本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种基于苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类预测苹果果实硬度的方法。
背景技术：
：：果实成熟过程中除了色泽发生变化外，质地变化也是果实成熟的一个重要特征。果实质地性状是一个综合概念，包括果实的硬度、松实、脆韧、腻粗等特征，是果实采收和贮运过程中品质评价的重要指标。而果实硬度降低后容易受到物理和非物理损伤，如机械伤害和病菌侵染等。果实硬度高低与细胞壁中半纤维素和果胶的降解紧密相关(brummellandharpster，2001；roseetal.，2004；ngetal.，2013)，而参与果实软化过程的基因可以被分为两类：一类是结构基因，其编码的蛋白质可以直接参与细胞壁降解，如多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,pg；atkinsonetal.，2002；wakasaetal.，2006；quesadaetal.，2009)、果胶甲酯酶(pectinmethylesterase，pme；harrimanetal.，1991；carpitaandgibeaut，1993)；另一类是调控基因，其编码的蛋白质可以调控结构基因的转录水平。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是如何预测待测苹果的果实硬度。苹果的果实硬度越高，越易贮运。为解决上述技术问题，本发明提供了预测待测苹果果实硬度的方法。本发明提供的预测待测苹果果实硬度的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：检测待测苹果的苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类；“苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基”的待测苹果的果实硬度高于“苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类为脯氨酸残基和丙氨酸残基”的待测苹果。本发明提供的预测待测苹果果实硬度的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：检测待测苹果总rna的特定转录本中第225个密码子的核苷酸序列；所述特定转录本可为苹果转录因子erf4的编码基因转录得到的rna，其第1个密码子为起始密码子；“特定转录本中第225个密码子的核苷酸序列仅编码脯氨酸”的待测苹果的果实硬度高于“特定转录本中第225个密码子的核苷酸序列编码脯氨酸和丙氨酸”的待测苹果。本发明提供的预测待测苹果果实硬度的方法，具体可为方法三，可包括如下步骤：检测待测苹果总dna中苹果转录因子erf4的编码基因自5’末端起第673位的核苷酸种类；“苹果转录因子erf4的编码基因自5’末端起第673位的核苷酸种类仅为c”的待测苹果的果实硬度高于“苹果转录因子erf4的编码基因自5’末端起第673位的核苷酸种类为c和g”的待测苹果。本发明提供的预测待测苹果果实硬度的方法，具体可为方法四，可包括如下步骤：提取待测苹果的总rna并反转录为cdna，然后采用特异引物对进行pcr扩增，检测pcr扩增产物；“pcr扩增产物中具有序列表的序列7所示的dna分子且不具有序列表的序列8所示的dna分子”的待测苹果的果实硬度高于“pcr扩增产物中具有序列表的序列7所示的dna分子且具有序列表的序列8所示的dna分子”的待测苹果。上述方法四中，所述特异引物对可由用于扩增特异dna片段的两条引物组成。所述特异dna片段中具有苹果基因组中引物f1和引物r1组成的引物对的靶序列。所述引物f1可为如下h1)或h2)：h1)序列表的序列5所示的单链dna分子；h2)将序列5经过一个或几个核苷酸的替换和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子。所述引物r1可为如下i3)或i4)：i3)序列表的序列6所示的单链dna分子；i4)将序列6经过一个或几个核苷酸的替换和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的dna分子。上述方法四中，所述特异引物对可由所述引物f1和所述引物r1组成。本发明提供的预测待测苹果果实硬度的方法，具体可为方法五，可包括如下步骤：检测待测苹果总dna中是否具有序列表的序列7所示的dna分子和序列表的序列8所示的dna分子；“待测苹果总dna中具有序列表的序列7所示的dna分子且不具有序列表的序列8所示的dna分子”的待测苹果的果实硬度高于“待测苹果总dna中具有序列表的序列7所示的dna分子且具有序列表的序列8所示的dna分子”的待测苹果。上述任一所述的方法中，所述高于可为在统计学上的高于。本发明的还保护物质甲、物质乙或物质丙在预测待测苹果果实硬度中的应用。上述应用中，所述物质甲可为用于检测苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类的物质。