本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用。
背景技术：
杆菌肽是由枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌产生的一种环肽类抗生素。杆菌肽作为一种广谱性抗生素，能有效的抑制革兰氏阳性菌（如梭状芽胞杆菌属、葡萄球菌属，链球菌属、棒状杆菌属和奈瑟球菌属等）及部分革兰氏阴性菌（如脑膜炎双球菌、流感杆菌、放线菌等）。并且，杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，且排泄迅速、没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。
杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸（orn）、d-苯丙氨酸（d-phe）、异亮组氨酸（his）、d-天冬氨酸（d-asp）、天冬酰胺（asn）、赖氨酸（lys）、d-谷氨酸（d-glu）、半胱氨酸（cys）、亮氨酸（leu）、异亮氨酸（ile）和缬氨酸（val）11种氨基酸。
杆菌肽是以氨基酸为前提物质，通过非核糖体合成酶进行合成的，其合成所需的氨基酸主要来源于培养基中的氮源豆粕和细胞自身合成。目前关于组成杆菌肽的这12种氨基酸在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌内的含量并不清楚，哪种或哪几种氨基酸是限制杆菌肽高产的关键氨基酸也尚不清楚，也就是说，赖氨酸是否是杆菌肽合成的限制性氨基酸以及赖氨酸的供给与杆菌肽产量之间的关系均尚无定论；并且，赖氨酸转运蛋白lyse（其合成基因为：lyse基因）在地衣芽胞杆菌中的具体功能也尚不清楚；再加上，细胞内的氨基酸具有严格、且复杂的调控机制，因此，通过改造地衣芽孢杆菌中的赖氨酸转运蛋白lyse是否能够提高抗菌肽的产量是无法预测到的。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌（bacilluslicheniformis）的方法，所得到的基因工程菌的杆菌肽产量有了大幅提升。
通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌dw2的基因组dna为模板，pcr扩增出lyse基因的上游同源臂和lyse基因的下游同源臂；再利用重叠延伸pcr方法将lyse基因的上游同源臂和lyse基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列a；
（2）采用限制性内切酶xbaⅰ和saci对步骤（1）得到的融合基因序列a进行双酶切，得到酶切基因序列a；
（3）准备质粒t2(2)-ori，并采用限制性内切酶xbaⅰ和saci对质粒t2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒t2(2)-ori；
（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列a连接到步骤（3）得到的酶切质粒t2(2)-ori中，得到lyse基因敲除质粒t2(2)-ori-lyse；
（5）将lyse基因敲除质粒t2(2)-ori-lyse转入地衣芽胞杆菌dw2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落pcr验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落pcr检测，得到lyse基因的上游臂或lyse基因的下游臂与地衣芽孢杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（6）挑选lyse基因的上游臂与地衣芽孢杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lyse基因的下游臂与地衣芽孢杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，pcr法筛选得到敲除lyse基因的地衣芽胞杆菌dw2δlyse；
其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌dw2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为cctccno：m2011344的地衣芽孢杆菌dw2；
所述地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna序列中的lyse基因为sequencelisting中所示。
本发明人首次尝试构建敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌dw2δlyse，得到了大幅提高地衣芽胞杆菌dw2的杆菌肽产量的技术效果，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与地衣芽孢杆菌dw2相比，通过本发明构建得到的地衣芽孢杆菌dw2δlyse的杆菌肽产量提高了10%以上。本发明的研究结果表明：敲除氨基酸转运蛋白基因lyse是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法。
本发明的目的之二在于根据上述通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2δlyse。
本发明的目的之三在于根据上述通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2δlyse在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：a种子发酵，b生产发酵。
所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/l蛋白胨，3-6g/l酵母浸出粉，7-10g/l氯化钠，ph7.0~7.2。
所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/l豆粕；15-40g/l玉米淀粉；4-8g/lcaco3和0.5-2g/l(nh4)2so4。
附图说明
图1为步骤（1）得到的lyse基因的上下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为dnamarker，泳道2为lyse基因的上游同源臂，泳道3为lyse基因的下游同源臂；
图2为步骤（1）得到的融合基因序列a的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为dnamarker，泳道2为步骤（1）得到的融合基因序列a；
