长速度缓慢，有的甚至出现消退现象，这说明黄芪醇溶低聚糖可以一定程度上抑制肿瘤增长，延缓肿瘤出现的时间。
表1黄芪醇溶低聚糖对小鼠平均肿瘤体积和抑瘤率的影响
注：a与模型组相比较(p<0.05)
3、小鼠胸腺指数和脾脏指数的变化
免疫器官对体内抗肿瘤发挥着重要的作用。脾脏是人体最大的外周免疫器官，含有大量重要的免疫细胞和免疫因子。胸腺是细胞免疫的重要器官，是t细胞成熟的重要场所。因此这两种器官形态的变化一定程度上可以反映小鼠的身体状况和免疫反应状况，脾脏指数和胸腺指数可以一定程度上反应脾脏和胸腺的状态。
小鼠眼球取血，脱颈处死后，取脾脏和胸腺分别称重并记录，计算脾脏指数和胸腺指数，结果如表2所示。由表可知，模型组小鼠的脾脏指数较空白组明显升高(p<0.05)，胸腺指数则降低(p<0.05)，这可能是由于肿瘤增长损害了小鼠的免疫器官，导致的小鼠脾脏肿大和炎症，胸腺萎缩。灌胃组小鼠的脾脏指数较空白组虽然也出现升高现象(p<0.05)，但肿大情况较模型组明显改善，这表明灌胃多糖可以改善小鼠脾脏的肿大和炎症。而多糖灌胃组小鼠的胸腺指数较空白组小鼠降低(p<0.05)，但是较模型组升高(p<0.05)，这表明黄芪醇溶低聚糖可以一定程度上保护小鼠的免疫器官，降低肿瘤对机体的损害。
表2黄芪醇溶低聚糖对小鼠脏器指数的影响
注：a与模型组相比较(p<0.05)；b与空白组相比较(p<0.05)
二、小鼠血液指标分析
1、小鼠血常规检测
全细胞血液分析仪分析小鼠血细胞的变化，从而判断黄芪醇溶低聚糖对小鼠健康状况的影响，结果如表3所示。从表中可以看出各组小鼠的白细胞，红细胞，血红蛋白和血小板总数均无统计学差异，这说明黄芪醇溶低聚糖对小鼠的健康状况没有影响，不会对宿主动物产生毒害作用。
表3黄芪醇溶低聚糖对小鼠血常规的影响
2、小鼠外周血淋巴细胞亚群分析
癌症的免疫疗法主要是通过刺激免疫细胞，进而提高机体免疫力，达到杀死癌细胞，控制肿瘤扩散的目的。人体内主要的免疫细胞为淋巴细胞，而且不同的淋巴细胞可以与不同的单克隆抗体结合。其中fitc-cd3+抗体标记所有的t细胞，pe-cd19+抗体标记所有的b细胞。而t淋巴细胞根据其表面分子不同，可以进一步分为细胞毒性t细胞和辅助性t细胞，分别与pe-cd8+和fitc-cd4+结合。因此，我们采用流式细胞术检测小鼠外周血中淋巴细胞亚群的比例，分析结果如图8所示。
在图8(a)的cd3/cd19散点图中，左上角和右下角的象限分别代表cd3+和cd19+的双染阳性细胞，在图8(b)的cd4/cd8散点图中，左上角和右下角的象限分别代表cd4+和cd8+的双染阳性细胞。t细胞亚群分布如表4所示。由表4中数据可以看出模型组和灌胃组的cd3+细胞较空白组显著降低，灌胃组的cd3+细胞略有回升，这可能是由于肿瘤细胞的增殖和转移损害了小鼠的免疫系统，导致小鼠的t淋巴细胞分泌减少。另外，模型组和灌胃组的cd4+细胞明显低于空白组，并且灌胃组的降低幅度减小，甚至高剂量组虽较空白组仍有显著差异，但较模型组显著回升(p<0.05)；模型组和灌胃组的cd8+细胞较空白组显著降低，并且灌胃组的cd8+细胞数量较模型组数量略有回升(p<0.05)；模型组的cd19+细胞相对于空白组明显升高(p<0.05)，这可能是由于肿瘤的增长，而灌胃组的cd19+细胞相较于模型组明显降低，其中高剂量组cd19+细胞数量随较空白组仍有差异，但较模型组则明显降低(p<0.05)，这可能是由小鼠免疫系统损伤，导致b淋巴细胞的分泌增加，增强体液免疫，但是其活性可能下降，导致小鼠免疫应答变弱。
