本发明涉及西松烷型大环二萜类化合物及其制备方法技术领域，具体涉及从乳香中提取的西松烷型大环二萜类化合物及提取方法。
背景技术：
乳香为橄榄科乳香属植物卡氏乳香树boswelliacarteriibirdw.及同属植物鲍达乳香树boswelliabhawdajianabirdw.及野乳香树boswellianeglectam.moore等的树脂，主产于索马里、埃塞俄比亚等地。中医认为其辛散温通，能活血行气、通经止痛、消肿生肌，临床上常用于治疗气血凝滞、心腹疼痛、痈疫肿毒、跌打损伤、痛经、产后瘀阻等。现代研究表明乳香具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等药理作用，是一种具有广泛开发前景的植物药。
西松烷型大环二萜是由4个异戊二烯单元首尾相连形成的大环二萜，是一类母体骨架具有十四元环和3个对称分布的甲基与1个异丙基的天然产物，具有较好的抗炎、抗肿瘤活性。目前所得到的大多数西松烷型大环二萜都来自海洋生物，该类成分的植物来源主要包括大戟科、瑞香科等植物，而近期从乳香中也分离得到了为数不多的该类成分，具有抗炎、抗肿瘤等较好的药理活性。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种新的从乳香中分离纯化出的西松烷型大环二萜类化合物，该类化合物具有抗炎活性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种西松烷型大环二萜类化合物，为化合物ⅰ、化合物ⅱ或化合物ⅲ，化学结构式分别为：
本发明的目的之二是提供一种分离纯化乳香中西松烷型大环二萜类化合物的方法，步骤为：
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1，每个梯度洗脱液的总体积均相同，记为v，每v/5作为一个流份；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为5:1的第5个流份通过c18吸附树脂色谱，采用65％(体积)甲醇进行洗脱获得洗脱部位；
(5)采用c18柱将洗脱部位以乙腈和水体积比为40:60的溶液作为流动相进行制备，获得化合物ⅰ，其中，检测波长为306nm；
所述化合物ⅰ的结构式为
本发明的目的之三是提供一种分离纯化乳香中西松烷型大环二萜类化合物的方法，步骤为：
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1，每个梯度洗脱液的总体积均相同，记为为v，每v/5作为一个流份；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为5:1的第5个流份通过c18吸附树脂色谱，依次采用65％(体积)甲醇、80％(体积)甲醇进行洗脱分别获得65％(体积)甲醇洗脱部位、80％(体积)甲醇洗脱部位；
(5)采用c18柱将80％(体积)甲醇洗脱部位以乙腈和水体积比为44:56的溶液作为流动相进行制备，获得化合物ⅱ，其中，检测波长为210nm；
所述化合物ⅱ的结构式为
本发明的目的之四是提供一种分离纯化乳香中西松烷型大环二萜类化合物的方法，步骤为：
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1，每个梯度洗脱液的总体积均相同，记为为v，每v/5作为一个流份；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为1:1的第1个流份通过c18吸附树脂色谱，依次采用60％(体积)甲醇、70％(体积)甲醇进行洗脱分别获得60％(体积)甲醇洗脱部位、70％(体积)甲醇洗脱部位；
(5)采用c18柱将70％(体积)甲醇洗脱部位以乙腈和水体积比为48:52的溶液作为流动相进行制备，获得化合物ⅲ，其中，检测波长为210nm；
所述化合物ⅲ的结构式为
本发明的目的之五是提供一种上述西松烷型大环二萜类化合物在制备抗炎药物中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明首次在乳香中分离出来化合物ⅰ、化合物ⅱ及化合物ⅲ等西松烷型大环二萜类化合物。
2.本发明制备新颖西松烷型大环二萜类化合物的制备方法，乳香为原料，来源广泛，制备工艺简单，经济、安全，得率高，所得的3个新化合物均具有抗炎活性，其中，化合物ⅱ的抗炎活性最高，具有良好的药用前景。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为(1s,6s,11r,12r,3e,7e)-1:12-epoxycembr-3,7-ene-6,11-diol的1hnmr；
