本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及hd-zipi类转录因子gmhdl57基因及其在增强百脉根抗盐能力中的应用。
背景技术：
同源异型域亮氨酸拉链蛋白hd-zip（homeodomainleucine-zipper）是植物特有的一类转录因子，包含一个由60或61个氨基酸组成的同源异型结构域hd和一个亮氨酸拉链结构域lz。参与非生物胁迫应答的主要是hd-zipi类蛋白。拟南芥中有17个hd-zipi类蛋白，其中，athb5-7和athb12受干旱和外源aba诱导表达，盐胁迫和渗透胁迫能够诱导athb7的表达。烟草hd-zipi类转录因子nahd20受失水胁迫诱导，正调控aba在叶片中的积累。蒺藜苜蓿mthb1受nacl胁迫诱导，在根中表达量呈上调趋势。紫花苜蓿mshb2受nacl和aba诱导，负调控植株对盐胁迫的应答反应。野生大豆hd-zipi类转录因子gshdz4受碱胁迫诱导在叶片和根中高表达，超量表达gshdz4提高了转基因拟南芥对碳酸盐的耐受性，这一新发现为揭示野生大豆耐盐碱胁迫机制提供了线索。近年来，植物hd-zip类转录因子参与非生物胁迫应答反应已成为研究热点。目前的研究主要集中在拟南芥、水稻、玉米、杨树、黄瓜等植物，对于大豆中该类蛋白的功能研究报道较少，尚处于起步阶段。
目前，在大豆中鉴定到35个hd-zipi类转录因子，但是有关该类转录因子参与抗逆生理方面的研究报道甚少。早期研究发现1个大豆hd-zipi类转录因子gmhz-1正调控大豆花叶病毒（smv）的感染。目前，hd-zipi类转录因子在拟南芥中的抗逆分子机理研究日趋成熟，而在大豆中的研究相对滞后。
发明人前期克隆得到一个大豆hd-zipi类盐胁迫应答基因gmhat5，该基因受盐胁迫诱导上调表达，盐胁迫处理6h、12h，这2个时间点表达量明显上升两倍左右。但并未获得稳定转化百脉根种子，展开深入研究，因此缺乏实际应用价值。本发明分离得到大豆的另一个hd-zipi类基因gmhdl57，鉴于大豆转录因子gmhdl57在响应高盐胁迫时基因表达量的变化最为明显，本发明构建了该基因的植物过表达载体，通过稳定转化获得转基因百脉根植株，并测定盐胁迫下转基因株系的各项生理指标。在进行盐胁迫处理时所使用的是t0代转基因百脉根种子即t1代转基因百脉根，因此所使用材料的稳定性更好，盐胁迫处理所获取数据的真实性和可靠性更强，转基因百脉根种子可进一步传代筛选，最终推广应用，改良百脉根抗盐品质，扩大百脉根在盐碱地的种植范围。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一个提高豆科植物抗盐能力的hd-zipi类转录因子gmhdl57基因，其序列为seqidno:1所示的核苷酸序列。
本发明所述的提高豆科植物抗盐能力的hd-zipi类转录因子gmhdl57基因编码的蛋白质，其序列为seqidno:2所示氨基酸序列。
本发明的再一个目的是提供一种提高豆科植物抗盐能力的hd-zipi类转录因子gmhdl57基因的基因工程应用，尤其是在百脉根中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种提高豆科植物抗盐能力的hd-zipi类转录因子gmhdl57基因的制备方法，其步骤是：取栽培大豆williams82幼苗根组织，液氮速冻后参照takara公司rna抽提试剂盒操作说明，提取幼苗根组织的总rna。使用tiangen公司的反转录试剂盒制备cdna第一链。根据ncbi网站公布的gmhdl57基因序列（genbank:xp_006574472.1），设计引物以cdna第一链为模板扩增。目的片段回收纯化后连接t载体测序验证。可以采用pcr（polymerasechainreaction）技术，从基因组、mrna和cdna中扩增得到本发明的gmhdl57基因以及任何感兴趣的一段dna或与其同源的一段dna。
gmhdl57基因的胁迫表达检测：栽培大豆williams82种子经消毒后，置于1/2hoagland培养基中萌发生长，待幼苗生长至v1期（第一复叶期）时进行非生物胁迫处理。3组实验组幼苗分别使用含100μmol/laba、含100mmol/lnacl、含30%peg-6000的1/2hoagland培养液处理。另外1组幼苗移至4℃培养箱中冷处理。每组5棵苗，并设置3个重复，分别于胁迫前0h、胁迫后1、6、12、24和48h取幼苗根组织，液氮速冻后置于-80℃冰箱储存备用。根据gmhdl57基因序列，利用primer5.0软件设计1对实时荧光定量pcr引物，以各个胁迫样品的cdna第一链为模板，按照takara公司primescriptrtreagentkit操作说明进行。以大豆肌动蛋白11（act11）为内参基因。根据相对定量法（△△ct）公式计算结果，利用excel表绘图分析gmhdl57基因在非生物胁迫下的表达特征。