这些数据表明由于肿瘤的增长，小鼠的免疫系统遭到了极大的损害，然而黄芪醇溶低聚糖可以在一定程度上刺激t淋巴细胞和b淋巴细胞，保护免疫器官。
表4黄芪醇溶低聚糖对小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响
注：a与模型组相比较(p<0.05)；b与空白组相比较(p<0.05)
三、小鼠胸腺指标分析
胸腺是机体的主要的内分泌腺，也是维持机体正常的免疫平衡的重要器官。
1、小鼠胸腺淋巴细胞亚群分析
流式细胞术检测小鼠胸腺淋巴细胞亚群比例，结果如图9所示。
图9中，第一象限表示cd4+和cd8+双染阳性的细胞，为不成熟的t细胞，第二象限表示cd4染色阳性的细胞，为辅助性t细胞，图中的各个细胞团的分团情况良好，各个类型的细胞基本分团成功。模型组cd4+和cd8+t细胞比例较空白组明显减少，这可能是由于肿瘤细胞的增殖破坏了胸腺的结构，影响t细胞的分化，导致cd4+和cd8+t细胞比例减少；我们可以看到灌胃组的cd4+和cd8+t细胞虽然较空白组还是明显降低，但是较模型组升高，甚至cd4+t细胞比例出现显著的升高，t细胞的分化情况得到改善，这说明黄芪醇溶低聚糖可以有效的维持胸腺器官的正常功能。
表5黄芪醇溶低聚糖对小鼠胸腺淋巴细胞亚群的影响
注：a与模型组相比较(p<0.05)；b与空白组相比较(p<0.05)
2、小鼠胸腺组织h&e染色
人体的胸腺器官是叶状结构，由一层薄的结缔组织被膜包被。被膜内陷，将胸腺分成很多假小叶，其中每个假小叶都包含存在皮质(外部)和髓质(内部)。皮质中主要存在不成熟的或者正在发育的t细胞，髓质则是成熟的t细胞的主要存在部位。
小鼠脱颈法处死后，胸腺组织被取出并进行观察。结果显示空白组小鼠的胸腺较大，而模型组小鼠的胸腺明显比空白组的小，有的几乎没有，而灌胃组小鼠的胸腺虽然较空白组也出现萎缩，但较模型组其萎缩的程度较小。之后对小鼠胸腺组织进行石蜡包埋，然后切片进行h&e染色观察，结果如图10所示。图中可以看到模型组小鼠的胸腺的小叶分化不明显，皮质(深染)比例较空白组明显增加，髓质之间相互接连，没有可见的明显边界。而低剂量组小鼠胸腺的皮质区域虽然较空白组还是较大，但是髓质之间虽然仍出现轻微浸染的现象，但是较模型组界限明显，而高剂量组的皮质和髓质的比例虽和空白组仍感觉相差较大，但相对于模型组来说，得到了很大的改善，由此可以看出胸腺得到了有效的保护，因此黄芪低分子量多糖可以有效保护小鼠的胸腺。
四、小鼠脾脏指标分析
1、小鼠脾脏淋巴细胞亚群分析
脾脏是最大的外周淋巴器官，存在多种免疫细胞和免疫因子。
小鼠脾脏淋巴细胞亚群分析，结果如表6所示。模型组小鼠脾脏淋巴细胞较空白组小鼠均有显著差异，其中cd3+、cd4+、cd8+细胞比例均显著下降，而cd19+细胞比例显著上升。虽然低剂量组的cd3+细胞较比模型组显著升高，但与空白组小鼠相比还是有显著差异，而高剂量组cd3+细胞比例与空白组更相近；高剂量组cd19+细胞比例虽然较模型组略有降低，但无统计学差异；灌胃组的cd4+和cd8+细胞比例较模型组略有回升，但较空白组还是有一定的差异。
