本发明属于分子生物学和医学检测技术领域，特别涉及一种冠心病易感基因检测分型试剂盒。
背景技术：
冠心病是危害人类健康乃至生命的常见病之一，已成为致死率首要的疾病，目前我国心血管病患者约2.9亿，每年约350万人死于心血管病。虽然近几年中国心血管病死亡率的上升趋势有所趋缓，但仍给社会和家庭造成沉重的负担。冠心病是由环境因素和遗传因素相互作用导致的，与冠心病相关的危险因素高达200多种，其中包括主要因素：血脂异常、高血压，吸烟，高血脂，2型糖尿病，年龄性别，肥胖，炎症，饮食习惯，遗传因素等，以及潜在因素：慢性炎症，血凝因子水平升高，胰岛素抵抗等。在众多的危险因素中，遗传因素在冠心病发病过程中起着重要的作用。
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是人类基因组中最常见的遗传变异之一，指在基因组上由于单个核苷酸的改变而导致的dna碱基多态性。snp与冠心病易感性关系的研究是目前冠心病遗传研究领域的一个热点，在各个种族和群体中都有大量的研究，迄今为止已经发现了大量与冠心病发病相关的易感基因，其中包括脂代谢、免疫炎症、肾素血管紧张素系统中的关键基因，对易感基因的检测为评估冠心病遗传风险和预防治疗提供重要线索。
全基因组关联分析研发发现，adtrp，c6orf10，cdkn2b-as1基因位点的多态性与冠心病的发病显著相关，因此，对这三个冠心病易感基因进行检测，能了解个体在冠心病方面的遗传因素，评估冠心病发病的相对风险，对与冠心病的早期诊断，早期干预具有积极意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种冠心病易感基因检测分型试剂盒，本发明公开了针对冠心病易感基因adtrp，c6orf10，cdkn2b-as1的变异位点，adtrp基因变异位点编号为rs6903956，c6orf10基因变异位点编号为rs9268402，cdkn2b-as1基因变异位点编号为rs10757274，位点的突变情况与冠心病的患病率显著相关。
本发明的一种冠心病易感基因检测分型试剂盒，包括：
adtrp基因特异性上下游扩增引物序列，如seqidno.1-2所示：
上游扩增引物：5'-acagagagagattccatctc-3'，
下游扩增引物：5'-gggttgaatttatagtatgg-3'；
c6orf10基因特异性上下游扩增引物序列，如seqidno.3-4所示：
上游扩增引物：5'-cttaatcaatggaatattat-3'，
下游扩增引物：5'-aatatatcttggagtatgtc-3'；
cdkn2b-as1基因特异性上下游扩增引物序列，如seqidno.5-6所示：
上游扩增引物：5'-atgggaggtactggtattac-3'，
下游扩增引物：5'-ccctctgattagaattccc-3'；
adtrp基因等位基因a、g特异性探针序列，如seqidno.7-8所示：
等位基因a特异性探针：5'-fam-agtgccatagattattactta-bhq-3'，
等位基因g特异性探针：5'-hex-agtgccataggttattactta-bhq-3'；
c6orf10基因等位基因a、g特异性探针序列如seqidno.9-10所示：
等位基因a特异性探针：5'-fam-tgaacatccagattgaagac-bhq-3'，
等位基因g特异性探针：5'-hex-tgaacatccggattgaagac-bhq-3'；
cdkn2b-as1基因等位基因a、g特异性探针的核苷酸序列如seqidno.11-12所示：
等位基因a特异性探针：5'-fam-tgagtgttgagacataattg-bhq-3'，
等位基因g特异性探针：5'-hex-tgagtgttgggacataattg-bhq-3'。
所述试剂盒还包括阴性质控品、阳性质控品和空白对照。
所述试剂盒的检测对象为人类基因组dna。
有益效果
与现有技术相比，本发明首次公开了可用于检测冠心病相关易感基因adtrp，c6orf10，cdkn2b-as1变异位点的试剂盒。由于adtrp，c6orf10，cdkn2b-as1基因的多态性变异与冠心病的患病率显著相关，以检测此三个基因多态性为基础的试剂盒可方便快捷的在分子水平上实现对冠心病患病风险的检测，检测效率高，针对性强，有助于冠心病的早期预防和治疗，同时还能辅助冠心病的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等。
附图说明
图1为实施例1中adtrp基因rs6903956位点分型结果图。
图2为实施例1中c6orf10基因rs9268402位点分型结果图。
图3为实施例1中cdkn2b-as1基因rs10757274位点分型结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
利用荧光定量平台检测冠心病易感基因多态性。
1、募集研究对象：采用调查表的形式调查志愿者的一般情况，同时采取口腔黏膜细胞，放入1.5ml离心管中，4℃储存。
2、提取基因组dna：使用天根生化科技有限公司的口腔拭子基因组dna提取试剂盒，产品编号dp322，按照操作说明提取口腔黏膜细胞基因组dna。以0.8％琼脂糖凝胶电泳确定dna质量和浓度。
