本发明属于乳酸菌培养
技术领域：
，尤其涉及一种屎肠球菌、其高密度发酵培养方法及由其制备的微生态制剂。
背景技术：
：屎肠球菌属于链球菌科、肠球菌属细菌，革兰氏阳性，兼性厌氧。其具有优良的生物学特性，是肠道共生菌，可在肠道中形成优势菌群，由于其生长速度快，具较好粘附力，产生乳酸以及一些抗菌物质，在许多动物新出生的2-3天内占有优势地位，从而增加有益菌的数量，抑制有害菌，促进肠道健康，调节肠道的微生态平衡且能防治腹泻，在提高生长性能方面有着显著的功效，效果与抗生素相当。屎肠球菌不仅具有良好的生物学特性，还能够提高动物体的免疫能力。由屎肠球菌组成的益生菌制剂可以提高饲料的转化率，改善畜产品品质，降低腹泻率以及死亡率。因此，屎肠球菌在畜禽养殖业中有着广泛的应用前景，其微生态制剂因具有环境友好，无残留等优点被越来越多地应用于畜牧业生产，对养殖生态环境的保护及养殖业的可持续发展具有重要的意义。然而，现有屎肠球菌的耐热性、耐胃酸、耐胆盐及发酵性能等不能适应日益发展的工业化需求，不能满足现代化的饲料工业以及畜牧养殖业的需求，因此，筛选出益生性及抗逆性显著的屎肠球菌菌株成为畜牧业发展的一大瓶颈问题。此外，抗生素的持续饲喂导致了细菌的耐药性、畜产品中的药物残留等日益加重。益生菌作为一种无毒、无残留、无抗药性的饲料添加剂，已成为有效的抗生素替代产品之一。因此，寻找安全、高效的新型饲料添加剂来部分替代抗生素成为养殖业亟待解决的问题。技术实现要素：本发明提出一种屎肠球菌、其高密度发酵培养方法及由其制备的微生态制剂，筛选出益生性及抗逆性均显著的屎肠球菌菌株作为饲料添加剂，可有效替代部分抗生素。为了达到上述目的，本发明提供了一株屎肠球菌，所述屎肠球菌enterococcusfaecium为e13-5，保藏编号为cctccm2017191。本发明还提供了一种如上述技术方案所述的屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的高密度发酵培养方法，包括以下步骤：一级生产种子培养：取屎肠球菌的基础种子无菌条件下接种于mrs培养基的斜面进行纯培养，试管于37℃-40℃静置培养24-48小时，镜检合格后，作为一级生产种子；二级生产种子培养：取一级生产种子斜面，向菌种斜面中加入无菌生理盐水将斜面上的菌落洗下，按照1％的接种量接种到二级种子培养液中，每瓶的装液量为300-400ml，37℃-40℃静置培养14-16小时，镜检无杂菌，且菌体处于分裂期，检验合格后，作为二级生产种子；三级生产种子培养：取二级种子培养液按照5-10％的接种量接种到三级种子培养液中，发酵温度为37℃-40℃，ph控制在7.0，搅拌转速为50r/min，培养6-8小时，发酵过程中罐压设定为0.05mpa，当糖的含量低于0.6％，且镜检无杂菌时，转种进行上罐发酵；上罐发酵：取三级种子培养液按照5-10％的接种量接种到发酵培养罐中，发酵温度为37℃-40℃，ph控制在6.5，搅拌转速为150r/min，发酵过程中溶氧量控制在10％以上，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa；当糖含量低于1.0％时采用流加方式进行补料，当糖含量不再降低、菌浊度不再增加，且镜检无杂菌时，发酵培养结束。作为优选，以质量份数计，所述二级种子培养液的配方包括1％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母浸粉和4％微量盐，ph7.0；所述三级种子培养液的配方包括2％葡萄糖、1.5％蛋白胨、1.5％酵母浸粉和4％微量盐，ph7.0。作为优选，以质量份数计，上罐发酵时使用的发酵培养液配方包括2％葡萄糖、2％蛋白胨、2％酵母浸粉和4％微量盐，ph7.0。作为优选，上罐发酵时的补料参数控制为：糖含量控制范围为0.5-1.0％，蠕动泵的转速为120-150rpm，补料周期为100s，开度为50-60s。本发明再提供了一种以如上技术方案所述的屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5为主要原料制备得到的微生态制剂。本发明又提供了一种如上述技术方案所述的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：取预定量的屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5在转速10000r/min条件下进行离心，得到菌泥，将菌泥与保护剂以质量比1:3的比例进行充分混合，然后进行冻干，并将冻干后的菌泥与辅料进行充分搅拌混合，得到微生态制剂。作为优选，以质量份数计，所述保护剂包括5％蔗糖、4％山梨醇、3％脱脂奶粉、1％明胶和0.5％vc，所述辅料包括49％淀粉、20％乳糖、15％糊精、10％聚维酮k30、5％微晶纤维素和1％的氯化盐。作为优选，将与保护剂充分混合的菌泥在以下条件依次进行冻干：在-40℃预冻3-4小时，在-40℃至-45℃以下抽真空至20pa左右，在5℃升华干燥20-24小时，在0℃升华干燥8-10小时，在25℃解析干燥4-6小时，最后关闭真空2-4小时。