本申请涉及一种养生型绿茶黄酒的酿造工艺，属于用直接发酵法制备酒精饮料技术领域。
背景技术：
绿茶在《本草纲目》和《中华人民共和国药典》中都记载它具有镇惊安神、养阴熄风、清热解毒、养颜美容、明目祛翳、收敛生肌等多种功效，内服、外敷均有良好效果(倪莉，吕旭聪，黄志清，蔡琪琪，梁爽，饶平凡.黄酒的生理功效及其生理活性物质研究进展[J].中国食品学报，2012，03:1-7)。为提升绿茶的利用价值，某些地区有将绿茶放入高度白酒中进行浸泡的习惯。但绿茶属于矿物，其中的营养价值很难溶解和析出，此法不能充分利用绿茶中的营养成分，而且口感不佳。
黄酒是我国的民族特产，与啤酒、红酒并称为世界三大古酒，黄酒营养价值高，富含多糖、有机酸、维生素和氨基酸等营养成分外，还含有γ-氨基丁酸、生物活性肽和功能性低聚糖等功能性成分，被誉为“液体蛋糕”。《本草纲目》中记载了黄酒具有通曲脉、厚肠胃、润皮肤、养脾气、扶肝、除风下气的作用，有一定的抗衰老作用(国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010)[M].北京:中国医药科技出社，2010:383-386.)。
为充分发挥黄酒与绿茶的价值，本研究尝试利用黄酒中的酒精、酸性物质及多种微生物的发酵作用将绿茶中的有效成分溶解于黄酒中，以酿造而成一种新型绿茶养生黄酒，兼顾黄酒与绿茶的营养价值与抗衰老功效。
本申请案由此产生。
技术实现要素：
针对现有黄酒产业所存在的上述技术缺口，本申请提供一种养生型绿茶黄酒的酿造工艺，该工艺利用黄酒中的酒精、酸性物质及多种微生物的发酵作用将绿茶中的有效成分溶解于黄酒中，从而酿造成一种新型绿茶养生黄酒，兼顾黄酒与绿茶的营养价值与抗衰老功效。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：
一种养生型绿茶黄酒的酿造工艺，以谷物大米为原料，加水进行蒸煮后，再添加适量酒曲，依次进行糖化发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑，形成发酵原酒，所述的糖化发酵过程中添加有绿茶料，该绿茶料是由绿茶经前处理后添加到糖化发酵工序中并与发酵工序中的发酵液完成共发酵，绿茶相对谷物大米的添加质量比为2-8‰。
进一步的，作为优选：
所述的前处理为缓冲液溶解，绿茶用醋酸/醋酸钠缓冲液(1:25-30，即1克绿茶配于25-30毫升醋酸/醋酸钠缓冲液中)溶解后透析并浓缩至原来的三分之一，即可作为绿茶料投入糖化发酵工序中进行共酿。更优选的，所述的缓冲液pH为7.5-8.5，待处理绿茶置于该缓冲液中搅拌至无气泡时，升温至45-60℃加热20-50min后，抽滤烘干，并将所得溶解液进行蒸发浓缩，即得绿茶料。以缓冲液作为溶解液的原因在于：有效保护茶中抗氧化等具有保健功能的成份，其还可以有效去除绿茶中的苦涩成分，并使获得的绿茶料没有异味，确保绿茶中有效成分充分溶解的同时，有利于提高黄酒的口感。
上述经过浓缩后的浓缩液还可以采用黄酒原酱液做进一步溶解处理后，作为绿茶料投入到共酿工序中，黄酒原酱液是谷物大米经蒸煮、加酒曲糖化发酵第10-20天后所产生的原酱液。黄酒原酱液进行进一步溶解的原因是：该阶段的发酵液中含有丰富的酸性物质，可以很好的中和茶中的生物碱，其与绿茶直接投入到发酵工序中，可在主发酵前消除了茶叶中不适口感的物质，该方法的优势在于提高适口度，并同时脱除异味，提高最终绿茶黄酒的口感。