图2为(1s,6s,11r,12r,3e,7e)-1:12-epoxycembr-3,7-ene-6,11-diol的13cnmr；
图3为(1s,3e,7s,11r)-1:12-epoxycembr-8(19),7-diene-7,11-diol的1hnmr；
图4为(1s,3e,7s,11r)-1:12-epoxycembr-8(19),7-diene-7,11-diol的13cnmr；
图5为(1s,9s,11s,12r,3e,7z)-1:12-epoxycembr-3,7-ene-9,11-diol的1hnmr；
图6为(1s,9s,11s,12r,3e,7z)-1:12-epoxycembr-3,7-ene-9,11-diol的13cnmr；
图7为化合物ii的ic50曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中记载的“％(体积)乙醇”是指乙醇水溶液中乙醇的体积百分比，“％(体积)甲醇”是指甲醇水溶液中甲醇的体积百分比。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在无法从乳香中提取结构新颖的西松烷型大环二萜类化合物不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种分离纯化乳香中西松烷型大环二萜类化合物的方法。
本申请的一种典型实施方式，提供了一种西松烷型大环二萜类化合物，为化合物ⅰ、化合物ⅱ或化合物ⅲ，化学结构式分别为：
本申请的另一种实施方式，提供了一种分离纯化乳香中西松烷型大环二萜类化合物的方法，步骤为：
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1，每个梯度洗脱液的总体积均相同，记为为v，每v/5作为一个流份；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为5:1的第5个流份通过c18吸附树脂色谱，采用65％(体积)甲醇进行洗脱获得洗脱部位；
(5)采用c18柱将洗脱部位以乙腈和水体积比为40:60的溶液作为流动相进行制备，获得化合物ⅰ，其中，检测波长为306nm；
所述化合物ⅰ的结构式为
本申请的第三种实施方式，提供了一种分离纯化乳香中西松烷型大环二萜类化合物的方法，步骤为：
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：
100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1，每个梯度洗脱液的总体积均相同，记为为v，每v/5作为一个流份；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为5:1的第5个流份通过c18吸附树脂色谱，依次采用65％(体积)甲醇、80％(体积)甲醇进行洗脱分别获得65％(体积)甲醇洗脱部位、80％(体积)甲醇洗脱部位；
(5)采用c18柱将80％(体积)甲醇洗脱部位以乙腈和水体积比为44:56的溶液作为流动相进行制备，获得化合物ⅱ，其中，检测波长为210nm；
所述化合物ⅱ的结构式为
本申请的第四种实施方式，提供了一种分离纯化乳香中西松烷型大环二萜类化合物的方法，步骤为：
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：
100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1，每个梯度洗脱液的总体积均相同，记为为v，每v/5作为一个流份；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为1:1的第1个流份通过c18吸附树脂色谱，依次采用60％(体积)甲醇、70％(体积)甲醇进行洗脱分别获得60％(体积)甲醇洗脱部位、70％(体积)甲醇洗脱部位；
(5)采用c18柱将70％(体积)甲醇洗脱部位以乙腈和水体积比为48:52的溶液作为流动相进行制备，获得化合物ⅲ，其中，检测波长为210nm；
所述化合物ⅲ的结构式为
优选的，步骤(1)采用的乳香药材的质量与步骤(3)每个梯度洗脱液的总体积的体积比为6:5，g:ml。
