本发明涉及生物制药技术领域，尤其是一种利用透性化细胞制备利巴韦林的方法。
背景技术：
利巴韦林(ribavirin)，化学名为1-β-d-呋喃核糖基-1-h-1,2,4-三氮唑-3-羧酰胺，是一种对dna和rna病毒均有较好的抑制作用的广谱抗病毒药物，具有作用位点多、不易产生耐药性、疗效高、毒性低，副作用小等特点，现已用于多种病毒的治疗。
目前利巴韦林的生产方法主要包括化学合成法、发酵法和酶法。化学合成法为目前报道最多、生产工艺最为成熟的一种方法，但存在反应条件苛刻，周期长，提取复杂，收率低，成本高，环境污染严重等不足；发酵法是向培养基中添加前体物1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺(tca)，利用枯草芽孢杆菌等特定微生物代谢合成利巴韦林，但依然存在生产周期长、容易污染杂菌、提取工艺复杂以及能耗高等缺点。
酶催化法是以嘌呤核苷磷酸化酶(pnpase)为催化剂，以廉价底物鸟苷和tca为原料合成利巴韦林。与化学法和发酵法相比具有反应时间短、副产物少、产物容易分离、原料来源广泛(供体核糖可以从多种核苷、核苷酸中获得)、操作简单、环境污染少、能耗少等优点。
在前期的研究中，申请人使用工程菌e.colibl21/pet-his-pupg过表达嘌呤核苷磷酸化酶，并通过固定化细胞技术多批次催化合成利巴韦林(zl201610060219.x)。但固定化操作的引入增加了生产成本，延长了生产周期。在现有技术的基础上，研究一种酶源可重复利用的全细胞催化制备利巴韦林的方法具有非常重要的生产实践价值。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用透性化细胞制备利巴韦林的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种利用透性化细胞制备利巴韦林的方法，向宿主细胞escherichiacolirosetta(de3)的基因组上整合来源于嗜热单孢菌thermobifidafusca的角质酶基因tfu，并使用t7启动子调控tfu基因的表达；构建含有枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的质粒pet-his-pupg并将其转入改造的宿主细胞中获得基因工程菌；培养基因工程菌并使用乳糖诱导同时表达角质酶以及嘌呤核苷磷酸化酶；直接收集细胞多批次催化合成利巴韦林。
优选的，上述利用透性化细胞制备利巴韦林的方法，具体步骤如下：
(1)在escherichiacolirosetta(de3)(购自于优宝生物，产品编号st1011)的基因组上整合含有t7启动子控制的嗜热单孢菌thermobifidafusca(atcc27730)的角质酶基因pt7-tfu，得到宿主菌rosetta*；
(2)构建含有枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的质粒pet-his-pupg，并将质粒导入宿主菌，获得工程菌rosetta*/pet-his-pupg；
(3)以工程菌为产酶菌株，使用发酵罐培养，利用乳糖诱导产酶后收集细胞：
(4)配制反应体系，经酶促反应得到利巴韦林转化液；离心收集细胞后再进行下一批次的催化反应。
优选的，上述利用透性化细胞制备利巴韦林的方法，还包括步骤(5)对每一批次的转化液进行检测，计算利巴韦林的浓度以及反应转化率。
优选的，上述利用透性化细胞制备利巴韦林的方法，所述步骤(1)中宿主菌rosetta*的具体构建方法为：以escherichiacolirosetta(de3)(购自于优宝生物，产品编号st1011)为出发菌，将温敏型质粒predcas9(质粒序列为序列表17所述序列)转化至出发菌感受态细胞中；在拟操作基因位点yghxy查找20bp的靶序列和pam位点，设计第一引物扩增靶序列并将其克隆到pgrb质粒(质粒序列为序列表18所述序列)上，得到2个重组pgrb质粒，各所述第一引物序列为序列表4、5、6、7所述序列。以出发菌基因组为模板设计第二引物扩增得到待操作基因的上、下游片段，各所述上、下游片段序列为序列表8、14所述序列，各所述第二引物序列为序列表9、10、15、16所述序列)；以嗜热单孢菌thermobifidafusca(atcc27730)基因组为模板设计第三引物扩增得到受t7启动子控制的角质酶基因片段pt7-tfu，所述片段pt7-tfu序列为序列表11所示序列，各所述第三引物序列为序列表12、13所示序列；以上、下游片段、pt7-tfu片段为模板，使用引物9和引物16进行重叠pcr获得重叠片段。将重叠片段和重组pgrb质粒一起转化含有predcas9质粒的出发菌感受态细胞；消除用于基因编辑的predcas9质粒以及重组pgrb质粒。