上述应用中，所述物质乙可为用于检测特定转录本中第225个密码子的核苷酸序列的物质；所述特定转录本可为苹果转录因子erf4的编码基因转录得到的rna，其第1个密码子为起始密码子。上述应用中，所述物质丙可为用于检测苹果转录因子erf4的编码基因自5’末端起第673位的核苷酸种类的物质。上述应用中，所述物质丙具体可为所述特异引物对。本发明的还保护成套产品甲、成套产品乙或成套产品丙在预测待测苹果果实硬度中的应用。上述应用中，所述成套产品甲可为所述物质甲和记载有方法甲的载体；所述方法甲可为：“苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基”的待测苹果的果实硬度高于“苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类为脯氨酸残基和丙氨酸残基”的待测苹果。上述应用中，所述成套产品乙可为所述物质乙和记载有方法乙的载体；所述方法乙可为：“特定转录本中第225个密码子的核苷酸序列仅编码脯氨酸”的待测苹果的果实硬度高于“特定转录本中第225个密码子的核苷酸序列编码脯氨酸和丙氨酸”的待测苹果。上述应用中，所述成套产品丙可为所述物质丙和记载有方法丙的载体；所述方法丙可为：“苹果转录因子erf4的编码基因自5’末端起第673位的核苷酸种类仅为c”的待测苹果的果实硬度高于“苹果转录因子erf4的编码基因自5’末端起第673位的核苷酸种类为c和g”的待测苹果。下述a1)或a2)或a3)也属于本发明的保护范围：a1)苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类作为检测对象在预测待测苹果果实硬度中的应用；a2)特定转录本中第225个密码子的核苷酸序列作为检测对象在预测待测苹果果实硬度中的应用；所述特定转录本为苹果转录因子erf4的编码基因转录得到的rna，其第1个密码子为起始密码子；a3)苹果转录因子erf4的编码基因自5’末端起第673位的核苷酸种类作为检测对象在预测待测苹果果实硬度中的应用。本发明还保护上述任一所述特异引物对。所述特异引物对用于预测待测苹果果实硬度。上文中，所述果实硬度可为果皮硬度和/或果肉硬度。上文中，所述苹果转录因子erf4(mdp0000324718)，位于苹果基因组3号染色体，位置为chr3：27617815-27618556，所在contig为mdc022391.368：15777-16518。苹果转录因子erf4含有两个保守结构域，分别为ap2保守结构域和ear抑制结构域。上文中，所述苹果转录因子erf4可为蛋白质，自n端至c端依次可由区段ⅰ、区段ⅱ和区段ⅲ组成。所述区段ⅱ具体可为一个氨基酸残基。所述一个氨基酸残基为脯氨酸残基或丙氨酸残基。所述区段ⅲ可由四个氨基酸残基组成。四个氨基酸残基自n端至c端依次为psev。所述区段ⅰ可为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列3自n末端起第1至224位所示的多肽；a2)氨基酸序列是序列表中序列4自n末端起第1至224位所示的多肽；a3)将a1)或a2)所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的替换得到的与具有相同功能的多肽。a4)与a1)或a2)或a3)所示的多肽具有80％或80％以上同一性，来源于苹果且具有相同功能的蛋白质。上述a4)中，使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列表中序列3或序列4自n末端起第1至224位所示的氨基酸序列具有80％，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的氨基酸序列。上述任一所述苹果转录因子erf4可为如下d1)或d2)或d3)或d4)或d5)：d1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；d2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；d3)将d1)或d2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加得到的与具有相同功能的蛋白质；d4)与d1)或d2)或d3)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，来源于苹果且具有所述苹果转录因子erf4功能的蛋白质。上述d4)中，使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与编码所述苹果转录因子erf4的氨基酸序列具有80％，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的氨基酸序列。