一种提高豆科植物抗盐能力的hd-zipi类转录因子gmhdl57基因在百脉根中的应用，其步骤是：通过遗传转化来实现的。本发明构建gmhdl57基因的植物超表达载体，采用根癌农杆菌介导的子叶节转化法将gmhdl57基因导入百脉根中。以转基因和野生型百脉根植株叶片dna为模板，pcr扩增gus基因，提取部分pcr阳性植株叶片rna，进行gmhdl57基因表达分析。收集rt-pcr检测为阳性的植株种子即t0代转基因百脉根种子，将其与野生型种子表面灭菌，移入ms培养基上待种子萌发。一周后将幼苗移入含有基质的盆钵中，3周后选取长势一致的幼苗进行盐胁迫处理，设置3个重复，14d后拍照并测定相关生理生化指标。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1.本发明利用反转录pcr技术在大豆根组织中分离到了一个同源异型域亮氨酸拉链转录因子hd-zip基因gmhdl57，并且通过同源蛋白多序列比对及保守结构域预测等方法证实了该基因是一个hd-zipi类转录因子基因；分析了4种非生物胁迫（盐、脱落酸、干旱以及冷）对大豆幼苗期gmhdl57基因表达的影响，证实该基因受高盐胁迫诱导表达量显著升高，为胁迫前的8.5倍；同时又通过超表达遗传转化的方法证实了该基因过量表达能够显著提高百脉根的抗盐能力。
2.百脉根（lotusjaponicus）作为一种优良的豆科牧草，在世界范围内广泛种植。因其固氮效率高，细胞再生性能好，遗传转化效率高等优势，已经成为研究共生固氮机理、基因异位表达等的理想材料。虽然百脉根具有抗旱和耐盐碱的特性，但只适宜在轻度干旱和轻度盐碱的土地上种植，在中、重度盐渍化及干旱环境中种植，植株生长受到严重限制。本发明正是通过超表达技术证实了该基因过量表达能够显著提高百脉根的抗盐能力。由此可以通过转基因的手段使该基因在豆科植物中超量表达，这样就可以大大提高豆科植物对盐碱地的适应能力，不仅为大豆耐盐基因工程改良提供了新的候选基因，而且对于培育耐盐百脉根新品种，增强其在盐碱地区的生长能力，充分开发利用盐碱化土地资源具有重要意义。
附图说明
图1为gmhdl57基因的pcr扩增（1a）和重组质粒p1301u-gmhdl57的酶切鉴定（1b）示意图。
图2为一种利用dnaman软件将大豆gmhdl57与其它植物同源蛋白的保守序列比对分析示意图，其中黑线部分为同源异型框结构域序列，虚线部分为同源异型框结合类亮氨酸拉链结构域序列：
sequencesource:glycinesoja，accessionkhn01166.1
sequencesource:cajanuscajan，accessionxp_020226777.1
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sequencesource:arachisipaensis，ai:accessionxp_016202544.1。
图3为大豆gmhdl57基因在非生物胁迫下的表达分析示意图。
图4为转基因百脉根阳性植株检测及抗盐表型鉴定示意图，其中4a：pcr检测转基因植株和对照植株中gus；4b：rt-pcr检测转基因植株和对照植株中gmhdl57的表达量；4c：不同盐浓度处理14d后转gmhdl57百脉根和对照植株的表型。
图5为盐胁迫对转基因百脉根株高（5a）和根长（5b）的影响示意图。
图6为盐胁迫下转基因百脉根的生理指标测定示意图，其中6a：丙二醛含量测定；6b：相对质膜透性分析；6c：叶绿素含量测定；6d：根系活力测定。
图7为盐胁迫下转基因百脉根的阳离子含量测定示意图，其中7a：叶片中na+含量测定；7b：根中na+含量测定；7c：叶片中k+含量测定；7d：根中k+含量测定；7e：叶片中ca2+含量测定；7f：根中ca2+含量测定。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图和本发明的优选实施例进行详细描述。
实施例1
一种提高豆科植物抗盐能力的hd-zipi类转录因子基因gmhdl57的制备方法，其步骤是：