优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(2)中工程菌rosetta*/pet-his-pupg的构建方法为：以bacillussubtilis168(atcc23857)的基因组为模板设计包括酶切位点及保护碱基的引物并扩增表达嘌呤核苷磷酸化酶基因pupg，所述嘌呤核苷磷酸化酶基因pupg序列为序列表1所示序列，所述扩增引物序列为序列表2、3所示序列；将质粒pet-his(
优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(3)中工程菌的培养方法与诱导产酶方法为：将工程菌接种到斜面培养基中，37℃培养12-14h；无菌条件下吸取无菌水于3-5支活化斜面，使用无菌水将菌体重悬后接入含有发酵培养基的发酵罐中，通气量2-4l/min，搅拌转速200-500r/min，通过自动流加氨水控制ph在7.0-7.2，培养温度35-37℃，培养至od600＝12-14时，离心收集菌体。
优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述斜面培养基组成为(g/l)：蔗糖0.5-2，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，酵母粉2-10，氯化钠2-10，琼脂条10-30，ph7.0-7.2。
优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述发酵培养基组成为(g/l)：蛋白胨5-20，酵母粉2-10，kh2po40.5-2，nacl1-4，mgso4·7h2o0.5-2，葡萄糖1-4，乳糖10-20，ph7.0-7.2。
优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(4)中酶催化反应方法为：以步骤(3)中收集的细胞为催化剂，在20mmol/lph7.0-8.0的磷酸盐缓冲液中进行酶促反应，其中细胞浓度为20-40g/l，底物鸟苷和tca的浓度为50-200mmol/l，50-60℃反应16-28h生产利巴韦林。
优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(4)中磷酸盐缓冲液ph7.6，酶促反应温度55℃，细胞浓度30g/l，反应周期20h，最高转化率可达83.9％。
优选的，上述利巴韦林的制备方法，所述步骤(5)的具体方法包括：采用hplc法进行测定，使用agilent1260型高效液相色谱仪，进样量5μl，流动相为4％乙腈，柱温18.5℃，流速1ml/min，检测波长207nm。
本发明的有益效果是：
上述利巴韦林的制备方法，对产酶宿主菌进行基因工程改造，在基因组上整合t7启动子控制的角质酶基因，并向宿主菌中引入了含有嘌呤核苷磷酸化酶基因的pet-his质粒；在乳糖诱导的条件下同时表达角质酶和嘌呤核苷磷酸化酶；由于角质酶能够通过对磷脂的限制性水解，使细胞变得通透，更利于酶与底物的接触与反应，因此无需对细胞进行破碎提酶或者固定化处理，即可实现全细胞多批次催化反应，从而有效减少反应时间，降低批次生产成本，大大提高生产效率。
附图说明
图1hplc法来测定转化液中的利巴韦林浓度，其中，(a)利巴韦林标品(b)利巴韦林转化液。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
宿主菌rosetta*的构建