优选的，步骤(1)采用的乳香药材粉碎至200～300目。
优选的，步骤(1)中去除溶剂的方法为依次进行减压旋蒸、冷冻干燥。
优选的，步骤(2)中去除溶剂的方法为减压旋蒸浓缩。
优选的，步骤(5)中流动相的流速为3±0.1ml·min-1。
本申请的第五种实施方式，提供了一种上述西松烷型大环二萜类化合物在制备抗炎药物中的应用。
优选的，西松烷型大环二萜类化合物为化合物ⅱ。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
化合物ⅰ-ⅲ的制备方法，步骤如下：
(1)取6kg乳香药材，粉碎至200～300目，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得乳香乙醇粗提物；
(2)将步骤1中乙醇粗提物适量20％乙醇-水超声打散，分别用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水萃取段。
(3)将步骤2中所得二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为石油醚(pe)-乙酸乙酯(etoac)(100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1)，每个梯度洗脱5000ml，每1000ml为1个接收体积；
(4)将pe-etoac(5:1)洗脱的第5个流份再通过c18吸附树脂色谱，依次用65％、80％、90％、100％meoh/h2o进行洗脱，得到各洗脱部位。将c18柱的65％meoh部位用ch3cn/h2o(40:60,v/v)进行制备(流速：3ml·min-1；检测波长：306nm)得到化合物ⅰ(20mg)；
(5)将c18柱的80％meoh部位用ch3cn/h2o(44:56,v/v)进行制备(流速：3ml·min-1；检测波长：210nm)得到化合物ⅱ(20mg)；
(6)将pe-etoac(1:1)洗脱的第1个流份再通过c18吸附树脂色谱，依次用60％、70％、80％、90％、100％meoh/h2o进行洗脱，得到各洗脱部位；将c18柱的70％meoh部位用ch3cn/h2o(48:52,v/v)进行制备(流速：3ml·min-1；检测波长：210nm)得到化合物ⅲ(10mg)。
结构鉴定：对分离得到的单体成分应用agilent5973n质谱仪和burker400mhz核磁共振波谱仪分别进行ms，nmr谱的测定，所得核磁数据见表1～2，鉴定3个新西松烷型大环二萜类化合物ⅰ、ⅱ、ⅲ的结构：
化合物ⅰ：(1s,6s,11r,12r,3e,7e)-1:12-epoxycembr-3,7-ene-6,11-diol，无色油状物，hr-esims给出分子离子峰m/z345.2422[m+na]+(calcdforc20h34o3na，345.2400),结合1hnmr和13cnmr谱推测化合物ⅰ的分子式为c20h34o3。1hnmr谱显示西松烷型大环二萜的特征性信号：1个异丙基信号：δh0.80(3h,d,j＝6.8hz,me-16)，0.86(3h,d,j＝6.8hz,me-17)，1.87(1h,m,h-15)，3个甲基单峰信号：0.92(3h,s,me-20)，1.63(3h,s,me-19)，1.47(3h,s,me-18)，2个烯氢信号：δh5.00(1h,d,j＝9.2hz,h-7)，5.04(1h,m,h-3)，2个连氧氢信号：δh2.95(1h,dd,j＝6.4,10.4hz,h-11)，4.31(1h,m,h-6)。13cnmr和hsqc、hmbc谱显示化合物ⅰ共有20个碳原子，包括5个甲基，6个亚甲基，5个次甲基(其中δc129.2(c-7)和124.4(c-3)与烯碳一致，δc75.2(c-11)和65.2(c-6)与连氧碳一致)和4个季碳(其中季碳信号δc136.2(c-8)和131.2(c-4)与取代烯碳一致，δc87.4(c-1)和84.9(c-12)与连氧碳一致)。比较化合物ⅰ和boscartinc的1h和13cnmr数据，发现两者结构类似，主要的区别在于boscartinc的c-3和c-4位为环氧结构，而化合物ⅰ的c-3和c-4位为双键结构，通过c-3和c-4位的化学位移及hmbc相关信号：h-3与c-1、me-18、c-4相关，me-18与c-3、c-4、c-5相关，h-6与c-4相关，可进一步证明此结论。通过比较化合物ⅰ和boscartincc-6和c-11的化学位移，发现两者非常接近，确定两者c-6和c-11的绝对构型一致，分别为6s和11s。此外，在noesy谱中，h-6与h-5a相关，h-5b与h-7、h-11相关，h-11与h-3a、h-10a相关,h-6与me-18相关，h-10b和h-3b与me-20相关,进一步证明oh-6和oh-11分别为β和α构型；h-3与h-10a、h-11相关,h-7与h-10a、h-11相关，表明c-3/c-4和c-7/c-8的双键均为e构型。综上所述，化合物ⅰ的结构确定为：(1s,6s,11r,12r,3e,7e)-1:12-epoxycembr-3,7-ene-6,11-diol，具体表征结果见图1～2。
