本发明属于生物技术领域，涉及一个针对多种超突变型肿瘤进行分子分型的基因，及该基因在预判肿瘤免疫治疗短期缓解和长期获益情况中的应用。
背景技术
恶性肿瘤目前已成为一个全球性公共健康问题。近三十年以来，癌症发病数以年均3％‐5％的速度递增，癌症已成为人类第一位死因。手术、化疗和放疗是传统的癌症治疗手段，目前多数早期患者通过综合治疗后可以获得较好的预后，但这些治疗无法降低所有肿瘤患者的死亡率，因此急需发展更有效的治疗手段。自2012年新英格兰杂志报道了两个里程碑式的临床试验后，免疫治疗进入了迅猛发展的新时代。以抗pd‐1/pd‐l1药物为代表，已开展的大量临床实验显示了免疫治疗在恶性肿瘤治疗领域的广阔前景。如帕姆单抗(keytruda)，其适应症已经从非小细胞肺癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌等，扩展到了所有微卫星高度不稳定(microsatelliteinstability,msi)或错配修复基因系统缺陷(mismatchrepairdeficiency,dmmr)的实体瘤患者。而对于占患者多数的微卫星稳定型肿瘤，已有多个免疫治疗联合传统化疗的临床实验在实施。截止2017年下半年，全球肿瘤免疫疗法相关产品2004个，临床实验3024个，预计将会有多达58万名患者被招募，其中靶向pd‐1/pd‐l1的抗体，已有5个药物上市，160个正在开发中，涉及临床实验1502个。这些证据都表明免疫治疗将不再停留在标准治疗失败后的后线治疗，免疫治疗的地位将前移并且进入辅助治疗阶段，肿瘤免疫治疗已成为当今肿瘤治疗不可或缺的一环。
随着以抗pd‐1/pd‐l1为代表的各种免疫治疗应用范围日益扩大，筛选能从治疗中获益的患者，剔除不能获益的患者免于遭受免疫治疗相关不良反应的伤害，已经迫在眉睫。然而目前尚缺少理想的生物标志物用于筛选获益的患者。肿瘤组织的pd‐l1表达被证明在黑色素瘤等中与治疗缓解情况相关，高表达者可获益。但pd‐l1的检测方法、最佳界限、细胞异质性等都存在不确定性，并且pd‐l1的表达动态受治疗等因素的影响，因此尚不能准确预测治疗反应。肿瘤浸润淋巴细胞，如肿瘤边缘cd8+细胞密度等，也被认为和免疫治疗的反应密切相关。微卫星不稳定也是提示免疫治疗疗效的重要分子特征。在微卫星高度不稳定的结直肠癌中，突变的基因位点数量可以是其他结直肠癌的几十到上百倍，并表现为免疫反应的相关基因大量上调，大量肿瘤新生抗原导致的强免疫原性可能是免疫治疗良好反应的原因。但根据最近对8万多例各类肿瘤的测序结果表明，在有大量基因突变的超突变肿瘤中，微卫星不稳定占多数但不是全部，另外一大部分由pole或pold1的突变造成，这两个基因的功能性突变可造成细胞中基因错配修复系统的缺陷，进而导致肿瘤细胞中大量突变的出现。以上证据表明现有标志物并不能很好的提示免疫治疗的反应情况和最终受益可能，亟需筛选一个更佳的标志物，可以更好判断肿瘤患者能否从免疫治疗中获益，但考虑到临床实际应用的便利性，应该包括尽可能少的指标，并且能够在一次检测中完成。
结直肠癌是我国常见癌症之一。近几十年来，结直肠癌发病率年均上升3％～4％，但地区差异较大，如上海2012年发病率达56/10万。世界卫生组织国家癌症研究代表处(internatinalagencyforresearchoncancer,iarc)发表的globocan2012估算中国大陆结直肠癌标化发病率为14.2/10万，居世界第75位，标化病死率7.4/10万，据世界第78位。我国结直肠癌发病率和死亡例数分别占全世界发病和死亡总例数的18.6％和20.1％，均居第1位。根据国家癌症中心全国肿瘤登记数据报告，我国城市和农村地区结直肠癌发病率分别列所有恶性肿瘤的第3位及第5位，病死率分别居第4位和第5位。结直肠癌也是在免疫治疗方面走在前面的癌种，对免疫治疗敏感的微卫星不稳定型比例很高，相关各种临床实验在大量开展。因此我们对结直肠癌的基因组突变谱进行了深入分析，筛选得到了结直肠癌基因突变特征，并逐个在独立的结直肠癌队列上做了验证。基于该基因突变特征建立的预后预测模型可对结直肠癌进行分子分型，从而筛选能从治疗中获益的患者，剔除不能获益的患者免于遭受免疫治疗相关不良反应的伤害。