3、基因多态性检测：采用荧光定量技术对多态性位点进行分型，此技术的基本原理：在pcr反应体系中引入2种5'端采用不同荧光染料标记的寡核苷酸(探针)，两条探针分别可以与2种基因型的碱基进行配对，探针的3'端连接淬灭基团。正常情况下，由于探针的5'端荧光基团和3'端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着pcr反应的进行，与基因组样本能够互补的探针逐渐被dna聚合酶5'→3'的外切酶活性切割，导致探针5'端上的荧光基团与3'端的淬灭基团分离，淬灭效应失效，从而荧光报告基团被激活，通过相应仪器检测荧光值可以被检测到；而与模板不能互补的另一条探针无法被聚合酶切割，因此检测不到相应的荧光信号，根据检测到的荧光信号波长，可以判断样本的基因型。本次研究采用primer3在线软件进行引物设计，然后进行引物合成，具体引物如表1所示。
表1adtrp、c6orf10和cdkn2b-as1基因扩增的pcr引物
4、荧光pcr检测：将50ngdna分别加入到各自的50ulpcr体系中，其中每个反应体系包含100nmol每对特异引物，150nmol每对特异探针，1x探针法分型mix(天根生化，中国，fp211)。同时设置阴性对照。荧光pcr检测仪为cfx96(biorad)，pcr反应程序为：95℃变性3分钟；95℃变性30秒，50℃复性延伸30秒，35个循环。最终循环后检测荧光信号。
5、检测结果分析：利用上述反应体系对样本进行检测，使用bio-radcfxmanager(biorad)软件对采集数据进行自动分析，adtrp基因rs6903956位点分型分析结果如图1所示，其中圆点表示fam信号值显著高于hex信号值，富集于x坐标轴，判读为aa基因型，三角表示fam信号值与hex信号值接近，富集于中部，判读为ag基因型，方块表示hex信号值显著高于fam信号值，富集于y坐标轴，判读为gg基因型，菱形富集于坐标原点，为阴性对照。c6orf10基因rs9268402位点分型分析结果如图2所示，其中圆点表示fam信号值显著高于hex信号值，富集于x坐标轴，判读为aa基因型，三角表示fam信号值与hex信号值接近，富集于中部，判读为ag基因型，方块表示hex信号值显著高于fam信号值，富集于y坐标轴，判读为gg基因型，菱形富集于坐标原点，为阴性对照。cdkn2b-as1基因rs10757274位点分型分析结果如图3所示，其中圆点表示fam信号值显著高于hex信号值，富集于x坐标轴，判读为aa基因型，三角表示fam信号值与hex信号值接近，富集于中部，判读为ag基因型，方块表示hex信号值显著高于fam信号值，富集于y坐标轴，判读为gg基因型，菱形富集于坐标原点，为阴性对照。
对比例1
采用其它常用检测方法(pcr-ldr、snapshot、sanger测序、限制性片段长度多态性)对样品进行检测，并与本发明试剂盒的检测方案进行对比结果见表2，可知综合各项对比参数可知本发明的试剂盒，耗时最短，检测效率明显高于其他检测方法。
表2不同检测方法对比结果
sequencelisting
<110>东华大学
<120>一种冠心病易感基因检测分型试剂盒
<130>1
<160>12
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
acagagagagattccatctc20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gggttgaatttatagtatgg20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
cttaatcaatggaatattat20
<210>4
<211>20
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<400>4
aatatatcttggagtatgtc20
<210>5
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<212>dna
<213>人工序列
<400>5
atgggaggtactggtattac20
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<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
ccctctgattagaattccc19
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<211>21
<212>dna
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agtgccatagattattactta21
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agtgccataggttattactta21
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<400>9
tgaacatccagattgaagac20
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<211>20
<212>dna
<213>人工序列
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tgaacatccggattgaagac20
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tgagtgttgagacataattg20
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<213>人工序列
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tgagtgttgggacataattg20