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：1、本发明提供的屎肠球菌具有显著的益生性及抗逆性，具有较好的耐热、耐胃酸、耐胆盐的生物学特性，能适应日益发展的工业化需求，满足现代化的饲料工业以及畜牧养殖业的需求；2、本发明优化了屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的高密度发酵的种子培养基和发酵培养基，通过发酵过程中控制发酵液的ph、搅拌转速、溶氧量以及通过控制糖的含量采用流加的方式进行分批补料的策略，实现了用于制备微生态制剂的屎肠球菌的低成本、高效率的生产；3、本发明对冻干保护剂以及冻干工艺的优化筛选，使得该屎肠球菌在冻干后菌株的存活率可高达70％以上，-20℃存放12个月活菌率仍在60％以上，解决了已知的乳杆菌在冻干过程中存活率大幅降低且保存过程中损失严重的问题，同时，该屎肠球菌的微生态制剂摒弃了以往制剂采用的葡萄糖，而选用了乳糖，既保证了菌株存活所需的能量，同时乳糖比葡萄糖更加稳定，不易吸水，使得制剂干燥不易吸潮；4、本发明提供的屎肠球菌的微生态制剂既可以作为固体进行添加还可以采用液体口服的方式，同时还保证了菌株的存活不受影响。具体实施方式下面将结合具体实施例对本发明所提供的屎肠球菌、其高密度发酵方法及由其制备的微生态制剂进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1本实施例提供了一种新的屎肠球菌，其分离筛选和鉴定如下：在尽量无菌条件下用无菌小勺采集健康动物直肠的肠道内容物1g，置于盛有30mlmrs培养基(配方蛋白胨10.0g/l、牛肉粉8.0g/l、酵母粉4.0g/l、葡萄糖20.0g/l、k2hpo42.0g/l、柠檬酸氢二胺2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、mgso40.2g/l、mnso40.04g/l、吐温-801.0g/l。)的100ml锥形瓶中，富集培养8h，然后吸取1ml与9ml灭菌生理盐水配制成1:10稀释液(即配制成10-1稀释液)，振荡3-5min，用微量移液器准确吸取该稀释液1ml至盛有9ml灭菌的生理盐水试管中，用涡旋振荡器振荡1-2min，配制成10-2的稀释液，依次进行10-3-10-6稀释，选择10-3-10-6三个稀释度，分别吸取200μl涂布于mrs培养基，于37℃倒置培养48h后，用接种环挑取单个菌落再次在mrs斜面培养基上重复传代纯培养3次后，挑取单个菌落至mrs培养基中培养，用终浓度为30％的甘油于-72℃下保存备用。同时取纯化3次后菌株的单菌落，转接到mrs固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养，观察其菌落的边缘、光滑度、表面光泽度、粘性、透明度、颜色、形状等特点。结果显示，菌株于ph6.2-6.4的mrs琼脂培养基上生长良好，边缘整齐，光滑，表面光泽，粘稠，不透明，形成灰白色的露滴状圆形菌落。挑取在mrs固体培养基上培养24h的新鲜培养物，进行革兰氏染色。结果显示，该菌株为革兰氏阳性球菌。对该革兰氏阳性球菌菌株进行生理生化鉴定，过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、明胶液化试验和硫化氢试验均为阴性，表明该菌株属于乳酸菌属。通过精氨酸水解试验、马尿酸盐水解试验、各类糖发酵试验以及4℃和65℃生长试验，并与《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌的分类鉴定》对照，鉴定结果该菌株为屎肠球菌。按照说明书的步骤要求，利用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组提取试剂盒(tianampbacteriadnakit)提取该株屎肠球菌的基因组dna。该株屎肠球菌菌株的基因组总dna为模板，利用细菌通用引物27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'，1492r：5'-taccttgttacgactt-3'pcr扩增该菌株的16srrna片段，pcr反应体系为10×buffer5.0μl，dntp(10mmol/l)1.0μl，primer1(20μmol/l)1.0μl，primer2(20μmol/l)1.0μl，模板dna2.5μl，taq酶(5.0u/μl)2.5μl，超纯水34μl，共50μl。pcr反应条件为：先95℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1min30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。反应结束后，对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了大小约1500bp的特异条带。用购自天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收并纯化该目的条带，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。将所测得的序列与genbank中的16srrna序列进行blastn相似性分析比较，结果该菌株与enterococcusfaeciumstrainpis01/021等16sribosomalrnagene序列的同源性均达到了99％，其序列详见序列表,该菌株为屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5，保藏编号为cctccm:2017191，保藏于位于中国、武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月13日。