所述的绿茶料添加时间为糖化发酵中期和/或后期，更优选的，所述的绿茶添加时间为开始发酵的第10-20天，并优选为糖化发酵的第15天。绿茶料选择在糖化发酵中后期的原因是利用前发酵产生的酸性物质来处理茶叶中的不适口物质，该阶段的独特性是利用酒的原浆来处理茶中的不适物，这个阶段与绿茶料之间的配合性体现在互惠方面，也就是一方面减少酒的酸度，另一方面消除茶叶中的生物碱，最终达到较好的口感。该种方法与前文所述的黄酒原酱液存在一些区别：以黄酒原酱液进行进一步的溶解处理后再投入到共发酵阶段，可实现其中生物碱的良好中和，这些中和后的绿茶料再进入到共发酵工序中，完成共发酵并对残余生物碱进行彻底中和；而绿茶料添加时间的控制，则可以直接在共发酵中完成中和，工序更为简便。
所述的绿茶为粉碎状态，其前处理时的目数为1000-1500目。
为探讨绿茶对黄酒酿造工艺及营养功能的影响，本申请在传统黄酒工艺的基础上，在发酵的中期或后期，将分别经过原酒液处理和缓冲液+透析两种方法处理的绿茶(处理后的绿茶可称为绿茶料)，进一步加入发酵液中继续发酵，从而获得一种新型的绿茶黄酒。将该绿茶黄酒通过小白鼠活体实验进一步研究其抗衰老功能，结果显示：绿茶黄酒主要营养指标比常规黄酒均有所提高，其总糖含量随绿茶含量升高而升高(最高可达9.3％)，氨基酸态氮含量升高(p＜0.05)，各组之间氧化钙含量差异显著(p＜0.05)；超氧阴离子、羟基自由基清除率增强(p＜0.05)。与对照组和普通黄酒组相比，绿茶黄酒组小鼠血清及肝组织的SOD活力显著增强(p＜0.05)，MDA含量显著降低(p＞0.05)。结果提示：绿茶可显著改善黄酒的发酵工艺，提高其营养功能，尤其是抗衰老功能。
附图说明
图1为本申请的工艺流程图。
具体实施方式
1.实验材料与仪器
1.1实验材料
(1)酿造材料
雅大牌高产酒曲；超细绿茶；优质糯米；水等。
(2)检测实验材料
五水硫酸铜；次甲基蓝；酒石酸钾钠；氢氧化钠；铁氰化钾；浓盐酸；甲醛溶液(36％-38％无缩合沉淀)；钙指示剂；氯化镁；盐酸羟胺；三乙醇胺；硫化钠；氢氧化钾；EDTA；Tris-HCl缓冲液；邻苯三酚；硫酸亚铁；硫酸；双氧水；水杨酸。
(3)小白鼠活体实验材料
SOD、MDA试剂盒(购于南京生物建成生物工程研究所)。
1.2仪器设备
酒坛；纱布；烧杯；电子天平；电饭锅；饭勺；大托盘；恒温水浴锅；电磁搅拌器；透析膜；抽滤机；旋转蒸发器；电炉；烘干箱；水浴锅；坩埚；滴定管一套；酒精计；冷凝管；水银温度计；锥形瓶；铁架台；蒸馏烧瓶；量筒；自动定位滴定仪；磁力搅拌器；分光光度计(722)；离心机；移液器；酶标仪。
2.实验方法
2.1绿茶黄酒酿造工艺
在本实施例中，绿茶黄酒的酿造流程参见图1所示，即：黄酒是以谷物大米为原料，利用酒曲中的微生物作用经过蒸煮工艺、加曲、糖化工艺发酵工艺、压榨制取、过滤清液、煎酒、贮存保藏、勾兑而成的发酵原酒。在上述过程中，在糖化发酵期间投加绿茶料，绿茶料选择在糖化发酵中后期的原因是：利用前发酵产生的酸性物质来处理茶叶中的不适口物质，该阶段的独特性是利用酒的原浆来处理茶中的不适物，这个阶段与绿茶料之间的配合性体现在互惠方面，也就是一方面减少酒的酸度，另一方面消除茶叶中的生物碱，最终达到较好的口感。
在实验过程中，同时设置一组空白组作为对照组，该对照组按照：黄酒是以谷物大米为原料，利用酒曲中的微生物作用经过蒸煮工艺、加曲、糖化工艺发酵工艺、压榨制取、过滤清液、煎酒、贮存保藏、勾兑形成发酵原酒，整个加工流程中不添加绿茶。
2.2绿茶处理方式
绿茶料以绿茶作为原料，将其进行预处理后再使用。绿茶转变为绿茶料的处理方法有两种方式：
(1)醋酸醋酸钠缓冲液处理绿茶