图3为步骤（4）得到的敲除质粒t2(2)-ori-lyse进行菌落pcr验证图；其中，泳道1为dnamarker，泳道2为敲除质粒t2(2)-ori-lyse进行菌落pcr验证的条带；
图4为步骤（6）得到的敲除lyse基因的地衣芽胞杆菌dw2δlyse菌株的验证条带，泳道1为dnamarker，泳道2为地衣芽胞杆菌dw2δlyse的pcr验证条带；
其中，图1-图2中的dnamarker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
具体实施方式
通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌dw2的基因组dna为模板，pcr扩增出lyse基因的上游同源臂和lyse基因的下游同源臂；再利用重叠延伸pcr方法将lyse基因的上游同源臂和lyse基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列a；
（2）采用限制性内切酶xbaⅰ和saci对步骤（1）得到的融合基因序列a进行双酶切，得到酶切基因序列a；
（3）准备质粒t2(2)-ori，并采用限制性内切酶xbaⅰ和saci对质粒t2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒t2(2)-ori；
（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列a连接到步骤（3）得到的酶切质粒t2(2)-ori中，得到lyse基因敲除质粒t2(2)-ori-lyse；
（5）将lyse基因敲除质粒t2(2)-ori-lyse转入地衣芽胞杆菌dw2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落pcr验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落pcr检测，得到lyse基因的上游臂或lyse基因的下游臂与地衣芽孢杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（6）挑选lyse基因的上游臂与地衣芽孢杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lyse基因的下游臂与地衣芽孢杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，pcr法筛选得到敲除lyse基因的地衣芽胞杆菌dw2δlyse；
其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌dw2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为cctccno：m2011344的地衣芽孢杆菌dw2；
所述地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna序列中的lyse基因为sequencelisting中所示。
通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法的具体实施方式如下：
1、步骤（1）的具体操作步骤为：
以地衣芽孢杆菌dw2的基因组dna为模板，pcr扩增出lyse基因的上游同源臂（所用引物为lyse-f1和lyse-r1，如图1所示，lyse基因的上游同源臂为517bp）和lyse基因的下游同源臂（所用引物为lyse-f2和lyse-r2，如图1所示，lyse基因的下游同源臂为512bp）；再利用重叠延伸pcr方法将lyse基因的上游同源臂和lyse基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列a（如图2所示融合基因序列a为1029bp）；
其中，用于扩增lyse基因的上、下游同源臂的引物为：
lyse-f1：gctctagattcttccggaaaggttagtattt、
lyse-r1：gctgaccgctattttaagccctctgtgccaaaacgaacaa、
lyse-f2：ttgttcgttttggcacagagggcttaaaatagcggtca、
lyse-r2：cgagctctcaaaaaagacccacgccca；
2、步骤（2）的具体操作步骤为：
采用限制性内切酶xbaⅰ和saci对步骤（1）得到的融合基因序列a进行双酶切，得到酶切基因序列a（1023bp）；
3、步骤（3）的具体操作步骤为：
准备质粒t2(2)-ori（其中，质粒t2(2)-ori的构建方法为：将来自pe194质粒的194-ori、来自于pdg780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pbluescriptiisk(+)-x52328的puc-ori通过pcr反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，puc-ori的顺序连接。此构建方法参考文献下述文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441），并采用限制性内切酶xbaⅰ和saci对质粒t2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒t2(2)-ori（4250bp）；其中，所述的限制性内切酶xbaⅰ和saci限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
4、步骤（4）的具体操作步骤为：
将步骤（2）得到的酶切基因片段a与步骤（3）得到的线性质粒片段经t4dna连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落pcr验证（所用引物为：t2-f和t2-r）。若转化子的pcr验证结果为：如图3所示，在1287bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：敲除载体t2(2)-δlyse)；
将步骤（2）得到的酶切基因序列a连接到步骤（3）得到的酶切质粒t2(2)-ori中，得到lyse基因敲除质粒t2(2)-ori-lyse；并对lyse基因敲除质粒t2(2)-ori-lyse进行pcr验证，其验证引物为：
t2-f：atgtgataactcggcgta、
t2-r：gcaagcagcagattacgc；
5、步骤（5）的具体操作步骤为：