实施例2本实施例提供了一种如上述实施例所分离鉴定得到的屎肠球菌的高密度发酵培养方法，具体如下：一级生产种子的发酵培养方法：取屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的基础种子在无菌条件下接种mrs琼脂培养基的斜面进行纯培养，试管于37℃-40℃静置培养24-48小时。通过菌落观察、镜检等检验合格后，作为一级生产种子，于2-8℃保存，保存时间一般不超过1个月；二级生产种子的发酵培养方法：取屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的一级生产种子斜面，向菌种斜面中加入4ml无菌的生理盐水将斜面上的菌落洗下，按照1％的接种量接种到二级种子培养液中，每瓶的装液量为300-400ml，37℃-40℃静置培养14-16小时。镜检应无杂菌，且菌体处于分裂期，检验合格后，作为二级生产种子，于2-8℃保存，保存时间一般不超过3天；其中，以质量份数计，二级种子培养液的配方包括1％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母浸粉和4％微量盐，ph7.0；三级生产种子的发酵培养方法：取屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的二级种子培养液按照5-10％的接种量接种到三级种子培养液中，发酵温度为37℃-40℃，ph控制在7.0，搅拌转速为50r/min，培养6-8小时，发酵过程中罐压设定为0.05mpa；当糖的含量低于0.6％，且镜检应无杂菌时，可转种进行上罐发酵；其中，以质量份数计，三级种子培养液的配方包括2％葡萄糖、1.5％蛋白胨、1.5％酵母浸粉和4％微量盐，ph7.0。上罐发酵培养具体如下：取屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的种子培养液按照5-10％的接种量接种到发酵培养罐中，发酵温度为37℃-40℃，ph控制在6.5，搅拌转速为150r/min，发酵过程中溶氧量控制在10％以上，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa；当糖的含量低于1.0％时采用流加方式进行补料，当糖含量不再降低、菌浊度不再增加，且镜检无杂菌时，发酵培养结束；其中，上罐发酵时的补料参数控制为：糖含量控制范围为0.5-1.0％，蠕动泵的转速为120-150rpm，补料周期为100s，开度为50-60s；以质量份数计，上罐发酵时使用的发酵培养液配方包括2％葡萄糖、2％蛋白胨、2％酵母浸粉和4％微量盐，ph7.0。本实施例中优化了屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的高密度发酵的种子培养基和发酵培养基，通过发酵过程中控制发酵液的ph、搅拌转速、溶氧量以及通过控制糖的含量采用流加的方式进行分批补料的策略，实现了屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的高密度发酵，50l发酵罐在所优化的发酵条件下活菌数达到2.3×1010cfu/ml，1吨发酵罐优化条件下活菌数可高达2.7×1010cfu/ml，分别是相同发酵规模条件下传统mrs培养基所发酵活菌数的31倍和34倍，活菌数在已报道的屎肠球菌高密度发酵中是较高的，培养基的成本也比mrs培养基降低了将近20％，实现了用于制备微生态制剂的屎肠球菌的低成本、高效率的生产。实施例3本实施例提供了一种以如上实施例所分离鉴定的屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5为主要原料制备得到的微生态制剂的制备工艺，具体如下：取预定量的屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5在转速10000r/min条件下进行离心，得到菌泥，排渣周期为50-60min，随后将菌泥与保护剂(以质量份数计，所述保护剂包括5％蔗糖、4％山梨醇、3％脱脂奶粉、1％明胶和0.5％vc，)以质量比1:3的比例进行充分混合，然后在以下条件依次进行冻干：在-40℃预冻3-4小时，在-40℃至-45℃以下抽真空至20pa左右，在5℃升华干燥20-25小时，在0℃升华干燥8-10小时，在25℃解析干燥4-6小时，最后关闭真空2-4小时，并将冻干后的菌泥与辅料(以质量份数计，所述辅料包括49％淀粉、20％乳糖、15％糊精、10％聚维酮k30、5％微晶纤维素和1％的氯化盐)进行充分搅拌混合，得到微生态制剂。本实施例中通过对冻干保护剂以及冻干工艺的优化筛选，使得该屎肠球菌在冻干后菌株的存活率可高达70％以上，-20℃存放12个月活菌率仍在60％以上，解决了已知的乳杆菌在冻干过程中存活率大幅降低且保存过程中损失严重的问题。同时，该屎肠球菌的微生态制剂摒弃了以往制剂采用的葡萄糖，而选用了乳糖，既保证了菌株存活所需的能量，同时乳糖比葡萄糖更加稳定，不易吸水，使得制剂干燥不易吸潮，有效地避免了杂菌的生长和繁殖，乳糖还可调整结晶行为，形成微细晶体，使得制剂更加稳定，菌株包裹在微细晶体内其存活时间也就更长久。屎肠球菌等乳酸菌会将乳糖转变成乳酸、醋酸，使肠道ph值下降，这些有机酸会刺激肠道蠕动，具有整肠作用，进一步提高微生态制剂的作用效果；聚维酮k30在人用医药上有着较为广泛的应用，为国际倡导的三大药用新辅料之一，可用作粘合剂，助溶剂，分散剂，酶及热敏药物的稳定剂，还可用作低温保存剂，聚维酮k30的使用，使得该屎肠球菌的微生态制剂既可以作为固体进行添加还可以采用液体口服的方式，同时还保证了菌株的存活不受影响。