本发明属于农业生物技术工程领域，涉及一个区分五个辣椒栽培种的indel标记开发及其应用。
背景技术：
辣椒属于茄科(solanaceae)辣椒属(capsicum)植物，相当长一段时间内，辣椒都没有具体的、标准的分类细则，给国际交流、国际育种和种质资源的共享带来了很多阻碍。1753年，linne首次将辣椒分为一年生椒(capsicumannuuml.)与灌木状辣椒(capsicumfrutescensl.)两大类。1898年，irish在linne分类的基础上将一年生辣椒分为7个变种：长形椒var.longum(d.c)sendt、朝天椒var.conoides(mill)irish、簇生椒var.fasciculatum(sturt)irish、线形椒var.acuminatumfingern、圆形椒var.grossuml.sendt、圆锥椒var.abberviatumfingern、樱桃椒var.cerasiforme(mill)irish。1923年，bailey认为linne所划分的灌木状椒与一年生椒划应为同一个种，采用c.frutescensl为种名，其下可分为五个变种：樱桃椒var.cerasiformebailey、圆锥椒var.conoidesbailey、长辣椒var.longumbailey、灯笼椒var.grossumbailey、簇生椒var.fasciculatumbailey。此外，还有斯密斯(smithandheiser，1951-1953)分类，费洛夫(а.й.фйjiов,1956)分类，加佐布希(в.ji.газебущ,1958)分类。
国际植物遗传资源委员会(ibpgr，1983)将辣椒划分32个种，包括栽培种、已被开发利用的其他种和未被人们利用的野生资源。以辣椒的形态特征为依据确定了辣椒的五个栽培种：一年生辣椒(capsicumannuuml.)、中国辣椒(capsicumchinensejacq.)、灌木状辣椒(capsicumfrutescensl.)、下垂辣椒(capsicumbaccatuml.)、柔毛辣椒(capsicumpubesensruiz&pavon)。目前，不同分类在各个国家仍有采用，但是为了便于学术交流和国际合作，各个国家开始逐步统一采用ibpgr的分类。
传统的植物分类都是以植物的形态特征为依据，即根据茎、叶、花、果实等器官的特征进行分类。虽然形态学方法简单直观，但易受环境的影响，可重复性不高。分子标记的稳定性好、信息量大、分析效率高、遗传多态性高，具有广泛的应用基础。插入/缺失多态性(insertion/deletion,indel)是由于等位基因位点处的dna序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失而产生的长度多态性变异。在整个基因组中，indel标记的多态性频率仅次于snp标记，远高于ssr标记。indel标记多态性可通过聚合酶链式反应(pcr)和琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等简单的步骤达到基因分型的目的。indel标记为共显性标记已广泛应用于高分辨率图谱构建、关联分析、基因定位和种质资源多态性分析等领域。
本发明采用一个indel标记即可区分辣椒的五个栽培种，在辣椒栽培种的区分和种间杂交种的鉴定等研究方面具有重大应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种区分五个辣椒栽培种的indel标记引物。
本发明的另一目的是提供该indel标记引物在区分五个辣椒栽培种中的应用。
一个区分五个辣椒栽培种的indel标记引物，由seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物组成。
本发明所述的indel标记引物在区分五个辣椒栽培种中的应用。
一个区分五个辣椒栽培种的indel标记方法，包括以提取的辣椒基因组dna为模板，利用权利要求1所述的indel标记引物进行pcr扩增，对pcr扩展产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，如果有100bp和91bp的分子标记谱带，则为一年生辣椒(capsicumannuuml.)；如果有97bp和91bp的分子标记谱带，则为灌木状辣椒(capsicumfrutescensl.)；如果有98bp和91bp的分子标记谱带，则为中国辣椒(capsicumchinensejacq.)；如果有94bp和91bp的分子标记谱带，则为下垂辣椒(capsicumbaccatuml.)；如果只有100bp的分子标记谱带，则为柔毛辣椒(capsicumpubesensruiz&pavon)。
其中，pcr反应体系：50ng/μl的dna模板0.5μl；10μmol/l的引物对0.5μl；10×pcrbuffer1.0μl；25mmol/lmgcl21.0μl；10mmol/ldntps0.25μl；5u/μltaqdnapolymerase0.1μl；ddh2o6.65μl；或者采用50ng/μl的dna模板0.5μl；10μmol/l的引物对0.5μl；2×
反应程序：94℃预变性3min；每个循环94℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，共30个循环；最后72℃延伸7min
有益效果
本发明的优点在于：本发明利用一个indel标记引物可快速准确的区分5个辣椒栽培种，可以对5个辣椒栽培种进行区分并用于鉴定五个栽培种的种间杂交种。所用indel标记引物操作方便、带型简单，且1个标记即可区分5个辣椒栽培种及其种间杂交种，在新种质的分类和杂交种的鉴定方面极大的节省了人力、物力和财力。