表6黄芪醇溶低聚糖对荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞亚群的影响
注：a与模型组相比较(p<0.05)；b与空白组相比较(p<0.05)
2、小鼠脾脏组织h&e染色
小鼠脱颈法处死后，取出脾脏组织并进行观察。结果显示模型组小鼠的脾脏明显肿大，空白组小鼠的脾脏则较小，而灌胃组小鼠的脾脏虽然较空白组也出现肿大现象，但较模型组其肿大的程度较小，甚至高剂量组小鼠的脾脏更接近于空白组。之后对小鼠脾脏组织进行石蜡包埋，然后切片进行h&e染色观察，结果如图11所示。从图中可以明显的看到空白组的脾脏白髓(深染)和红髓(浅染)区域，并且各个区域的边界分明，显示清晰的边缘区，而模型组的脾脏组织的质地更加的疏松，红髓区域的面积明显增大，伴随着白髓区域的面积减少，而且没有显示出明显的边缘区。图中可以看出灌胃组小鼠的红髓区域都出现增大现象，而且边缘区都可以看见；另外高剂量组小鼠的脾脏可以看出较为明显的白髓和红髓分界，而且其红、白髓的比例更加接近空白组。由此可以得出模型组小鼠的脾脏由于肿瘤的增长受到了严重损害，而黄芪醇溶低聚糖可以有效保护脾脏组织，并且改善脾脏病变，红、白髓比例显示的更好。
3、小鼠脾淋巴细胞转化能力分析
本实验结果如表7所示，模型组小鼠的淋巴细胞刺激指数较空白组明显降低，这可能是由于肿瘤细胞的恶性增殖，极大的损害了小鼠的免疫系统，进而使肿瘤细胞不能有效的被杀死，使机体的免疫能力明显下降，即使得小鼠淋巴细胞的刺激指数降低。然而，灌胃组小鼠的刺激指数较模型组小鼠明显升高，更加接近空白组(p<0.05)，表明黄芪醇溶低聚糖可以促进t细胞和b细胞的增殖，刺激小鼠机体免疫系统。
表7黄芪醇溶低聚糖对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖能力的影响
4小鼠脾nk细胞活性分析
nk细胞是机体的一种先天性的免疫细胞，参与机体对抗癌细胞的第一道防线，可以直接攻击肿瘤细胞。因此，本实验采用mtt法检测nk细胞活性，结果如图12所示。结果表明，模型组的nk细胞活性较空白组显著降低，这可能是由于肿瘤细胞的增殖抑制了nk细胞的活性。而且灌胃组小鼠的nk细胞活性虽然较空白组也有明显降低，但是较模型组出现明显的升高，这表明黄芪醇溶低聚糖可以保护小鼠的脾脏，增加机体nk细胞活性。表明黄芪多糖可以剂量性的促进nk细胞活性。
五、小鼠巨噬细胞吞噬中性红能力分析
巨噬细胞是机体先天性免疫的重要细胞，是生物防御系统中对抗肿瘤增长的重要免疫细胞。活性巨噬细胞可以直接参与抗原呈递，杀死肿瘤细胞。因此巨噬细胞活性在一定程度上可以反应机体的免疫功能。中性红比色法是常用的快速评价巨噬细胞吞噬能力的检测方法。分别抽取各组小鼠腹腔巨噬细胞，和中性红细胞共同培养，mtt法测定吞噬能力，实验结果如图13显示。模型组巨噬细胞活性较空白组明显降低，而灌胃组的巨噬细胞活性虽然较空白组也明显降低，但是较模型组出现了明显的升高(p<0.05)。这表明黄芪醇溶低聚糖可以明显增加巨噬细胞活性，刺激机体的免疫系统对抗肿瘤细胞。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。