化合物ⅱ：(1s,3e,7s,11r)-1:12-epoxycembr-8(19),7-diene-7,11-diol，无色油状物，hr-esims给出分子离子峰m/z345.2424[m+na]+(calcdforc20h34o3na，345.2400),结合1hnmr和13cnmr谱推测化合物ⅱ的分子式为c20h34o3。化合物ⅱ的1hnmr谱显示西松烷型大环二萜的特征性信号：1个异丙基信号：δh0.88(3h,d,j＝6.8hz,me-16)，0.83(3h,d,j＝6.8hz,me-17)，1.80(1h,overlapped,h-15)，2个甲基单峰信号：1.02(3h,s,me-20)，1.54(3h,s,me-18)，1个烯氢信号：δh5.01(1h,m,h-3)，1个1,1-双取代双键信号：δh4.90(1h,s,h-19a)，4.83(1h,s,h-19b)，2个连氧氢信号：δh2.99(1h,dd,j＝6.0,12.0hz,h-11)，4.13(1h,dd,j＝5.6,13.2hz,h-7)。比较化合物ⅱ和ⅰ的1hnmr和13cnmr谱数据，发现两者结构类似，区别在于两者c-7,c-8,c-9和me-19的碳化学位移不同，化合物ⅱ中c-7为连氧碳，c-8、c-19为环外双键结构，c-9为亚甲基，而化合物ⅰ中c-7、c-8、c-19位为乙烯甲基结构，c-9为连氧碳。在hmbc谱中，h-7与c-5，c-6，c-8，c-9，c-19相关,h-11与c-9，c-10，c-12，c-13，me-20相关,oh-7与c-6，c-7，c-8相关，oh-11与c-10，c-11，c-12相关，表明oh位于c-,7和c-11处；h2-19与c-7，c-8和c-9相关，表明环外双键位于c-7/c-11处。在noesy谱中，h-7与h-9a、h-6b相关，h-9a与h-10b相关，h-10b与me-20相关，h-11与h-3、h-13a相关，h-13b与me-20相关，以及h-7/h-6b的耦合常数(13.2hz)和h-11/h-10a的耦合常数确定(12.0hz)，表明oh-11和me-20为β构型，oh-7为α构型；h-3与h-7、h-11、me-16相关,me-18与h-2a相关,h2-19与h-9a相关，表明c-3/c-4双键为e构型。综上所述，化合物ⅱ的结构确定为：(1s,3e,7s,11r)-1:12-epoxycembr-8(19),7-diene-7,11-diol，具体表征结果见图5～6。
化合物ⅲ：(1s,9s,11s,12r,3e,7z)-1:12-epoxycembr-3,7-ene-9,11-diol，无色油状物，hr-esims给出分子离子峰m/z345.2446[m+na]+(calcdforc20h34o3na，345.2400),结合1hnmr和13cnmr谱推测化合物ⅲ的分子式为c20h34o3。比较化合物ⅲ和ⅰ的1hnmr和13cnmr谱数据，发现两者结构类似，主要的区别在于连氧季碳的化学位移，化合物ⅰ中为δc75.3和δc65.2，而化合物ⅲ为δc74.2和δc72.7。鉴于化合物ⅲ和ⅰ的分子式一致，以及hmbc谱中：h-9与c-7，c-10，c-11，me-19相关,h-11与c-9，c-10，c-12，c-13，me-20相关,oh-9与c-8，c-9，c-10相关，oh-11与c-10，c-11，c-12相关，进一步证明化合物ⅲ中oh分别连在c-9和c-11处。在noesy谱中，h-9与h-7，h-10b，h-11，me-19相关，h-11与h-3，h-7，h-9，h-10a，me-19相关，oh-9与me-19相关，oh-11与h-10b，me-20，h-10b与me-20相关，以及h-9/h-10a的耦合常数(12.4hz)和h-11/h-10a的耦合常数(9.6hz)确定oh-9为α构型，oh-11和me-20为β构型；h-3与h-6a，h-13a，me-16，me-19相关,h-7与h-9，h-10a，h-11，me-19相关确定c-3/c-4和c-7/c-8的双键分别为e和z构型。综上所述，化合物ⅲ的结构确定为：(1s,9s,11s,12r,3e,7z)-1:12-epoxycembr-3,7-ene-9,11-diol，具体表征结果见图3～4。