除结直肠癌以外，肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌等多种肿瘤也适用于免疫治疗，而且随着临床实验的大量开展，这个适用范围在日渐扩大。其他肿瘤的患者也亟需能判断能否从免疫治疗中获益的标志物。因此我们应用该基因预后预测模型对其他肿瘤也作了分析，以筛选可获益的患者。
技术实现要素：
本发明针对目前肿瘤免疫治疗进展迅速，临床实验大量开展，但缺少理想的生物标志物用于筛选肿瘤患者中适合人群的现状，提供了一个用于预判多种超突变型肿瘤免疫治疗的短期缓解和长期获益情况的基因及其检测试剂盒。
本发明提供一个用于超突变型肿瘤分子分型的基因，该基因为dock2基因。
本发明提供一种用于超突变型肿瘤分子分型的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括捕获本发明所述用于超突变型肿瘤分子分型的基因的探针。
其中，所述的检测试剂盒较佳地还包括：基因组dna提取试剂、文库构建试剂、二代测序试剂，选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、dna连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、pcr预混液、接头封闭剂、dna封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库pcr引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。
其中，所述基因组dna提取试剂为本领域常规的基因组dna提取试剂。
其中，所述文库构建试剂和二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能否满足对所得序列构建文库并进行二代测序的要求即可。所述的二代测序为本领域常规的二代测序。
本发明所述的检测试剂盒较佳地还包括从检测对象提取检测样本的器械；更佳地，还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械，所述器械较佳地为任何能用于取血的釆血针、注射器等。
本发明所述的检测样本较佳地为来自检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组dna即可。所述检测样本较佳地为组织样本、血液、血浆和体液中的一种或几种，更佳地为组织样本，更佳地为石蜡组织样本，优选地为肿瘤细胞含量高的组织。
本发明所述检测试剂盒适用于超突变型结直肠癌、超突变型肺鳞状细胞癌、超突变型皮肤黑色素瘤进行检测，使用方法如下：
(1)提取血液和组织样本中的基因组dna双链核酸；
(2)将步骤(1)的所述dna双链核酸变性处理得到dna单链，使用捕获探针捕获dock2基因的dna单链；捕获区域如下：染色体编号：chr5；区域位置：169064321～169509872；区域：外显子区域及外显子内含子交接区域。针对捕获对象设计探针为本领域的常用技术手段，探针的序列包括但不限于染色体编号：chr5；区域位置：169064321～169509872；区域：外显子区域及外显子内含子交接区域。。
(3)将步骤(2)所捕获的dna单链进行测序，得到血液和组织样本中的核酸序列；
(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理，计算组织样本中的dock2基因的变异位点数量。若变异位点数量为0，则为dock2野生型；若变异位点数量大于0，则为dock2突变型。