将绿茶用醋酸/醋酸钠缓冲液(pH＝7.5-8.5，主要也是保护茶的有效成份及消除涩味)溶解。将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌，搅拌的过程中产生大量的气泡。待气泡变少之后，将其放入50℃的水浴中加热40min左右，在加热的过程中不断搅拌，除去绿茶中的腥臭味。用抽滤机进行过滤，烘干箱烘干，计算绿茶溶解量。对溶解的绿茶溶液进行透析(10h)与旋转蒸发，等蒸发浓缩至一定程度(至原来体积的三分之一)将溶有绿茶的缓冲液作为绿茶料投放到A组里进行共酿。
(2)黄酒原溶液处理绿茶
以上述(1)处理好的绿茶按绿茶：黄酒原溶液＝1:125-500的质量比进行充分混合，混合后的物质再投入在糖化发酵期间的糯米中，充分混合后进行主发酵。
2.3酒品质的质检
根据中华人民共和国黄酒国家标准对酒的品质进行测量，包括酒的总糖、酸度、酒精度、非糖固形物、氧化钙等含量；此外检测黄酒的超氧阴离子自由基及羟基自由基的清除率。
实验中使用铁氰化钾滴定法测总糖，该种方法适用干黄酒和半干黄酒；黄酒试样经100℃-105℃加热，其中的水分、乙醇等可挥发性物质被蒸发，剩余的残留物即为总固形物，总固形物减去总糖即为非糖固形物；黄酒酒精度测定，试样经过蒸馏，用酒精计测定蒸馏出液中酒精的含量；总酸及氨基酸态氮含量的测定，采用氢氧化钠标准溶液滴定的方法；钙离子浓度测定采用EDTA滴定法。
上述酒品质质检的测试标准为：中华人名共和国国家标准.黄酒.GBT 13662-2000。
2.4羟基自由基、超氧阴离子自由基清除率的测定
反应体系中依次加入50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.2)5mL，样品溶液0.2mL，混匀后在25℃水浴中保温20min，加入25℃预热的6mmol/L邻苯三酚溶液0.2mL，混匀反应4min，滴入2滴浓盐酸终止反应，在320nm波长下测定吸光度值为A1，A2为将邻苯三酚用等量体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光度值；A0为将样品溶液用等体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光度值。
分别向反应体系中加入1mL的9mmol/L FeSO4(现用现配，用煮沸过的蒸馏水，加少许硫酸，保存在棕色瓶中)，1mL的8mmol/L H2O2(现用现配)，混合均匀后加入1mL的9mmol/L水杨酸溶液和1mL蒸馏水。在37℃(±0.1℃)的恒温水浴中反应30min后，转入离心管中以10000r/min离心10min，取上清液在510nm波长下测其吸光度值，即为A0，A1为用1ml样品代替1ml蒸馏水，A2为用1ml蒸馏水代替1ml双氧水。
上述羟基自由基、超氧阴离子自由基清除率的测试标准参见：羟基和朝阳自由基的检测研究进展(张昊，任发政.光谱学与光谱分.Vol.29，No.4，p1093-1099，April，2009)。
2.5小鼠血清及肝组织匀浆的制备
在相对封闭的空间内用棉花蘸取乙醚，对小鼠进行麻醉。减去小鼠胡子，防止发生溶血。将小鼠按压在鼠笼上，拇指、食指、中指固定住头部，小指固定尾部。紧握颈部，压迫颈两侧，使眼眶突出，用弯头镊夹取眼球，捻动拇指与食指的方向，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入离心管。当血液流尽时，(颈椎)脱臼法处死小鼠。将离心管中的血静置2h，待血液凝固血块收缩后，4000r离心10min，取上清与干净的离心管中。
称取肝组织100mg，将其放入玻璃匀浆器管口剪碎，加入9倍体积的冷生理盐水进行匀浆，上下转动研磨，充分研磨，使组织匀浆化，看不到纤维状物质为止。
