用于同时检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于同时检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法。

背景技术：

呼吸道腺病毒(respiratoryadenovirus,adv)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae,sp)和百日咳杆菌(bordetellapertussis,bp)是造成儿童呼吸道疾病的常见病原体，对婴幼儿健康造成很大的威胁，adv、sp和bp感染已成为全球性的问题。分子诊断技术可以满足对adv、sp和bp快速诊断的需求，并且由于它们的遗传物质都为脱氧核糖核酸，样本提取后不需要进行逆转录过程，可以直接进行分子检测，所以能够快速、准确地进行病原体筛选，从而配合以正确的治疗，减少抗菌药物的滥用。

呼吸道腺病毒是一种无外壳的双链dna病毒，已知的有68种，分为a、b、c、d、e、f和g七个亚群，会引起呼吸道感染的主要为b组的3型、4型和7型。可以引起多种临床疾病，如感冒、支气管炎和肺炎，还可以导致急性发热性咽喉炎、咽结膜炎等疾病，5岁及以下儿童为易感人群。呼吸道腺病毒感染起病缓慢，首先表现为发热、咳嗽等，高热(39～41℃)持续8～14天，起病后3～4天出现呼吸困难，肺部体征出现较晚，可见肺外病症如肾病、肝肿大等。呼吸道腺病毒感染可能会很严重，尤其对免疫力低下的病人，会出现呼吸衰竭、传播性感染、出血性膀胱炎、神经性疾病，甚至死亡。呼吸道腺病毒常经空气飞沫传播，密切接触(手-鼻)传播等。多发生在冬末、春初，在婴幼儿、家庭、医院及新兵等群体中常可引起流行。

肺炎链球菌是革兰氏阳性菌，菌体似矛头状，成双或成短链状排列，5％～10％正常人上呼吸道中携带此菌，一般不致病；有毒株其致病性，与荚膜有密切关系，尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年老体弱者易发生肺部感染。肺炎链球菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病，也是鼻窦炎、急性细菌性中耳炎和超过幼儿期的结膜炎的最常见原因。典型的大叶性肺炎起病急骤，病人有高烧、寒颤，开始时有阵发性干咳，不久有少量粘液痰，随后痰变黄色，呈粘脓性。据who估计，肺炎链球菌性疾病已经成为5岁以下儿童中疫苗可预防性疾病的首位致死因素，每年死于肺炎链球菌感染的人中5岁以下儿童占一半，甚至更多，发展中国家发生率与死亡率更高。

百日咳杆菌为革兰氏阴性菌，是小儿常见的急性呼吸道传染病，也能够感染青少年和成人。百日咳的特征为阵发性痉挛性咳嗽，咳嗽末伴有特殊的吸气吼声，病程较长，可达数周甚至3个月左右，故有百日咳之称。病人，尤其是症状轻微的非典型病人是重要的传染源，主要经飞沫传播。易感儿童接触病人后发病率接近90％，一岁以下患儿病死率高。百日咳潜伏期1～2周，发病早期(卡他期)仅有轻度咳嗽。细菌此时在气管和支气管粘膜上大量繁殖并随飞沫排出，传染性最大。1～2周后出现阵发性痉挛性咳嗽(痉挛期)，这时细菌释放毒素，导致粘膜上皮细胞纤毛运动失调，大量粘稠分泌物不能排出，刺激粘膜中的感受器产生强烈痉咳，呈现出特殊的高音调鸡鸣样吼声。形成的粘液栓子还能堵塞小支气管导致肺不张和呼吸困难、紫绀，此外可伴有呕吐、惊厥。4～6周后逐渐转入恢复期，阵咳减轻，趋向痊愈，但有1～10％病人易继发溶血性链球菌、流感杆菌等的感染。

现有技术针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的检测方法主要有分离培养法、免疫检测法、普通聚合酶链式反应(pcr)技术和荧光pcr法。培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析，例如从血液或胸腔积液培养分离获得肺炎链球菌仍是作为诊断的金标准。免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白。pcr法是核酸体外扩增技术，利用引物将待测目标基因在短时间内通过酶促化学反应扩增几十万甚至上百万倍。荧光pcr法是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因。

免疫法检测试剂针对的是样本中的抗原或者病原体引起机体产生的特异性抗体，且抗体检测有窗口期，在发病初期容易漏诊；免疫法检测灵敏度、特异性较低，样本易污染且干扰物质较多，浓度过高或者过低时都容易造成结果错判，需要重复检测、复查才能确诊，检测的可信度较差；采用培养法检测耗时较长，培养效果差，很多病原体无法培养，延误最佳治疗时机。普通pcr法扩增后处理时可能会有污染，可能导致假阳性，或对环境和科研人员造成潜在的污染或危害。

普通的荧光pcr检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是试剂盒一般为多管液态试剂构成，平时需要保存在-20℃环境中，在操作时需要将各管试剂按照比例混合使用，对于运输和保存条件、操作方法等方面有较高的要求，容易因保存不当和操作失误引起检测结果不可信。

呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌感染已成为全球性的问题，对儿童健康造成很大的威胁，世界范围内对这三种病原体快速检测的需求也越来越高，而市场上的产品却少之又少，且暂无已注册的利用荧光pcr法进行检测的产品。采用荧光pcr检测法快速、灵敏、特异。

因此，需要开发一种同时快速检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌三种病原体的试剂盒；本试剂盒利用荧光pcr分子技术，可以满足对adv、sp和bp快速诊断的需求，进行快速、准确地病原体筛选。目前利用荧光定量pcr法检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒市面上暂无已注册的同类产品，对这三种病原体的单项检测类产品也十分少，且全部为免疫检测法。但肺炎链球菌和百日咳杆菌有利用荧光pcr法检测的发明专利，其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量pcr仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，提供一种能在各种环境中简便易用，且可同时快速检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌三种病原体的试剂盒，同时能够保证检测的时效性、特异性和灵敏度。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该用于检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒包括含有检测试剂的检测管、阳性质控品和和无rnase水组成；其中，检测试剂单管分装，为干粉形态，包括有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及taqman荧光探针；

所述特异性保守序列的引物序列为：

所述特异性保守序列的引物序列为：

呼吸道腺病毒，seqidno.1和seqidno.2；

肺炎链球菌，seqidno.4和seqidno.5；

百日咳杆菌，seqidno.7和seqidno.8；

所述特异性保守序列的taqman探针序列为：

呼吸道腺病毒，seqidno.3；

肺炎链球菌，seqidno.6；

百日咳杆菌，seqidno.9。

上述技术方案可对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行快速准确检测，且能在各种环境中简便易用，保证了检测的时效性、特异性和灵敏度；针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌各自的保守序列上设计特异性引物探针，并在探针上标记不同的荧光信号，可以同时检测并区分出呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌；解决了低温保存和使用操作繁琐的问题，本发明的试剂盒中检测试剂为单管干粉，检测管内混合试剂经过干燥工艺制成干粉形态，每个检测管检测一个核酸样本，可在4℃低温或常温下保存，使用时仅需加入提取好的核酸样本即可上机检测；试剂盒内检测管试剂配方经过优化调整，处理为干粉形态，能够在4℃低温或常温下保存一年以上，不影响检测效果，使用时仅需加入样本即可上机检测，方便易用；试剂盒采用taqman探针荧光pcr技术，针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μl。其中，seqidno.1：cagctcagtcgaatcgca；

seqidno.2：cacatcaatcgactcgcag；

seqidno.3：gtctgtagagaggctctacggc；

seqidno.4：gacttgagctagcaca；

seqidno.5：ctgatgcctgtctacga；

seqidno.6：ctgtctgactgatcatcgtcctcatc；

seqidno.7：cagcgctagctgcaatcc；

seqidno.8：gctagctggctactgagc；

seqidno.9：cgtcctagactagcgttcaatacag。

优选的，所述检测试剂还包括有pcr缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、datp、dutp、dctp、dgtp、mgcl2、hotstarttaq酶和ung酶。

采用了ung酶/dutp防污染体系，能减少前次pcr反应产物带来的污染干扰；同时检测遗传物质都为脱氧核糖核酸的三种病原体，无需逆转录过程，直接添加hotstarttaq酶进行pcr扩增，过程一步完成；所使用的探针为5’端荧光标记的taqman探针，探针两端分别标记荧光报告基团(r)和荧光淬灭基团(q)的寡核苷酸。在探针完整时，即随机状态和无pcr产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光pcr扩增过程中，当特异的pcr产物与taqman探针发生杂交反应时hotstarttaq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。pcr每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板dna的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。

优选的，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nm；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nm；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度为0.5u～5u；所述datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均为0.1mm～2mm；所述mgcl2在扩增体系中的终浓度为1.5mm～10mm。

其中，m＝mol/l，是浓度单位；w/v为质量体积比；此外，酶的浓度是在一个反应体系里1u。

优选的，所述阳性质控品中含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的扩增基因序列的质粒。

优选的，所述检测试剂的制备方法为：

(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到pcr管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；

(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：

-50℃，1h，1大气压；

-40℃，5h，＜10pa；

-10℃，2h，＜10pa；

0℃，2h，＜10pa；

30℃，5h，＜10pa；

(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种前述试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：

(1)将样品的dna模板、无rnase水、阳性质控品分别加入不同的检测管中，盖好管盖，进行荧光pcr检测；

(2)pcr扩增反应的条件为：92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火延伸35～50s；40～45个循环；

(3)有效性判定：

无rnase水检测出的ct值为undet或40，且阳性质控品检测出的ct值≤35，否则实验视为无效；

(4)结果判读：

样本检测管ct值为undet或40，该样本结果判断为阴性，样本rna提取失败、待测样本中不含rna或含量低于检测限；

样本检测管ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测管ct值为38～40，需要复检一次，如果ct值仍为38～40，则判断为阴性；

按照以上判读方法，结合样本检测管检出的呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌对应荧光通道的ct值来判断三种病原体的检测结果。

本发明与普通荧光pcr法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：

1)特异性强：本发明的引物探针针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守区域序列设计，特异性强；