表1.化合物ⅰ～ⅲ的1hnmr光谱数据(400mhz,dmso-d6,δppm,j,hz)
表2.化合物ⅰ～ⅲ的13cnmr光谱数据(100mhz,dmso-d6,δppm)
药理学实验：
1、实验材料
细胞株：raw264.7小鼠巨噬细胞。
试剂与仪器：化合物ⅰ～ⅲ均由本课题组从乳香中分离得到；dmem培养基(美国corning公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；mtt(美国sigma公司)；青链霉素混合液(100×)(北京索莱宝科技有限公司)；lps(美国sigma公司)；griess试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。
细胞培养箱(美国thermoscientific)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)；多功能酶标仪(法国tecan公司)；96孔细胞培养板(美国corning公司)。
2、试验方法
细胞复苏：采用快融法复苏细胞。取出液氮中冻存的细胞后，立即置37℃水浴中快速融化，避免冰晶缓慢损伤细胞。待融解后迅速转入到完全培养基(含10％fbs及1％青链霉素混合液)中培养，次日换液。
细胞培养：deme完全培养基(含10％fbs及1％青链霉素混合液)中培养raw264.7细胞，在培养箱(37℃，5％co2)培养至细胞覆盖率达90％以上时传代，生长状态良好的细胞用于实验研究。
化合物对细胞的毒性：用mtt法进行评价，取raw264.7小鼠巨噬细胞，计数，接种到96孔细胞培养板中(2×105/孔)，培养24h。实验分为阴性对照组，lps组，给药组和阳性对照组(地塞米松)，阴性对照组中只加入培养基，lps组中只加入1μg/ml的lps，阳性对照组中加入1μg/ml的lps和20μm的地塞米松，给药组中加入1μg/ml的lps和20μm的待测样品。每孔加入新鲜配置的含5.0mg/mlmtt的无血清培养基，37℃下继续培养4h后，除去上清夜。每孔加入150μldmso溶解formazan沉淀。在perkinelmerenspire型酶标仪上测定570nm处的光密度值。
抗炎活性：取raw264.7小鼠巨噬细胞，计数，接种到96孔细胞培养板中(2×105/孔)。采用含有10％牛胎血清、1％青链霉素混合液的dmem培养基，将细胞在37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中贴壁24h。实验分为阴性对照组，lps组，给药组和阳性对照组(地塞米松)，阴性对照组中只加入培养基，lps组中只加入1μg/ml的lps，阳性对照组中加入1μg/ml的lps和五个不同浓度的地塞米松，给药组中加入1μg/ml的lps和五个不同浓度的待测样品，五个浓度梯度分别为：20、10、5、2.5、1.25μm。取出上清液60μl,加入griess试剂10分钟后，用酶标仪在波长570nm处测定各化合物的od值，重复测定3次，计算相应的no生成抑制率和ic50值。
3、实验结果
化合物ⅱ对lps诱导的raw264.7小鼠巨噬细胞的no释放表现出抑制作用，其ic50分别为1.32μm(ic50曲线如图7)，mtt法测得化合物ⅱ对raw264.7细胞的抑制率为-8.5％，而化合物ⅰ和化合物ⅲ对no释放的抑制作用的ic50>100μm，化合物ⅰ和化合物ⅲ对raw264.7细胞的抑制率分别为-5.2％和19.5％。根据《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》对“体外抗肿瘤试验”的规定，抗肿瘤效果评价以体外肿瘤半数抑制浓度(ic50)，中药提取物ic50≤30μg·ml-1有生物学意义。从以上数据看，化合物ⅱ对raw264.7小鼠巨噬细胞的ic50值等于或小于该水平，具有明显的生物学意义，且对raw264.7细胞不产生抑制作用。
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