一种小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养的制作方法

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法。。

背景技术：

骨髓间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。骨髓间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复研究。

目前常用的分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法有全骨髓法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、流式细胞仪法四种。

全骨髓法又叫贴壁法，是最早的骨髓间充质干细胞分离方法，全骨髓法是将冲出来的所有冲洗液离心清洗后，直接接种的培养方法，通过换液去除血细胞等不贴壁细胞，这种方法操作简单，但所得细胞成分复杂，细胞纯度不足。免疫磁珠法和流式细胞仪法，所得细胞纯度高，但这两种方法操作难度和成本较高，并且分选的过程对细胞的活性也有一定影响。

本发明采用密度梯度离心法，旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的小鼠骨髓间充质干细胞的方法，建立一套完善可靠的小鼠骨髓间充质干细胞体外培养技术。

技术实现要素：

根据上述问题，本发明提供了一种小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的小鼠骨髓间充质干细胞培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

一种小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法步骤包括：（1）腹腔注射肝素、再注射戊巴比妥钠麻醉处死icr小鼠；（2）将小鼠后腹面向上固定于板上，无菌条件下取股骨和胫骨，置于75%酒精浸泡消毒；（3）无菌操作台内，pbs清洗3次，剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔；（4）用10ml针管，吸取含双抗的培养基冲出骨髓，反复吹打；（5）收集冲下来的液体，用percoll分离液，密度梯度法离心，取中间界面处白色层；（6）白色层用含双抗的pbs液离心清洗两次；（7）取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；（8）细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5%co2环境中培养；（9）细胞形态鉴定；（10）elisa法检测；（11）rt-pcr检测。

其中，步骤（1）所述的戊巴比妥钠浓度为30mg/kg，肝素100u/kg。

其中，步骤（1）所选小鼠为3~4周龄，体重30~35g的icr小鼠

其中，步骤（4）所用的培养基含1%的双抗（100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素），防止细胞污染。

其中，步骤（5）所用的percoll分离液比重为1.073~1.082g/ml。

其中，步骤（5）所用的密度梯度法离心速度为350~400g，离心时间20~30min。

其中，步骤（8）所述完全培养基为l-dmem培养基，含10%胎牛血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5μg/ml的胰岛素。

其中，步骤（8）所述的培养瓶用3~4μg/cm²的多聚赖氨酸包被，培养条件为37℃、5%co2培养箱。

有益效果

本发明建立了一种简单、高效的分离培养原代小鼠骨髓间充质干细胞的方法，所得原代细胞经细胞形态学观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达90%以上，细胞纯度达96%以上。

本发明采用在传统上改进而来的密度梯度法，优于全骨髓法和免疫磁珠法，获得的细胞数量多，细胞损伤性小，分离充分，排除了细胞培养中红细胞和白细胞的干扰，细胞纯度更高。所得细胞活率高，细胞纯度96%以上，本发明所得小鼠骨髓间充质干细胞数量多、质量稳定、重复性好，满足体外实验对细胞数量和纯度的要求。

本发明采用多聚赖氨酸包被培养瓶，细胞生长状态好，可满足小鼠骨髓间充质干细胞实验的要求，多聚赖氨酸包被比apes包被制作更简单，更易保存，本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复研究。

附图说明

图1培养1d的小鼠骨髓间充质干细胞图片，200×。

图2培养7d的小鼠骨髓间充质干细胞图片，200×。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术通常理解的含义。

下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

本实验所用的实验仪器与试剂如下：外科手术器械一套，cck-8细胞计数盒（sigma，美国），倒置显微镜（xds-1a，上海），荧光显微镜（leica，美国），低温离心机（td24b-ws，上海），超低温冰箱（中科美菱），移液枪（eppendorf，美国），电子分析天平（sartorius，美国），超净工作台（hj-cj-1d，上海），co2细胞培养箱（sanyomco-17ai，日本），elisa试剂盒购于rd公司，青霉素-链霉素双抗于gibco购买，胎牛血清购买于bioind公司，多聚赖氨酸购买于美国gibco公司，pbs自制（8.0gnacl、0.2gkcl、0.2gkh2po4、1.44gna2hpo4溶于1000ml去离子水中，调整ph为7.2~7.4，非特殊指出，本专利所用的pbs皆为此配方），细胞培养瓶、离心管购于美国corning公司，锥虫蓝购买于美国biofer。

本发明提供的技术方案包括如下步骤：

1.将组织处理器械浸泡于体积分数75%乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；

2.选取3~4周龄，体重30~35g的雄性icr小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg和肝素100u/kg；

3.将小鼠麻醉后腹面向上固定于板上，喷洒75%酒精消毒，取股骨和胫骨，75%酒精浸泡消毒10min；

4.无菌操作台内，pbs清洗3次，剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔；

5.用10ml针管，吸取含1%双抗（100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素）的培养基冲出骨髓于100mm的培养皿中，反复吹打多次；；

6.收集冲下来的液体，制成4×10⁷ml/1单细胞悬液，加入含有percoll分离液的离心管中percoll密度梯度法，400g离心20min，取中间界面处白色层；

7.取出来的白色层用25ml含双抗的pbs液离心清洗两次，每次1500rmp离心5min，除去杂质；8.沉淀用含10%胎牛血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5μg/ml的胰岛素l-dmem完全培养基重悬，细胞计数板计数，在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片，用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止，置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数，细胞数/ml=四大格细胞总数/4×10⁴；

9.计数完成后再加入培养基将细胞密度调至1×10⁵个/ml，.接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中，置于37℃、5%co2环境中培养，24h后换液，此后2~3d换液一次；

10.细胞形态及生长情况观察：倒置显微镜下观察新鲜分离的骨髓干细胞呈单个游离态，活细胞形状规则，胞质明亮，细胞膜清晰，死细胞颜色暗淡，培养24~48h后大部分细胞牢固贴壁，4d后细胞开始增殖，生长良好，贴壁较均匀，倒置显微镜观察活体细胞形态：呈纤维状，梭形，有突起；约7d时，细胞汇合成片，其融合率可达到80％。；

11.细胞成活率测定：锥虫蓝排斥实验，吸取0.2ml原代细胞悬液加入0.2ml的0.4%锥虫蓝溶液，吹打均匀，然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入，至盖片下刚好充满悬液，在倒置显微镜下观察，若细胞核未被染色则提示细胞存活，如细胞核被染蓝，提示细胞死亡，计数四个大格子细胞数（四大格细胞总数/4×10⁴），计算细胞成活率：活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%；12.采用双抗体夹心elisa法底物为opd，检测od492值，白蛋白含量6天时达到高峰；

13.rt-pcr检测检测原代培养的小鼠骨髓间充质干细胞中albmrna和细胞色素p450酶系中的cyp2e1mrna的表达。

高倍显微镜下计数300个细胞，小鼠骨髓间充质干细胞纯度为96%以上。

本发明所得到的细胞数量多，细胞成活率达90%以上，细胞纯度达96%以上，为细胞移植和药物筛选等研究提供高质量的细胞资源。

以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。