实施例4本实施例提供了一种如上述实施例分离鉴定得到的屎肠球菌enterococcusfaeciume13-5的益生性及抗逆性性能检测，其中，对其耐热、耐胃酸、耐胆盐生物学特性检测结果如表1所示：表1屎肠球菌耐热、耐胃酸、耐胆盐检测结果活菌数存活率(按100％计)生理盐水6.9×109cfu--60℃作用10min6.7×109cfu97.10％60℃作用30min4.7×109cfu68.12％人工胃液(ph2.0)作用2.5h2.4×109cfu34.78％人工肠液(0.3％)作用2.5h3.3×109cfu47.83％由表1的检测结果可见，该株屎肠球菌与现有的其它屎肠球菌(nfer-5在60℃热处理10min的存活率仅为1.68×109cfu/9.40×109cfu＝1.24％，张宏刚和李莉所分离的屎肠球菌在ph2.0条件下作用2h的存活率在1.2％～79.1％之间，常规菌株的耐受胆盐浓度范围为0.03％～0.3％(质量百分比浓度))相比，能够同时具有较好的耐热、耐胃酸、耐胆盐的生物学特性，基于其多方面优势，可适应日益发展的工业化需求，满足现代化的饲料工业以及畜牧养殖业的需求。序列表<110>青岛蔚蓝生物股份有限公司青岛动保国家工程技术研究中心有限公司<120>一种屎肠球菌、其高密度发酵方法及由其制备的微生态制剂<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>1458<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aaggggggcgtgctatacatgcaagtcgtacgcttctttttccaccggagcttgctccac60cggaaaaagaagagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccatcagaaggg120gataacacttggaaacaggtgctaataccgtataacaatcgaaaccgcatggttttgatt180tgaaaggcgctttcgggtgtcgctgatggatggacccgcggtgcattagctagttggtga240ggtaacggctcaccaaggccacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacattg300ggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatgga360cgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctg420ttgttagagaagaacaaggatgagagtaactgttcatcccttgacggtatctaaccagaa480agccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccgg540atttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggc600tcaaccggggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggagagtggaatt660ccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccagtggcgaaggcggctct720ctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccct780ggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgct840gcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaagg900aattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaaga960accttaccaggtcttgacatcctttgaccactctagagatagagcttccccttcgggggc1020aaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc1080cgcaacgagcgcaacccttattgttagttgccatcatttagttgggcactctagcaagac1140tgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacc1200tgggctacacacgtgctacaatgggaagtacaacgagttgcgaagtcgcgaggctaagct1260aatctcttaaagcttctctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagccgg1320aatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacaca1380ccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttttggag1440ccagccgcctaatggaat1458当前第1页12