所述苹果转录因子erf4的编码基因可为如下x1)或x2)或x3)或x4)或x5)或x6)或x7)或x8)所示的dna分子：x1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；x2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；x3)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；x4)核苷酸序列是序列表中序列2所示的dna分子；x5)与x1)或x2)或x3)或x4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述苹果转录因子erf4的dna分子；x6)在严格条件下与x1)或x2)或x3)或x4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述苹果转录因子erf4的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。上述x5)中，使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列、或、本发明的编码序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。序列表中序列1由693个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列3所示的氨基酸序列。序列表中序列2由693个核苷酸组成，序列表中序列2的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。上文中，同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。在本发明的一个实施例中，红富士的苹果转录因子erf4可为序列表中序列3所示的苹果转录因子erf4-tc和序列表中序列4所示的苹果转录因子erf4-ag。编码苹果转录因子erf4-tc的基因如序列表中序列1所示。编码苹果转录因子erf4-ag的基因如序列表中序列2所示。实验证明，苹果转录因子erf4自n末端起第225位的氨基酸残基种类可以作为检测对象，预测待测苹果果实硬度。本发明具有重大的应用价值。附图说明图1为紫塞明珠与红富士杂交后代群体遗传连锁图谱(lod>2.8)。红色标记为苹果果实硬度的qtls位置。图2为苹果转录因子erf4-tc和苹果转录因子erf4-ag的氨基酸序列比对结果。图3为erf4-tc基因和erf4-ag基因的核苷酸序列比对结果。图4为红富士和紫塞明珠的果皮色泽表型、果皮硬度和果肉硬度的分析。图5为红富士和紫塞明珠的杂交后代株系的果皮色泽表型。图6为红富士和紫塞明珠的杂交后代株系的果皮硬度分析。图7为红富士和紫塞明珠的杂交后代株系的果肉硬度分析。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。栽培苹果‘红富士’(malusdomesticaborkhcv.‘redfuji’)和沙果‘紫塞明珠’(malusasiaticanakai.cv.‘zisaipearl’)均记载于如下文献中：敬小康，吕松，刘欣颖，王忆，吴婷，张新忠，韩振海，李天红.malusasiatica×m.domestica种间杂种苹果斑点落叶病感病性的qtl定位，中国农业大学学报，2014，19(6)：140-147；郑飞雪，张新忠，王忆，韩振海.苹果实生树个体发育不同阶段叶片h2o2含量及相关酶活性的变化，果树学报，2013，30(5)：759-764.，公众可从中国农业大学获得。栽培苹果‘红富士’(malusdomesticaborkhcv.‘redfuji’)在下文中简称红富士。沙果‘紫塞明珠’(malusasiaticanakai.cv.‘zisaipearl’)在下文中简称紫塞明珠。peasy-t1载体和hifimix均为北京全式金生物技术有限公司的产品。实施例1、苹果转录因子erf4的发现和编码苹果转录因子erf4的基因的克隆一、苹果转录因子erf4的发现分别于2014年和2015年，将红富士与紫塞明珠杂交后代的果实硬度进行遗传连锁分析。分析结果见图1：在红富士3号连锁群ctg1058426标记位置处，lod分数均达到峰值。本发明的发明人经过大量实验，在该位置处发现了苹果转录因子erf4(mdp0000324718)，其位于苹果基因组3号染色体，位置为chr3：27617815-27618556，所在contig为mdc022391.368：15777-16518。苹果转录因子erf4含有两个保守结构域，分别为ap2保守结构域和ear抑制结构域。二、编码苹果转录因子erf4的基因(即erf4基因)的克隆为便于描述erf4基因的结构，将erf4基因的起始密码子atg中的a的位置记作为“+1”，“-”代表erf4基因起始密码子atg的5’方向，“+”代表erf4基因起始密码子atg的3’方向。1、提取红富士果皮的总rna，然后反转录，得到第一链cdna。2、以步骤1得到的cdna为模板，采用引物f1和引物r1组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。引物f1：5′-ctcgcatctttctccaagcagc-3′(序列表中序列5)。引物r1：5′-ccggaaagaaagaaaagcggtgatc-3′(序列表中序列6)。反应体系(50μl)：由25μlhifimix、2μl引物f1水溶液(浓度为10μm)、2μl引物r1水溶液(浓度为10μm)、2μlcdna(含10-50ngcdna)和19μlh2o组成。反应程序：95℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，34个循环；72℃7min；4℃保存。