栽培大豆williams82种子经消毒后，置于1/2hoagland培养基中萌发生长，光照培养箱参数设置为温度25℃，相对湿度60%，18h光照，6h黑暗。取幼苗根组织，液氮速冻后参照takara公司rna抽提试剂盒操作说明，提取幼苗根组织的总rna。使用tiangen公司的反转录试剂盒制备cdna第一链。根据ncbi网站公布的gmhdl57基因序列（genbank:xp_006574472.1），设计引物f-gmhdl57（5’-atggcgagtggcaagctttatgc-3’）和r-gmhdl57（5’-tcaatagggccagaaacag-3’），以cdna第一链为模板扩增（图1a所示）。目的片段回收纯化后连接t载体，送南京金斯瑞公司测序验证。
实施例2
gmhdl57基因的胁迫表达检测，其步骤是：
栽培大豆williams82种子经消毒后，置于1/2hoagland培养基中萌发生长，光照培养箱参数设置为温度25℃，相对湿度60%，18h光照，6h黑暗。待幼苗生长至v1期（第一复叶期）时进行非生物胁迫处理。3组实验组幼苗分别使用含100μmol/laba、含100mmol/lnacl、含30%peg-6000的1/2hoagland培养液处理。另外1组幼苗移至4℃培养箱中冷处理。每组5棵苗，并设置3个重复，分别于胁迫前0h、胁迫后1、6、12、24和48h取幼苗根组织，液氮速冻后置于-80℃冰箱储存备用。
根据gmhdl57基因序列，利用primer5.0软件设计1对实时荧光定量pcr引物，f-gmhdl57-rt（5’-gatgaagaggataaccttag-3’）和r-gmhdl57-rt（5’-tcaatagggccagaaacag-3’），以各个胁迫样品的cdna第一链为模板，按照takara公司primescriptrtreagentkit操作说明进行。以大豆肌动蛋白11（act11）为内参基因，实时荧光定量pcr上游引物为f-act11（5’-attttgactgagcgtggttattcc-3’）；下游引物为r-act11（5’-gctggtcctggctgtctcc-3’）。根据相对定量法（△△ct）公式计算结果，利用excel表绘图分析gmhdl57基因在非生物胁迫下的表达特征（图3所示）。
通过外源脱落酸、高盐、干旱、冷等模拟非生物胁迫，探究了gmhdl57基因表达对4种不同的非生物胁迫的响应特征。从图3可以看出，nacl和peg胁迫处理1h时，gmhdl57基因的表达量迅速上升，且随处理时间的延长表达量持续升高，至48h时达到最大值，分别为胁迫前的8.5倍和4.2倍。而在aba胁迫下，gmhdl57基因的表达量在1h和6h两个时间点增加缓慢，至12h时明显上升，后又缓缓升高，至48h时达到胁迫前的3.9倍。4℃冷胁迫处理时，gmhdl57基因的表达量持续下降，至12h时达到最小值，为胁迫前的0.5倍，之后趋于稳定，表现出对冷胁迫的适应性。表明大豆转录因子gmhdl57在响应高盐胁迫时基因表达量的变化最为明显。
实施例3
一种提高豆科植物抗盐能力的hd-zipi类转录因子基因gmhdl57在百脉根中的应用，具体实施步骤如下：
百脉根稳定转化：
（1）超表达融合载体的构建
将测序正确的目的基因插入植物过表达载体p1301u中，上游引物为f-gmhdl57-ox（5’-cgggatccatggcgagtggcaag-3’），下游引物为r-gmhdl57-ox（5’-ggggtacctcaatagggccagaaac-3’），小写字母区域为酶切位点序列bamhi和kpni，构建过表达载体p1301u-gmhdl57（图1b所示）。提取质粒电击转化根癌农杆菌eha105。
（2）农杆菌菌液制备
农杆菌eha105单菌落在附加40mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的yeb液体培养基中28℃振荡培养42h后，5000r/min离心10min收集菌体，用ms液体培养基重悬，稀释至od600=0.6待用。
（3）材料处理
百脉根mg20种子先用75%酒精洗一次，再用0.1%的升汞灭菌6~8min，无菌蒸馏水洗10次以上，浸泡过夜，再洗3~4次，移入ms固体培养基上，3~4d时两片子叶展开，此时取其下胚轴，切成2mm左右的切段，接种于愈伤组织诱导培养基上。
（4）外植体预培养
取切好的下胚轴在愈伤组织诱导培养基上预培养3d。
（5）侵染和共培养