2.6小鼠血清、肝组织匀浆的SOD活力及MDA值得测定
根据南京建成生物工程研究所SOD、MDA试剂盒内的使用方法进行小鼠血清、肝组织匀浆的SOD、MDA测量。
2.7数据分析
应用SPSS 20.0统计软件进行方差分析，F检验，进一步多重比较采用LSD检验，比较实验组与对照组间的统计学差异，p＜0.05时差异具有统计学意义。
3.结果
黄酒按生产方法可分为传统工艺和新工艺两种。传统工艺采用天然微生物进行发酵；新工艺是采用纯种酵母发酵剂取代自然发酵过程，实现大工业化生产，即小型手工操作被大型发酵生产设备取代。
其中，新工艺的路线图为：洗米→浸米→蒸米→冷却→配曲→糖化→前发酵→后发酵→过滤→过滤→杀菌。
本研究是在新工艺的基础上，在后发酵期间(如发酵第15d)，将通过原酒液溶解或者缓冲液溶解并透析两种方式所获取的绿茶料分别加入黄酒中继续发酵，获得一种新型绿茶黄酒。其优点在于充分利用黄酒中的酒精、酸性物质及多种微生物的发酵作用将绿茶中的有效成分溶解于黄酒中，有效提升了传统黄酒的营养成分并改良其口感，使得酿造而成的绿茶养生黄酒，兼顾黄酒与绿茶的营养价值。
3.1不同梯度绿茶黄酒营养价值
表1不同梯度绿茶黄酒一般指标统计，n＝3，
由表1可知，在酿酒后发酵中添加绿茶料后，黄酒总糖、氨基酸态氮等几个影响黄酒品质的重要指标均有提高，且A组经透析后氧化钙含量能控制在国标以内(1g/L，中华人名共和国国家标准.黄酒.GBT 13662-2000)，A、B两组之间氧化钙含量差异不显著(p＞0.05)，说明透析效果还有待提高。从中也可以观察到不管以何种处理方式加入绿茶料，当其值为1g时，即相对谷物大米(本实施例中采用糯米)的添加量较低时，如表1中添加量为2‰(绿茶：糯米＝1:500)时，对总糖、氨基酸态氮等指标基本没有影响，当绿茶含量增加时(参见表1中的4‰、8‰时)，其效果才得以体现。
与空白组黄酒相比，两种方式处理后的绿茶料共酿形成的绿茶黄酒的总糖含量有所升高，但差异不显著，氨基酸态氮含量升(p＜0.05)。同时，两种方式处理后的绿茶料进行对比可以看出，原酒液处理(B组)方式的效果比缓冲液溶解并透析(A组)的效果好，这可能是因为在透析过程中一些有益于黄酒发酵的物质流失了。
从上述结果分析中可以发现：本申请酿造工艺获得的绿茶黄酒，其营养价值高于普通黄酒(对照组)，绿茶当中的许多特有成分(茶多酚、氨基酸、咖啡碱等上百种成份)通过溶解于原酒液或缓冲液当中，充分利用两种物质不同的化学特性，互惠互利，提升了口感，保护了有效成份不被破化；另一方面，初步处理的茶-酒原液再进一步与糯米混合进行黄酒的主发酵。还可利用茶的有效成份促进酿酒微生物的发酵(这与黄酒和茶提取物的简单勾兑有着本质的不同)，将糯米中的营养物质充分转化，大大提升了黄酒的营养价值。
3.2不同梯度绿茶黄酒自由基清除率
表2不同梯度绿茶黄酒自由基清除率，n＝3，
自由基和衰老之间存在密切的联系是大家所认同的(Free radical oxidation of brain proteins in accelerated enesenand its modulation by N-teri-brayl-alpha-phenylnitrone.Butterfiled D A，Howard B J，Yatin S，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(2)：p671-678；以及，Beckman K B，Ames A M.The free radical theory of aging matures.Physiol