其中步骤(1‐4)所述的提取方法、文库构建、测序方法和基因变异位点计算方法均为本领域常规方法。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明所取得的有益效果是：本发明首次提出了可用于多种超突变型肿瘤的预后标志物，将dock2基因预后预测模型用于区分预后较差和预后较好的患者，可提示对两组患者使用不同的治疗方法，对预后差的患者应用免疫治疗可获得良好的收益，有较好的临床指导意义。
附图说明
图1显示了对超突变型的结直肠癌患者使用dock2基因模型预测风险的结果。与dock2野生型组的患者相比，dock2突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。该组患者来自zju和tcga混合数据集。
图2显示了对超突变型的结直肠癌患者使用tnm分期预测风险的结果，结果显示tnm分期不能区分此类患者的死亡风险。该组患者来自zju和tcga混合数据集。
图3显示了对超突变型的肺鳞状细胞癌患者使用dock2基因模型预测风险的结果。与dock2野生型组的患者相比，dock2突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。该组患者来自tcga数据集。
图4显示了对超突变型的肺鳞状细胞癌患者使用tnm分期预测风险的结果，结果显示tnm分期不足以区分此类患者的死亡风险。该组患者来自tcga数据集。
图5显示了对超突变型的皮肤黑色素瘤患者使用dock2基因模型预测风险的结果。与dock2野生型组的患者相比，dock2突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。该组患者来自tcga数据集。
图6显示了对超突变型的皮肤黑色素瘤患者使用tnm分期预测风险的结果，结果显示tnm分期不能区分此类型患者的死亡风险。该组患者来自tcga数据集。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列是实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书。
实施例1基因组dna样品的制备和肿瘤体细胞突变位点的测定
为检测结直肠癌的体细胞突变，本发明分两个阶段完成了338例结直肠癌组织标本的高通量测序，第一阶段完成了80例结直肠癌的高通量测序，其中10例为全基因组测序，70例为全外显子测序。通过第一阶段的高频基因分析，进一步结合tcga数据库和cosmic数据库中的高频基因，以及nccn遗传性结直肠癌诊疗指南，本发明设计了一个包括524个基因的基因群(表1)，定制了针对这个基因群的捕获探针，用于第二阶段的测序。第二阶段使用该捕获探针完成了258例结直肠癌组织标本的靶向测序工作。所有标本来自患者手术切除的组织标本，经病理诊断后多余的部分用于测序研究。此工作经浙江大学医学院附属第二医院人体研究伦理委员会批准进行。此部分338例肿瘤患者为zju数据集。
实施例2超突变型结直肠癌的基因突变预后预测模型的建立
由于现在批准上市的免疫治疗药物主要针对dmmr和msi‐h的肿瘤患者，这类患者在基因组水平的特征主要是表现为超突变。突变负荷率大于10mut/mb的肿瘤定义为超突变型肿瘤。实施例1中的338例结直肠癌(zju数据集)中，45例被确定为超突变型。另外为了验证模型的稳定性和普适性，本发明下载了来自tgca的结直肠癌数据共计382例作为独立验证的数据(tcga数据集)，根据同样的标准其中63例被定为超突变型结直肠癌。进一步，本发明要求大于24个月随访时间的患者数据用于预后模型的建立，因此来自zju数据集的45例为训练集，来自tcga数据集的24例为测试集，用于后续分析。