3、将步骤2得到的pcr扩增产物和peasy-t1载体进行连接，得到重组质粒甲。由华大基因对步骤3得到的重组质粒甲进行测序。测序结果表明，重组质粒甲有两种类型，一种含有序列表中序列1所示的dna分子，命名为重组质粒甲-1；另一种含有序列表中序列2所示的dna分子，命名为重组质粒甲-2。序列表中序列1所示的核苷酸序列编码序列表中序列3所示的苹果转录因子erf4-tc。将编码苹果转录因子erf4-tc的基因(即序列表中序列1所示的核苷酸序列)命名为erf4-tc基因。序列表中序列2所示的核苷酸序列编码序列表中序列4所示的苹果转录因子erf4-ag。将编码苹果转录因子erf4-ag的基因(即序列表中序列2所示的核苷酸序列)命名为erf4-ag基因。将序列3和序列4所示的氨基酸序列运用dnaman和ncbi进行比对分析，实验结果见图2。将序列1和序列2所示的核苷酸序列运用dnaman和ncbi进行比对分析，实验结果见图3。结果表明，红富士的苹果转录因子erf4在ap2保守结构域(+171bp、+174bp)和ear抑制结构域(+672bp和+673bp)均存在天然突变，但仅在+673bp的核苷酸碱基的突变导致氨基酸残基发生突变；苹果转录因子erf4-tc自n端起第225位为脯氨酸残基，苹果转录因子erf4-ag自n端起第225位为丙氨酸残基。由此可见，红富士的苹果转录因子erf4自n端起第225位的氨基酸残基种类有两种，一种为脯氨酸残基，另一种为丙氨酸残基。按照上述步骤1至3，将红富士替换为紫塞明珠，其它步骤均不变，得到重组质粒乙。由华大基因对重组质粒乙进行测序。根据测序结果，判断苹果转录因子erf4自n端起第225位的氨基酸残基的种类。结果表明，紫塞明珠的苹果转录因子erf4自n端起第225位的氨基酸残基种类只有一种，为脯氨酸残基。实施例2、红富士和紫塞明珠的果皮色泽表型、果皮硬度和果肉硬度的分析待测苹果为红富士或紫塞明珠。1、将待测苹果的树苗(3棵)种植于北京市昌平区上庄八口试验基地。2、完成步骤1后，分别于种植第六年，待测苹果盛花后(dayafterflowerbloom，dafb)第50d、第80d、第110d、第140d或第170d，每棵树苗采集12个果实。3、取步骤2采集的果实，记录果皮颜色(拍照)。4、取步骤2采集的果实，采用ta.xt-21质构仪(stablemicrosystemsltd.，godalming，surrey，uk)分别测定果皮硬度和果肉硬度，然后取平均值。果皮颜色的结果见图4中a。果皮颜色结果如下：红富士盛花后第50d结幼果，盛花后第80d-140d果皮颜色一直保持绿色，盛花后第170d开始着色变红；紫塞明珠盛花后第140d果皮开始着色变红，盛花后第170d果皮全红。果皮硬度的检测结果见图4中b。果肉硬度的检测结果见图4中c。结果表明，随着果实的成熟，果皮硬度和果肉硬度均逐渐下降，具体为：红富士在幼果时(盛花后第50d)的果皮硬度和果肉硬度最高，盛花后第80d-110d果皮硬度和果肉硬度迅速降到较低水平，盛花后第110d-170d果皮硬度和果肉硬度缓慢降低；紫塞明珠的果皮硬度和果肉硬度的变化趋势和红富士的基本相似，但果皮硬度和果肉硬度的水平整体较高。实施例3、红富士和紫塞明珠的杂交后代株系的果皮色泽表型、果皮硬度和果肉硬度的分析一、红富士和紫塞明珠的杂交后代株系的果皮色泽表型、果皮硬度和果肉硬度的分析1、将红富士(父本)和紫塞明珠(母本)进行杂交，得到杂交f1代种子。2、完成步骤1后，将杂交f1代种子播种，得到杂交群体(由杂交f1代种子的幼苗组成)。将30个果皮硬度和果肉硬度有明显差异的杂交株系(分别命名为02-152、04-012、04-153、04-174、06-105、08-201、09-119、09-129、11-132、14-016、15-112、16-040、16-113、16-122、17-133、01-072、01-105、02-112、04-034、04-185、06-174、06-181、07-130、09-134、09-177、11-018、11-139、12-013、15-004和17-050)作为待测株系。3、将步骤2得到的30个杂交株系的树苗种植于北京市昌平区上庄八口试验基地。4、完成步骤3后，分别于种植第六年，杂交株系盛花后(dayafterflowerbloom，dafb)第50d、第80d、第110d、第140d或第170d，每棵树苗采集12个果实。5、取步骤4采集的果实，采用ta.xt-21质构仪(stablemicrosystemsltd.，godalming，surrey，uk)分别测定果皮硬度和果肉硬度，然后取平均值。将30个杂交株系根据果皮硬度的高低从高到低排序，前15个杂交株系(果皮硬度较高)组成第一组，后15个杂交株系(果皮硬度较低)组成第二组。第一组包括02-152、04-012、04-153、04-174、06-105、08-201、09-119、09-129、11-132、14-016、15-112、16-040、16-113、16-122和17-133。第二组包括01-072、01-105、02-112、04-034、04-185、06-174、06-181、07-130、09-134、09-177、11-018、11-139、12-013、15-004和17-050。