Rev，1998，78：p547-581)，维持体内适当的抗氧化剂和自由基清除剂，可以延长寿命推迟衰老(A theory based on free radical and radical and radiation chemistry.Harman D.Aging：J Geron，1958,11(3)：p298-300，以及Harman D.free radical theory of aging：increaseing the average life at birth and the maximum life span[J].Anti-aging Med，1999，2:199-208)，本申请通过上述两种处理方式，将绿茶以绿茶料的形式添加到黄酒发酵工序中，由表2可以发现，绿茶黄酒的自由基清除率明显高于普通黄酒(即对照组)，且超氧阴离子、羟基自由基清除率增强(p＜0.05)，该绿茶黄酒在抗氧化方面具有显著的效果。
3.3绿茶黄酒抗氧化性
表3血清和肝组织匀浆的SOD活力及MDA值，n＝10，
生物都离不开氧气，氧气参与新陈代谢，线粒体的呼吸和氧化磷酸化，产生能量。但是在氧气参与新陈代谢的同时也产生了自由基，引起细胞的衰老损伤。氧气在生物体内产生自由基时产生的第一个自由基便是超氧阴离子自由基，不仅自身有毒性，并且还可以经过反应生成其它氧离子自由基，进一步产生损害[4]；在生物体内产生的活性氧自由基(ROS)会导致DNA、蛋白质和脂质的氧化损伤，而其中的·OH是公认的反应活性最强和危害最大的活性氧自由基。
机体内有不同的抗氧化保护系统，用以清除体内的自由基，最主要的有：清除自由基的酶类，如SOD和主要来源于膳食的外源性抗氧化剂。从实验结果和表3可以看出，普通黄酒组和绿茶黄酒组MDA含量明显下降，SOD含量明显升高，表明黄酒具有清除机体内自由基的作用，且绿茶黄酒的清除能力明显比普通黄酒强；普通黄酒组和绿茶黄酒组SOD含量比空白对照组上升，但与对照组和普通黄酒组相比，采用本申请所获取的绿茶黄酒组中，小鼠的血清及肝组织匀浆的SOD活力增强(p＜0.05)，MDA含量降低(p＞0.05)。说明了普通黄酒与绿茶黄酒都有升高小鼠体内抗氧化酶类的活性的作用，并且绿茶黄酒的作用更强。
通过对黄酒抗氧化性体外研究表明，黄酒有较强的清除羟自由基、超氧阴离子能力。观察到在酿酒的过程中以不同的方式加入不同量绿茶，对黄酒的抗氧化能力有较大的影响。究其原因，一方面是黄酒当中的一些微量元素硒，参与机体的抗氧化过程，能够延缓衰老，预防心血管疾病，增强机体免疫力；黄酒中富含维生素，维生素中的VE具有多种生理功能，其中最重要的功能就是与谷胱甘肽过氧化酶协同作用，清除体内自由基，从而起到抗氧化、抗衰老的效果。另一方面，绿茶当中的许多特有成分(茶多酚、氨基酸、咖啡碱等上百种成份)通过溶解于原酒液或缓冲液当中，充分利用两种物质不同的化学特性，互惠互利，提升了口感，保护了有效成份不被破化；同时，初步处理的茶-酒原液再进一步与糯米混合进行黄酒的主发酵。还可利用茶的有效成份促进酿酒微生物的发酵(这与黄酒和茶提取物的简单勾兑有着本质的不同)，将糯米中的营养物质充分转化，大大提升了黄酒的营养价值。
综上，黄酒具有清除体内自由基，升高抗氧化酶类活性，延缓衰老的作用，并且如果在黄酒主发酵过程中加入一定量绿茶，会有更好的抗衰老效果(本实验做的就是利用黄酒前发酵产生的原浆液对绿茶进行预处理，再加入前发酵的糯米进行主发酵，从而产生更好的口感和营养)，该研究成果将为绿茶黄酒的科学饮用和进一步研究开发提供理论依据。
以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。