组蛋白去甲基化酶LSD1作为心肌肥厚诊断和治疗的靶标及应用的制作方法

本发明涉及医药诊断和治疗技术领域，特别涉及组蛋白去甲基化酶lsd1作为心肌肥厚诊断和治疗的靶标及应用。

背景技术：

组蛋白去甲基化酶lsd1(kdm1a)作为第一种被发现的组蛋白去甲基化酶，可以特异性对于bat位点h3k9me1/2和wat位点h3k4me1/2进行去甲基化，而对该位点的h3k9me3和h3k4me3没有去甲基化活性。

metzger等人的研究表明：lsd1可以通过h3k9位的去甲基化活性，解除对与肾上腺素受体通路的抑制。肾上腺素受体是调节心肌肥厚的重要信号通路。h3k9me3特异性组蛋白去甲基化酶jmjd2b同样可以激活肾上腺素受体的转录活性。在h3k9me3特异性组蛋白去甲基化酶jmjd2c与lsd1协同下，肾上腺素受体相关基因的表达被激活。

多方面的证据表明lsd1是癌症中可能的治疗靶标。据报道，lsd1在多种肿瘤中过表达，包括成神经细胞瘤、er阴性的乳腺癌、膀胱癌、肺癌和结直肠肿瘤(schulte,j.h.,etal.cancerres2009,69(5),2065-71；lim,s.,etal.carcinogenesis2010,31(3),512-20；andhayami,s.,etal.intjcancer2011,128(3),574-86)。已显示，通过lsd1抑制引起的h3k4甲基化水平增加重新激活癌症模型中肿瘤抑制基因的表达(huang,y.,etal.clincancerres2009,15(23),7217-28)。另外，已发现lsd1与雌激素和雄激素受体结合导致抑制性h3k9标志的特异性脱甲基，从而增加靶基因表达(metzger,e.,etal.nature2005,437(7057),436-9；andgarcia-bassets,i.,etal.cell2007,128(3),505-18)。因此，取决于结合到lsd1的辅因子，通过lsd1引起的脱甲基可通过许可性h3k4和抑制性h3k9标志而促进癌症。因此，在许多癌症类型中，lsd1的抑制可能是重新表达表观遗传沉默的肿瘤抑制基因以及下调重要的癌症途径的有效策略。

然而，组蛋白去甲基化酶lsd1对心肌的影响则未见任何报道。

技术实现要素：

本发明通过大量实验发现：过表达组蛋白去甲基化酶lsd1可以减弱异丙肾上腺素导致的心肌肥厚，而抑制lsd1去甲基化酶活性则会导致心肌肥厚，所述过表达优选为过表达4倍以上；采用主动脉弓缩窄手术所导致的心肌肥厚模型中，lsd1表达水平发生改变，及组蛋白h3第4位赖氨酸一甲基化水平的升高和组蛋白h3第4位赖氨酸二甲基化水平的升高，以及组蛋白h3第9位赖氨酸一甲基化水平的升高和组蛋白h3第9位赖氨酸二甲基化水平的升高。

本发明通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供了一种心肌肥厚诊断靶标，所述靶标为组蛋白去甲基化酶lsd1。

以及一种心肌肥厚治疗靶标，所述靶标为组蛋白去甲基化酶lsd1。

具体的所述组蛋白去甲基化酶lsd1活性受到抑制，则判断为会导致心肌肥厚。

并且，所述组蛋白去甲基化酶lsd1参与了心肌肥厚中氧化应激相关蛋白表达水平的调控。

更为具体的是，还表现为组蛋白h3第4位赖氨酸一甲基化水平的升高和组蛋白h3第4位赖氨酸二甲基化水平的升高，以及组蛋白h3第9位赖氨酸一甲基化水平的升高和组蛋白h3第9位赖氨酸二甲基化水平的升高。

再者，本发明的另一目的在于提供组蛋白去甲基化酶lsd1在制备作为一种心肌肥厚诊断靶标的检测物的应用。

以及组蛋白去甲基化酶lsd1在制备作为一种心肌肥厚治疗靶标的检测物的应用。

所述应用中，组蛋白去甲基化酶lsd1活性受到抑制，则判断为会导致心肌肥厚。

具体地，所述应用中，组蛋白去甲基化酶lsd1参与了心肌肥厚中氧化应激相关蛋白表达水平的调控。

更为具体的是，还表现为组蛋白h3第4位赖氨酸一甲基化水平的升高和组蛋白h3第4位赖氨酸二甲基化水平的升高，以及组蛋白h3第9位赖氨酸一甲基化水平的升高和组蛋白h3第9位赖氨酸二甲基化水平的升高。

本发明相对于现有技术的有益效果包括：

现有技术仅将组蛋白去甲基化酶lsd1作为癌症中可能的治疗靶标，从作用机制上难以选择应用于心血管领域的靶标使用。

该组蛋白去甲基化酶lsd1可以减弱异丙肾上腺素导致的心肌肥厚，而抑制lsd1去甲基化酶活性则会导致心肌肥厚。lsd1去甲基化酶活性对肾上腺素受体通路引起的心肌肥厚起到了一定的调节作用。

附图说明

图1，实施例1中心脏体积检测示意图，其中，(左→右：对照组；异丙肾上腺组(iso)；og-l002组)，异丙肾上腺组和og-l002组心脏体积明显增大；

图2，实施例1中心脏室壁厚度检测示意图，其中，(左→右：对照组；异丙肾上腺组；og-l002组)，小动物超声结果提示异丙肾上腺组和og-l002组心脏室壁厚度增加；