6、取步骤4采集的果实，记录果皮颜色(拍照)。部分果皮颜色的结果见图5(a为第一组，b为第二组)。第一组的各个杂交株系盛花后第50d结幼果，盛花后第80d-140d果皮颜色一直保持绿色，盛花后第170d开始着色变红；第二组的各个杂交株系盛花后第140d果皮开始着色变红，盛花后第170d果皮全红。果皮硬度的检测结果见图6(a为第一组，b为第二组)。果肉硬度的检测结果见图7(a为第一组，b为第二组)。结果表明，30个杂交株系盛花后第50d-110d果皮硬度和果肉硬度均无显著差异；30个杂交株系盛花后第110d-170d，第一组的各个杂交株系的果皮硬度和果肉硬度显著高于第二组。二、检测红富士和紫塞明珠的杂交后代株系的苹果转录因子erf4自n端起第225位的氨基酸残基种类待测植株：02-152株系植株、04-012株系植株、04-153株系植株、04-174株系植株、06-105株系植株、08-201株系植株、09-119株系植株、09-129株系植株、11-132株系植株、14-016株系植株、15-112株系植株、16-040株系植株、16-113株系植株、16-122株系植株、17-133株系植株、01-072株系植株、01-105株系植株、02-112株系植株、04-034株系植株、04-185株系植株、06-174株系植株、06-181株系植株、07-130株系植株、09-134株系植株、09-177株系植株、11-018株系植株、11-139株系植株、12-013株系植株、15-004株系植株或17-050株系植株。1、提取待测植株果皮的总rna，然后反转录，得到第一链cdna。2、以步骤1得到的cdna为模板，采用实施例1步骤二1中(2)的引物f1和引物r1组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。反应体系同实施例1步骤二1中(2)的反应体系。反应程序同实施例1步骤二1中(2)的反应程序。3、将pcr扩增产物和peasy-t1载体进行连接，得到重组质粒。4、由华大基因对步骤3得到的重组质粒进行测序。根据测序结果，判断苹果转录因子erf4自n端起第225位的氨基酸残基的种类。结果表明，待测植株为02-152株系植株、04-012株系植株、04-153株系植株、04-174株系植株、06-105株系植株、08-201株系植株、09-119株系植株、09-129株系植株、11-132株系植株、14-016株系植株、15-112株系植株、16-040株系植株、16-113株系植株、16-122株系植株或17-133株系植株时，苹果转录因子erf4自n端起第225位的氨基酸残基种类只有一种，为脯氨酸残基；待测植株为01-072株系植株、01-105株系植株、02-112株系植株、04-034株系植株、04-185株系植株、06-174株系植株、06-181株系植株、07-130株系植株、09-134株系植株、09-177株系植株、11-018株系植株、11-139株系植株、12-013株系植株、15-004株系植株或17-050株系植株时，苹果转录因子erf4自n端起第225位的氨基酸残基种类有两种，一种为脯氨酸残基，另一种为丙氨酸残基。上述结果表明，根据待测苹果的苹果转录因子erf4自n端起第225位的氨基酸残基种类，可以预测待测苹果的果皮硬度和果肉硬度的高低。<110>中国农业大学<120>一种基于苹果转录因子erf4第225位的氨基酸残基种类预测苹果果实硬度的方法<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>693<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atggctccgacgacggccaagtccctacccaaatccggctctgaggaccagaatccgaca60tccaacgagatccggtaccggggtgtccggaagaggccttggggacgctacgccgccgag120atcagagatcccgggaagaagacccgcgtctggcttgggaccttcgacacagctgaggag180gcagcgcgtgcgtacgacaaggccgcgcgtgagtttcgcggaggcaaggcgaagactaac240ttccccaccccctctgagctccagctcgacgccgtcaacatcgtcaacatgaacaacgcc300gccaaatcagcggcggcgacgaacatcagcaacagtcccagcagccagagcagcaccgtg360gagtcctcctcgccgccgcctccgccgccactcgacctcactctcaaaagcccccgtttt420tccaccggcggcggctacttcaccgccgcgagcggcttccgcccgctccccgtgccccgt480cccgtgttcttcttcgacgccttcgcacgggccgacggcgccgccgccctccagctcgcc540cgcgaaacttgcaggttcgaccgccccgctcccgtatccggctcggcccacagcgactcc600tccacgtcctcggtcgtcgacttcgagcgtagctcccgcaacgtacggctcgatctcgac660ctgaacctccctcccccctcggaagtcgcctaa693<210>2<211>693<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2atggctccgacgacggcgaagtccctacccaaatccggctgtgaggaccagaatccgaca60tccaacgagatccggtaccggggtgtccggaagaggccttggggacgctacgccgccgag120atcagagatcccgggaagaagacccgcgtctggcttgggaccttcgacaccgccgaggag180gcagcgcgtgcgtacgacaaggccgcgcgtgagtttcgcggaggcaaggcgaagactaac240ttccccaccccctctgagctccagctcgacgccgtcaacatcgtcaacatgaacaacgcc300gccaaatcagcggcggcgacgaacgtcagcaacagtcccagcagccagagcagcaccgtg360gagtcctcctcgccgccgcctccgccgccactcgacctcactctcaaaaacccccgtttc420tccaccggcggcggctacttcaccgctgcgagcggcttccgcccgctccccgtgccccgt480cccgtgttcttcttcgacgccttcgcacgggccgacggcgccgccgccctccagctcgcc540cgcgaaacttgcaggtccgaccgccccgctcccatatccggctcggcccacagcgactcc600tccacgtcctcggtcgtcgacttcgagcgtagctcccgcaacgtacggctcgatctcgac660ctgaacctcccagccccctcggaagtcgcctaa693<210>3<211>230<212>prt<213>人工序列<220><223><400>3metalaprothrthralalysserleuprolysserglysergluasp151015glnasnprothrserasngluileargtyrargglyvalarglysarg202530protrpglyargtyralaalagluileargaspproglylyslysthr354045argvaltrpleuglythrpheaspthralagluglualaalaargala505560tyrasplysalaalaargglupheargglyglylysalalysthrasn65707580pheprothrprosergluleuglnleuaspalavalasnilevalasn859095metasnasnalaalalysseralaalaalathrasnileserasnser100105110proserserglnserserthrvalgluserserserpropropropro115120125proproleuaspleuthrleulysserproargpheserthrglygly130135140glytyrphethralaalaserglypheargproleuprovalproarg145150155160provalphephepheaspalaphealaargalaaspglyalaalaala165170175leuglnleualaarggluthrcysargpheaspargproalaproval180185190serglyseralahisseraspserserthrserservalvalaspphe195200205gluargserserargasnvalargleuaspleuaspleuasnleupro210215220proprosergluvalala225230<210>4<211>230<212>prt<213>人工序列<220><223><400>4metalaprothrthralalysserleuprolysserglycysgluasp151015glnasnprothrserasngluileargtyrargglyvalarglysarg202530protrpglyargtyralaalagluileargaspproglylyslysthr354045argvaltrpleuglythrpheaspthralagluglualaalaargala505560tyrasplysalaalaargglupheargglyglylysalalysthrasn65707580pheprothrprosergluleuglnleuaspalavalasnilevalasn859095metasnasnalaalalysseralaalaalathrasnvalserasnser100105110proserserglnserserthrvalgluserserserpropropropro115120125proproleuaspleuthrleulysasnproargpheserthrglygly130135140glytyrphethralaalaserglypheargproleuprovalproarg145150155160provalphephepheaspalaphealaargalaaspglyalaalaala165170175leuglnleualaarggluthrcysargseraspargproalaproile180185190serglyseralahisseraspserserthrserservalvalaspphe195200205gluargserserargasnvalargleuaspleuaspleuasnleupro210215220alaprosergluvalala225230<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5ctcgcatctttctccaagcagc22<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6ccggaaagaaagaaaagcggtgatc25<210>7<211>693<212>dna<213>人工序列<220><223><220><221>misc_feature<222>（90，301，325，410，574）<223>r为a或g<220><221>misc_feature<222>（42，174，420，447，557）<223>y为c或t<220><221>misc_feature<222>（171）<223>m为a或c<220><221>misc_feature<222>（18，41，505）<223>s为g或c<400>7atggctccgacgacggcsaagtccctacccaaatccggctsygaggaccagaatccgaca60tccaacgagatccggtaccggggtgtccgraagaggccttggggacgctacgccgccgag120atcagagatcccgggaagaagacccgcgtctggcttgggaccttcgacacmgcygaggag180gcagcgcgtgcgtacgacaaggccgcgcgtgagtttcgcggaggcaaggcgaagactaac240ttccccaccccctctgagctccagctcgacgccgtcaacatcgtcaacatgaacaacgcc300rccaaatcagcggcggcgacgaacrtcagcaacagtcccagcagccagagcagcaccgtg360gagtcctcctcgccgccgcctccgccgccactcgacctcactctcaaaarcccccgttty420tccaccggcggcggctacttcaccgcygcgagcggcttccgcccgctccccgtgccccgt480cccgtgttcttcttcgacgccttcscacgggccgacggcgccgccgccctccagctcgcc540cgcgaaacttgcaggtycgaccgccccgctcccrtatccggctcggcccacagcgactcc600tccacgtcctcggtcgtcgacttcgagcgtagctcccgcaacgtacggctcgatctcgac660ctgaacctccctcccccctcggaagtcgcctaa693<210>8<211>693<212>dna<213>人工序列<220><223><220><221>misc_feature<222>（90，301，325，410，574）<223>r为a或g<220><221>misc_feature<222>（42，174，420，447，557）<223>y为c或t<220><221>misc_feature<222>（171）<223>m为a或c<220><221>misc_feature<222>（18，41，505）<223>s为g或c<400>8atggctccgacgacggcsaagtccctacccaaatccggctsygaggaccagaatccgaca60tccaacgagatccggtaccggggtgtccgraagaggccttggggacgctacgccgccgag120atcagagatcccgggaagaagacccgcgtctggcttgggaccttcgacacmgcygaggag180gcagcgcgtgcgtacgacaaggccgcgcgtgagtttcgcggaggcaaggcgaagactaac240ttccccaccccctctgagctccagctcgacgccgtcaacatcgtcaacatgaacaacgcc300rccaaatcagcggcggcgacgaacrtcagcaacagtcccagcagccagagcagcaccgtg360gagtcctcctcgccgccgcctccgccgccactcgacctcactctcaaaarcccccgttty420tccaccggcggcggctacttcaccgcygcgagcggcttccgcccgctccccgtgccccgt480cccgtgttcttcttcgacgccttcscacgggccgacggcgccgccgccctccagctcgcc540cgcgaaacttgcaggtycgaccgccccgctcccrtatccggctcggccc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