取预培养的外植体浸入准备好的农杆菌菌液中侵染20min，取出后用无菌滤纸吸干外植体表面残留的菌液，然后移入不加抗生素的愈伤诱导培养基中，黑暗共培养3d。
（6）转化筛选
把共培养的愈伤组织转移到含羧苄青霉素(300mg/l)和卡那霉素(50mg/l)的愈伤诱导培养基上培养，进行抑菌和筛选。2周后，将有抗性的愈伤组织转移到芽分化培养基上进行诱导分化培养。当诱导出的芽长至2~3cm时，从其基部切下，插入到生根培养基中诱导生根，形成再生植株。
（7）培养条件
温度24~26℃，光/暗周期16h/8h，光照强度2000lux，14~21d继代一次。
上述步骤的培养基配方如下：
ms培养基：msbasalsaltmixture（sigma）4.3g，msvitaminpowder0.103g，0.7-0.8%（质量体积比）琼脂粉，ddh2o定容至1000ml，调节ph至5.8。
愈伤组织诱导培养基：ms+2,4-d2.0mg/l+kt2.0mg/l
芽分化培养基：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l
生根培养基：ms+naa0.1mg/l
（8）稳定转化植株的分子生物学检测
以转基因和野生型百脉根植株叶片dna为模板，pcr扩增gus基因，引物为f-gus（gtcgcgcaagactgtaacca）和r-gus（cggcgaaattccatacctg）。提取部分pcr阳性植株叶片rna，进行gmhdl57基因表达分析，引物为f-gmhdl57-rt（5’-gatgaagaggataaccttag-3’）和r-gmhdl57-rt（5’-tcaatagggccagaaacag-3’），以百脉根gpdh为内参基因，引物为f-gpdh（gtggtgccaagaaggttgttat）和r-gpdh（ctgggaatgatgttgaaggaag）。
盐胁迫处理：
收集rt-pcr检测为阳性的植株种子即t0代转基因百脉根种子，将其与野生型种子表面灭菌，移入ms培养基上待种子萌发。一周后将幼苗移入含有基质的盆钵中，3周后选取长势一致的幼苗，将转基因和野生型植株各分成3组，每组24株，分别用终浓度为0、100和200mmol•l-1nacl的1/8hoagland营养液处理，设置3个重复，14d后拍照（图4中c所示）并测定相关生理生化指标，包括丙二醛含量测定、叶片质膜透性（相对电导率）测定、叶绿素含量测定、根系活力检测（图6所示）以及阳离子na+、k+和ca2+含量测定（图7所示）。
从图4c可以看到，正常条件下，转基因和对照植株生长状态基本一致，而高盐处理的对照植株长势明显较差，植株矮小，叶片失绿、萎蔫。从图5可以进一步明确看出转基因株系株高和根长均优于对照组。
由图6可知，转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性均低于对照组，而叶绿素含量以及根系活力均高于对照组。
从图7可以看出，在正常生长条件下转基因和对照植株中离子的含量没有明显差异，说明gmhdl57基因在正常生长条件下不影响植株对3种阳离子的吸收。随着盐浓度逐渐升高，转基因和对照植株叶和根中na+和ca2+含量均随之升高，k+含量随之降低，但与对照相比，转基因植株中na+含量较少，k+和ca2+含量较多。gmhdl57基因在高盐胁迫下通过减少na+的吸收或是增加na+的外排，降低转基因植株叶和根中na+的含量，从而维持植株的正常生理功能。在盐胁迫下保持较高的细胞质k+和ca2+浓度能够增强植物的耐盐性。本研究中，在盐胁迫条件下，转基因百脉根叶和根中k+和ca2+含量均明显高于对照植株，充分说明gmhdl57基因的超表达有利于细胞对k+和ca2+的吸收，从而调节细胞内的离子稳态平衡。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110>信阳师范学院
<120>hd-zipi类转录因子gmhdl57基因及应用
<141>2018-04-13
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1038
<212>dna
<213>glycinemax
<400>1
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<211>345
<212>prt
<213>glycinemax
<400>2
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