2)敏感性高：本发明能检测到10copies/μl浓度的目的基因序列；

3)易于保存：本发明的检测管内预装单管的干粉试剂，保存方便；

4)单管分型：在一个检测管内根据荧光信号的不同来区分三种病原体；

5)检测过程为闭管反应，且遗传物质都为脱氧核糖核酸，无需逆转录过程，可直接进行pcr扩增过程，并大大降低了污染及结果偏差的可能性；

6)操作简单快速：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成；

7)结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析；

8)安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需pcr产物的后处理，对操作员和环境都无危害。

附图说明

图1是本发明实施例1的pcr扩增曲线图；

图2是本发明实施例2的pcr扩增曲线图。

具体实施方式

实施例1：本实施例的用于检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒，含有检测试剂的检测管、阳性质控品和和无rnase水组成；其中，检测试剂单管分装，为干粉形态，包括有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及taqman荧光探针；

所述特异性保守序列的引物序列为：

所述特异性保守序列的引物序列为：

呼吸道腺病毒，seqidno.1和seqidno.2；

肺炎链球菌，seqidno.4和seqidno.5；

百日咳杆菌，seqidno.7和seqidno.8；

所述特异性保守序列的taqman探针序列为：

呼吸道腺病毒，seqidno.3；

肺炎链球菌，seqidno.6；

百日咳杆菌，seqidno.9。

检测试剂还包括有pcr缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、datp、dutp、dctp、dgtp、mgcl2、hotstarttaq酶和ung酶。

引物在扩增体系中的终浓度为100nm；所述探针在扩增体系中的终浓度为50nm；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.2％w/v；所述hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度为1u；所述datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均为0.5mm；所述mgcl2在扩增体系中的终浓度为5.5mm；阳性质控品中含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的扩增基因序列的质粒。

检测试剂的干粉形态制备方法为：

(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到pcr管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；

(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：

-50℃，1h，1大气压；

-40℃，5h，＜10pa；

-10℃，2h，＜10pa；

0℃，2h，＜10pa；

30℃，5h，＜10pa；

(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。

该试剂盒的反应体系为25μl，直接将提取的25μl样本核酸添加到单个检测管中。

试剂盒的操作和结果判定：

(1)将样品的dna模板(从人的痰液、咽拭子等中提取)、无rnase水、阳性质控品各25μl分别加入不同的pcr反应管中，配成反应体系，盖好管盖混匀离心，放入荧光定量pcr仪中进行荧光pcr检测；

(2)设置仪器中的pcr扩增反应的条件为：92℃预变性10min；94℃变性15s；58℃退火延伸40s；40个循环；

(3)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和ct值对检测结果进行分析；

(4)有效性判定：

无rnase水检测出的ct值为undet或40，且阳性质控品检测出的ct值≤35，否则实验视为无效；

(5)结果判读：

样本检测孔ct值为undet或40，该样本结果判断为阴性，样本rna提取失败、待测样本中不含rna或含量低于检测限；

样本检测孔ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测孔ct值为35-40，需要复检一次，如果ct值仍为35-40，则判断为阴性。

结合样本检测管检出的呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌对应荧光通道的ct值来判断三种病原体的检测结果。

图1为本发明的pcr扩增曲线图，其中1为荧光阈值，2为阴性对照，3为阳性质控品，4为呼吸道腺病毒阳性结果的样本，5为肺炎链球菌阳性结果的样本，6为百日咳杆菌阳性结果的样本。阳性质控品3检出三条扩增曲线，且ct值都＜35，阴性对照2无扩增曲线，表明结果有效；样本4和5均有扩增曲线，且ct值＜35，判定为阳性结果,；样本6扩增曲线的ct值＞35，建议重新检测。

实施例2：

用本发明的试剂盒分别检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌对应的质粒样本，以及三者混合质粒样本，浓度分别为10⁵copies/μl。按照与实施例1相同的方法进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒可以在一个检测管内同时检测三种病原体，且三个荧光信号通道互不干扰，结果见图2。其中1为荧光阈值，2为阴性对照，3为三者混合质粒，4为呼吸道腺病毒样本，5为肺炎链球菌样本，6为百日咳杆菌样本。阴性对照2无扩增曲线，混合质粒样本3检出三条扩增曲线，分别为三个通道，且ct值＜35，表明结果有效；样本4～6都只有一个通道有扩增曲线。

试验结果表明本试剂盒可以同时检出呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌，也可以检出单项且不干扰其他两项病原体的荧光信号通道。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，例如引物在扩增体系中的终浓度在100～1000nm范围内进行选择，探针在扩增体系中的终浓度在50～500nm范围内进行选择，海藻糖在扩增体系中的终浓度在1％～10％范围内进行选择，牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度在0.1％～5％范围内进行选择，hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度均在0.5u～5u范围内进行选择，datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均在0.1mm～2mm范围内进行选择，mgcl2在扩增体系中的终浓度在1.5mm～10mm范围内进行选择，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>南京岚煜生物科技有限公司

<120>用于同时检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法

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