首先，本发明使用单因素比例风险回归模型评价了每个基因和总体生存时间之间的关系，使用zju数据集作为训练集，使用tcga数据集作为测试集。结果发现dock2基因是唯一的突变数量和总体生存时间显著相关的基因，在zju数据集中风险比为1.73(95％置信区间＝1.13‐2.65,p＝0.011)，在tcga数据集中风险比为2.08(95％置信区间＝1.05‐4.14，p＝0.036)。其次，本发明使用c‐index指数来评价预测的生存时间和实际的生存时间之间的符合情况，对测试集tcga数据集计算c‐index值为0.792。因此，针对超突变型的结直肠癌肿瘤，根据dock2基因的突变情况可判断超突变型结直肠癌患者的预后，该基因发生突变的患者的预后较差，而该基因为野生型的患者预后较好。
实施例3应用dock2基因预后预测模型分析来自zju和tcga数据集的结直肠癌
由于超突变型和微卫星不稳定的结直肠癌约占总体的15％左右，在单一数据集中患者数量较少，为进一步充分展示本发明的有益效果，本发明将来自zju和tcga的结直肠癌数据集整合，应用实例2中构建的dock2基因预后预测模型，分析了整合数据集中超突变型结直肠癌，根据表2中每个患者的dock2基因的突变情况，将其区分为dock2野生型组和dock2突变型组，见图1，与dock2野生型组的患者比较，dock2突变型组的风险比为1.54(95％置信区间＝1.11‐2.15，p＝0.019)。
表2
由国际抗癌联盟(uicc)和美国癌症联合委员会(ajcc)联合制订的恶性肿瘤tnm分期标准，是目前国际通用的决定癌症病期，判断患者预后，选择治疗方案的“金标准”。而由于超突变型结直肠癌的特殊性，tnm分期在超突变结直肠癌的预后判断上效果很差，如图2所示(p＝0.775)。与之相比，本发明所建立的dock2基因预后预测模型可以更好的预测超突变结直肠癌患者的预后，为临床医生选择治疗方案提供依据。
实施例4应用dock2基因预后预测模型分析来自tcga数据集的肺鳞状细胞癌
如前所述，免疫治疗已应用于多种肿瘤，且这些肿瘤中均存在dock2等基因的突变。本发明应用实例2中构建的dock2基因预后预测模型，分析了tcga数据集中的超突变型肺鳞状细胞癌。见图3，与dock2野生型组的患者比较，dock2突变型组的风险比为3.06(95％置信区间＝1.38‐6.77，p＝0.019)。应用tnm分期作为标准无法区分超突变型肺鳞状细胞癌的预后情况，如图4所示(p＝0.083)。与之相比，本发明所建立的dock2突变预后预测模型可以更好的预测超突变肺鳞状细胞癌患者的预后，为临床医生选择治疗方案提供依据。由于i期肺鳞状细胞癌患者的预后较好，此处未纳入分析。
实施例5应用dock2基因预后预测模型分析来自tcga数据集的皮肤黑色素瘤
本发明应用实例2中构建的dock2基因预后预测模型，分析了tgca数据集中的超突变型皮肤黑色素瘤。见图5，与dock2野生型组的患者比较，dock2突变型组的风险比为1.58(95％置信区间＝0.86‐2.88，p＝0.009)。应用tnm分期作为标准无法区分超突变型肺鳞状细胞癌的预后情况，如图4所示(p＝0.113)。与之相比，本发明所建立的dock2突变预后预测模型可以更好的预测超突变肺鳞状细胞癌患者的预后，为临床医生选择治疗方案提供依据。
实施例6结合肿瘤超突变特征分析肿瘤患者中免疫治疗获益人群的流程
应用本发明预测肿瘤患者是否可能从免疫治疗获益的流程如下，首先取得该患者手术切除的肿瘤组织块，提取基因组dna，确定该肿瘤是否为超突变型或者为微卫星不稳定型；其次，如确定为上述两种类型中的一种，则进一步测定dock2基因的全外显子突变情况，统计非同义突变数量，如数量大于0则为突变型，可能是免疫治疗的获益患者，否则为野生型，本身预后较好，从免疫治疗中获益的可能性较低。需要注意的是，在临床实践中患者接受免疫治疗能否获益取决于多种因素，不能完全由本发明的方法判断。本发明提示免疫治疗是否获益的依据，一是根据已有文献报道，认为超突变型的肿瘤在免疫治疗中具有较好的缓解率，二是根据临床统计数据，超突变型的肿瘤患者存在较大异质性，部分预后较好、不易发生复发转移，部分预后较差、较容易发生复发转移。因此本发明应用dock2单基因预后预测模型，得到了超突变型肿瘤中预后较差的部分患者，此部分患者若接受免疫治疗，短期内可能得到较好的缓解，长期而言可以在生存情况上获益。