将lyse基因敲除质粒t2(2)-ori-lyse转入地衣芽孢杆菌dw2中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落pcr验证（所用引物为：t2-f和t2-r），得到阳性转化子；将阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的转接培养数次后，并以t2-f和δlyse-kyr为引物（或以t2-r与δlyse-kyf为引物）进行菌落pcr检测单交换菌株，扩增出1790bp或2819bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，δlyse-kyf和δlyse-kyr的序列为:
δlyse-kyf：cctgccgcaccaatacctta、
δlyse-kyr：tcttaaaaaggctgacgaagtc；
6、步骤（6）的具体操作步骤为：
将步骤（5）得到的pcr检测出现1790bp条带的单交换菌株和步骤（5）得到的pcr检测出现2819bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落pcr验证（引物为δlyse-kyf和δlyse-kyr）。若转化子的pcr验证结果为：在2446bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽孢杆菌dw2；在1971bp处出现电泳条带时，说明dw2的基因组上的lyse基因成功敲除，该转化子为阳性转化子。本发明的验证结果如图4所示，转化子的菌落pcr验证结果为：在1971bp处出现电泳条带，证明该转化子为阳性转化子。随后针对该阳性转化子进行dna测序进一步验证，得到双交换成功的lyse敲除菌株（即地衣芽孢杆菌dw2δlyse）。
本发明人还根据上述的通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到了地衣芽胞杆菌dw2δlyse。
本发明人根据上述的通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2δlyse在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：a种子发酵，b生产发酵。
本发明人根据上述地衣芽孢杆菌dw2δlyse在杆菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方。
表1
其中，上述实施例1-14中均采用本发明构建得到的地衣芽胞杆菌dw2δlyse菌株；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mllb培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子发酵的培养基（实施例1-14中的种子发酵的培养基均为液体培养基，若需要种子发酵培养基为固体培养基时，仅需在原有的种子发酵的培养基（即液体培养基）的配方的基础上加琼脂15~18g/l即可）后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500ml三角瓶中装入25～150ml的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2%（体积百分比），转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。本发明人采用高效液相色谱(hplc)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用agilent1200液相色谱仪检测；色谱柱为hypersilbdsc18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为a:b＝35:65(a相：100mlph6.0磷酸盐缓冲液到300ml水中混合均匀；b相：520ml甲醇与40ml乙腈混合均匀)；流速：1.0ml/min；柱温30°c；紫外检测器波长：254nm；进样量20μl。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出上述实施例1-14的生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。
表2
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌dw2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌dw2δlyse的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升（提高10%以上），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽孢杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。
序列表
<110>绿康生化股份有限公司
<120>通过敲除lyse基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
<130>ds-p18015
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>579
<212>dna
<213>地衣芽胞杆菌dw2(bacilluslicheniformis)
<400>1
atgagtattatagcttttctttcgtatgtgattatgacatccattacgcccggcccgagc60
aatattttaatgatgaatgaagcgcaaaggttcggctttacaggttcatggcgttttagc120
agcggtatcttggcggggtttgcagtacttgggattctcagcggtgcctttacaatcagc180
ctgtacaattggattcccgttgtagagccttattttaaacttgccggcgcgtgttatttg240
atttatttggctttgcaagtcggctttaccaaaaataaaaaacaggattccacagaagcc300
cgctcctcttttatatccggctttatatttcagctgatcaatattaaaagcattttgttc360
ttcttaaccgtaatgagcgcgttcgttttgccgttcaaccattccttgaaatcgacaatc420
tattatttggcattagccattgttctcgggtggctggcgctgctattatggtcgggattc480
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