以escherichiacolirosetta(de3)为出发菌，将温敏型质粒predcas9电转至感受态细胞中。在出发菌拟操作的基因位点yghxy，使用crisprrgentools设计20bp的靶序列和pam位点，利用cedesignv1.03软件设计引物(引物序列见序列表4、5、6、7)，pcr获得相应的靶序列，利用clonexpressii试剂盒将20bp的靶序列克隆到pgrb质粒上，重组的pgrb质粒可转录出相应的grna用于基因组切割。以出发菌的基因组为模板分别设计引物，扩增待操作基因上游片段(片段序列见序列表8，引物序列见序列表9、10)、扩增受t7启动子控制的嗜热单孢菌thermobifidafusca的角质酶基因pt7-tfu片段(片段序列见序列表11，引物序列见序列表12、13)、扩增待操作基因下游片段(片段序列见序列表14，引物序列见序列表15、16)。采用重叠pcr方法将待操作基因yghxy的上游片段、外源基因pt7-tfu片段和待操作基因yghxy的下游片段连接，重叠的pcr片段和重组的pgrb质粒一起电转化含质粒predcas9的出发菌感受态细胞，再通过同源重组将pt7-tfu基因整合到基因组上。利用抗性实验和温度实验消除用于基因编辑的predcas9质粒以及重组的pgrb质粒。对宿主菌rosetta*进行菌落pcr验证。
实施例2
工程菌rosetta*/pet-his-pupg的构建
以bacillussubtilis168(atcc23857)基因组为模板设计引物并引入酶切位点及保护碱基，扩增表达嘌呤核苷磷酸化酶基因pupg(基因序列见序列表1，引物序列见序列表2、3)。质粒pet-his和扩增片段pupg分别经限制性内切酶bamhi和nhei双酶切，纯化回收后，使用连接酶solutioni在16℃连接12h，连接体系转化escherichiacolidh5α感受态细胞，涂布于ampr平板，37℃过夜培养。次日挑取平板上长出的单菌落进行菌落pcr，将初步验证为阳性的单菌落转接摇管，放大培养后提取其质粒，将其酶切后做进一步验证。将酶切验证正确的质粒转化宿主菌rosetta*中，获得工程菌rosetta*/pet-his-pupg。
实施例3
工程菌的培养以及诱导产酶
将工程菌接种到斜面培养基中，37℃培养14h。无菌条件下吸取适量无菌水于4支活化斜面，使用无菌水将菌体重悬后接入含有3l发酵培养基的5l发酵罐中，通气量3l/min，搅拌转速400r/min，通过自动流加氨水控制ph在7.0，培养温度37℃，培养至od600＝14时，离心收集菌体。
其中斜面培养基组成(g/l)：蔗糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，nacl5，琼脂条25，ph7.2。发酵培养基组成(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，kh2po41，nacl2，mgso4·7h2o1，葡萄糖2，乳糖15，ph7.2。
实施例4
全细胞多批次催化生产利巴韦林
以实施例3中收集的细胞为催化剂，在20mmol/lph7.6的磷酸盐缓冲液中进行酶促反应。其中细胞浓度为30g/l，底物鸟苷和tca的浓度各为100mmol/l，55℃反应20h生产利巴韦林。采用hplc法来测定转化液中的利巴韦林浓度，检测方法为agilent1260型高效液相色谱仪，色谱柱accurasilc18(5μm,250×4.6mm)，进样量5l，流动相为4％乙腈，柱温18.5℃，流速1ml/min，检测波长207nm。液相结果如图1所示。
第一次催化反应结束后，离心收集菌体，使用同样的反应体系再次进行催化。结果如表1所示，前四次的催化效率相当，转化率在81％以上，说明酶活力基本没有损失。第五次催化时酶活力有所下降，转化率为78.4％。
表1多次催化验证
上述参照具体实施方式对该一种利巴韦林的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
序列表
<110>天津科技大学
<120>一种利用透性化细胞制备利巴韦林的方法
<150>2017113996620
<151>2017-12-22
<160>18
<170>siposequencelisting1.0
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<211>816
<212>dna
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<222>(1)..(515)
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<212>dna
<213>温敏型质粒predcas9(质粒)
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<221>gene
<222>(1)..(15466)
<400>17
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