图3，实施例1中采用qpcr检测心肌肥厚相关因子anp、α-mhc、mlc-2v的mrna表达水平检测结果；

图4，实施例1中采用westernblot检测心肌肥厚相关因子anp、α-mhc、mlc-2v的蛋白表达水平检测结果；

图5，实施例1中采用westernblot检测组蛋白h3k4me1、h3k4me2、h3k9me1及h3k9me2的组蛋白甲基化修饰水平检测结果；

图6实施例2中心脏体积检测示意图，其中，(左→右：对照组；假手术组；主动脉弓结扎手术组(3个)，主动脉弓结扎组心脏体积明显增大；

图7实施例2中采用qpcr检测心肌肥厚相关因子anp、α-mhc、mlc-2v及lsd1的mrna表达水平检测结果；

图8实施例2中采用westernblot检测组蛋白h3k4me1、h3k4me2、h3k9me1及h3k9me2的组蛋白甲基化修饰水平检测结果；

图9，实施例3中采用westernblot方法检测lsd1表达水平的变化；

图10，实施例3中心脏体积检测示意图，说明lsd1过表达可以抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚；

图11，实施例3中采用qpcr检测心肌肥厚相关因子anp、mlc-2vmrna的表达水平。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1

组蛋白去甲基化酶抑制剂可以诱发心肌肥厚实验

sd大鼠(140～180g)分为三组：对照组、异丙肾上腺组(iso)、lsd1抑制组(og-l002,selleckchem)，每组8只。异丙肾上腺组每天腹腔注射异丙肾上腺素2mg/kg；lsd1抑制剂组每天注射og-l00250μg/kg；对照组注射相同体积的生理盐水。

其中，og-l002的化学结构式如下：

给药三周后，处死sd大鼠，对其心脏进行取材。

参照图1和图2的实验结果可见：心脏体积检测示意图如图1，其中，左→右：对照组；异丙肾上腺组(iso)；og-l002组，异丙肾上腺组和og-l002组心脏体积明显增大；

心脏室壁厚度检测示意图如图2，其中，(左→右：对照组；异丙肾上腺组；og-l002组)，小动物超声结果提示异丙肾上腺组和og-l002组心脏室壁厚度增加。

并且，通过qpcr和westernblot测定相关因子。

采用qpcr检测心肌肥厚相关因子anp、α-mhc、mlc-2v的mrna表达水平检测结果如图3所示；

采用westernblot检测心肌肥厚相关因子anp、α-mhc、mlc-2v的蛋白表达水平检测结果如图4所示；

从上述结果可知，表现为肥厚因子表达水平的上调及心脏室壁厚度的增加，意味着有心肌肥厚的发生。

从前述检测结果可见：组蛋白去甲基化酶lsd1可以减弱异丙肾上腺素导致的心肌肥厚，而抑制lsd1去甲基化酶活性则会导致心肌肥厚。从心肌肥厚相关因子结果可见，lsd1去甲基化酶活性对肾上腺素受体通路引起的心肌肥厚起到了一定的调节作用。

实施例2

主动脉缩窄是指在动脉导管或动脉韧带区域的主动脉狭窄。是常用的小鼠和大鼠心肌肥厚模型的常用方法。本实例中采用主动脉弓缩窄手术，在sd大鼠体内构建心肌肥厚模型，观察组蛋白lsd1和h3k4和h3k9甲基化水平的影响。

sd大鼠(140～180g)分为四组：对照组、假手术组(sham)、主动脉弓结扎手术组(tac)，每组8只。主动脉弓结扎手术组成功建立心肌肥厚模型，参见图6和图7。

从实验结果可见，主动脉弓结扎手术成功导致了心脏体积大的变大以及肥厚因子表达的升高，说明该方法成功建立了心肌肥厚模型，参见图6和图7；组蛋白去甲基化酶lsd1表达水平的降低，参见图7；组蛋白h3第4位赖氨酸一甲基化水平的升高和组蛋白h3第4位赖氨酸二甲基化水平的升高，以及组蛋白h3第9位赖氨酸一甲基化水平的升高和组蛋白h3第9位赖氨酸二甲基化水平的升高，参见图8所示。

本实施例证明了心肌肥厚与组蛋白去甲基化酶lsd1表达和功能异常与心肌肥厚之间的因果关系。

实施例3

从以下实验和结果发现：过表达组蛋白去甲基化酶lsd1可以减弱异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚。

sd大鼠(140～180g)分为四组：对照组、病毒空载组(pef1a)、lsd1过表达病毒组(pef1a-lsd1)、异丙肾上腺素+lsd1过表达病毒组(iso+pef1a-lsd1),每组8只。

异丙肾上腺组每天腹腔注射2mg/kg异丙肾上腺素；对照组注射相同体积的生理盐水。包装lsd1过表达慢病毒，经超速离心浓缩后直接原位注射于心肌，同时给予腹腔注射异丙肾上腺素(iso)，3周后取材。采用westernblot检测lsd1的蛋白表达水平发现，实验成功实现了lsd1蛋白水平的过表达(图6)。发现过表达lsd1可以减弱由异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚过程(图7)，采用qpcr检测心肌肥厚相关因子anp、mlc-2v，发现iso联合lsd1慢病毒组(iso+pef1a-lsd1)中anp和mlc-2v的mrna表达水平并未升高(图8)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。