附图说明
图1indel标记indel-2-3b-22在5个栽培种材料中的扩增结果
m:maeker；1和2：capsicumannuum种材料；3和4：capsicumfrutescens种材料；5和6：capsicumchinese种材料；7和8：capsicumbaccatum种材料；9和10：capsicumpubescens种材料。
图2indel标记indel-2-3b-22在58份栽培种材料中的扩增结果
m:maeker；01～10：capsicumannuum种材料；11～21：capsicumfrutescens种材料；22～39：capsicumchinese种材料；40～53：capsicumbaccatum种材料；54～58：capsicumpubescens种材料。
具体实施方式：
实施例1
1.供试材料
重测序的两份材料包括：高代自交系材料g29，属于capsicumannuum，来源于江苏省农业科学院蔬菜研究所；pbc688，属于capsicumfrutescens，引种自亚洲蔬菜中心。用于验证标记准确性的58份辣椒材料，全部来源于国际植物种质中心(nationalplantgermplasmsystem，npgs)分别属于5个辣椒栽培种，其中序号1和9为pi194881分离出的2个纯合株系，26、27和28为pi241668分离出的3个纯合株系；详情见表1。
表1.用于验证标记准确性的58份材料
2.indel标记开发
利用重测序数据与参考基因组进行比对查找indel位点。参考基因组版本为pepper.v.1.55，下载网址http://peppergenome.snu.ac.kr/download.php。采用illuminahiseqtm2500测序平台对一年生辣椒(capsicumannuum)“g29”和灌木状辣椒(capsicumfrutescens)“pbc688”进行测序。利用bwa软件比对定位cleanreads在参考基因组上的位置。根据cleanreads在参考基因组的定位结果，使用samtools进行去重复(markduplicates)，gatk进行局部重比对(localrealignment)和碱基质量值校正(baserecalibration)等预处理，以保证检测结果的准确性，再使用gatk进行变异检测和校准，选取可靠的indel位点。根据预测到indel位点，基于辣椒基因组序列，取indel位点两翼各150bp碱基长度，共301bp长度进行引物设计。采用primer3.0进行引物设计，上游引物设计范围在1～145bp，下游引物设计范围为155～301bp，产物大小为100～250bp之间，退火温度在52～60℃。
3.基因组dna的提取
辣椒叶片放入1.5ml离心管中，液氮速冻研磨至粉末，立即加入700μl预热至65℃的2％的ctab抽提缓冲液，65℃水浴中提取30min，这期间轻轻倒置样品试管3次。加入700μl氯仿：异戊醇＝24:1抽提液，轻轻混匀抽提5min，12000r/min离心5分钟。吸取400μl上清液转移至新的离心管中，加入800μl预冷的无水乙醇，轻轻摇匀，12000r/min离心5min。倒掉无水乙醇，注意勿将白色dna沉淀倒出，加入800μl75％乙醇清洗2遍，倒掉75％的酒精，将析出物置于离心管底端，将试管置于室温下晾干，加入100μl内含rnasea的灭菌无离子水(ddh2o：rnasea＝50:1)，37℃水浴1h，使dna溶解并且除去rna，置于-20℃保存、备用。
4.indel分子标记的分析
a、2份重测序材料间indel标记多态性筛选
根据预测出的indel位点，以全基因组范围内均匀分布为原则，选取了1605个indel位点设计引物。利用2份重测序材料对1605个indel标记进行多态性分析，结果显示1556个标记(97％)具有清晰的扩增条带，其中1255个标记(78％)在2份材料间具有多态性。
b、5个辣椒栽培种间indel标记多态性筛选
为进一步验证indel标记在5个辣椒栽培种间的通用性，每个辣椒栽培种材料中随机选取2份材料，对288个indel标记进行多态性分析。结果显示194个(67.4％)indel标记至少在2个种间具有多态性，其中indel-2-3b-22在5个种间具有不同条带(图1)，说明该标记可一次性区分5个栽培种材料；该标记引物如下:
正向引物序列：acagaaattgcgcaaaaaca(seqidno.1)
反向引物序列：gcctggctcttgacttacca(seqidno.2)。
5.indel-2-3b-22标记准确性验证
为进一步验证标记indel-2-22是否可完全区分5个栽培种材料。随机选取从美国国家种质资源库引种的58份辣椒材料，包括10份c.annuum，11份c.frutescens，18份c.chinese，14份c.baccatum和5份c.pubescens。结果显示indel-2-3b-22可将上述5个栽培种的材料完全区分(图2和表1)。以上说明结果该标记可以一次性对5个栽培种材料进行区分，可用于辣椒5个栽培种的区分和种间杂交种的鉴定。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>一个区分五个辣椒栽培种的indel标记开发及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
acagaaattgcgcaaaaaca20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gcctggctcttgacttacca20