本发明涉及一种动物病原菌分子分型技术，具体涉及一种基于全基因组测序用多位点序列分型(mlst)技术对副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis)进行分型的方法。
背景技术：
：副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuisstrains,hps)是巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性菌，主要危害仔猪和青年猪。该病菌是猪上呼吸道的一种常在细菌，在特定条件下可以侵入机体引起严重的全身性疾病，其主要特征是以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主，该病原引起的疾病又被称为“革拉氏病”。目前，副猪嗜血杆菌病在我国乃至全世界广泛流性，给养猪业带来严重的经济损失，是世界性病害之一，已引起人们广泛的关注。此外，副猪嗜血杆菌极易产生耐药性，且血清型众多，每个血清型之间缺乏免疫交叉性，因此至今仍没有一个很好的控制副猪嗜血杆菌病流行的方法。全基因组测序，即对一种生物的基因组中的全部基因进行测序，测定其dna的碱基序列。全基因组测序覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息；准确性高，其准确率可高达99.99％。随着基因组测序技术的进步，基于全基因组序列的分型分析技术更为全面的提供了病原细菌的海量信息，对于病原细菌的鉴定非常有效。准确而高分辨率的分型信息为流行病学变化以及扩散范围的检测与预警奠定了基础，同时也为临床诊断提供了依据。然而，分辨率不高严重影响了基于看家基因一代测序结果对临床菌株的诊断。而全基因组测序就目前来说费用还较高，计算和分析方法还需要进一步完善，用于日常监测的可行性还较低。多位点序列分型(mlst)技术是直接利用5—10个看家基因的核普酸序列片段之间的碱基差异进行分子分型的方法。看家基因是有保守代谢功能的基因，进化相对缓慢，通过序列中碱基的变化可反映菌株之间的遗传关系和进化关系。在mlst结果分析中，每个单一的核普酸差异即可视为一个新的等位基因(allele)，把每个来自于同一看家基因的不同等位基因用阿拉伯数字编号，由此使得每个菌株中看家基因的等位基因都有相应的编号，最终可得到该菌株的由一串数字组成的等位基因号码，即该菌株的序列型(sequencetype,st)。通过mlst分型不仅可以判断菌株之间的亲缘关系，而且还可以推断它们是否有共同祖先,因此mlst技术被广泛地用于细菌病原菌的分类中。此外，多位点序列分型技术也可用于病原菌株遗传多样性和分子进化研究，构建系统发育树。由于该方法分辨率高，并克服了其他方法存在的不同实验室或实验室内部的结果可比性及重复性较差的缺陷，所以相关数据结果可通过网络实现数据共享和对比。技术实现要素：为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于建立一种基于全基因组测序的副猪嗜血杆菌的多位点序列分型技术体系，提供一种用于副猪嗜血杆菌分子分型的全基因组测序方法。用于副猪嗜血杆菌分类鉴定和遗传多样性研究，所要解决的关键问题是副猪嗜血杆菌基因组dna的提取、看家基因序列的确定、看家基因比对与分析、等位基因号与分型号的申请。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于全基因组测序的副猪嗜血杆菌分子分型方法，该方法成功提取细菌基因组dna，用dnaman软件对测序结果进行多序列比对，再于副猪嗜血杆菌mlst数据库中在线比对，确定7个看家基因序列，获得各个菌株序列型(st)。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于副猪嗜血杆菌分子分型的全基因组测序方法，包括样品预处理、提取基因组dna、质量检测与测序、获取看家基因序列、数据分析，获取看家基因序列时不需要设计看家基因引物，直接用dnaman软件对全基因组序列进行比对，得到看家基因序列。进一步的，所述提取的副猪嗜血杆菌基因组dna进行测序，所得的dna采用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行检测，将dna进行纯化和测序，采用dnaman软件对数据库中副猪嗜血杆菌的7个看家基因的各任取的一个碱基序列与全基因组序列进行序列比对，将对应片段前后各多取50bp，再将这个片段于副猪嗜血杆菌mlst数据库中进行比对，按提示截取，即可确定7个看家基因序列，再根据每个看家基因中碱基的差异，将每个看家基因不同的等位基因赋予数字代码，使每个菌株获得了一个由7个看家基因的等位基因号码组成的数字组合的序列型(st)。进一步的，所述一种用于副猪嗜血杆菌分子分型的全基因组测序方法，具体步骤如下：(1)细菌基因组dna的提取：按照dna提取试剂盒(离心柱型)说明书步骤，提取细菌基因组dna；(2)检测与测序：提取的细菌基因组dna采用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行检测，缓冲液为lxtaebuffer、电压为90v的条件下电泳25～30min，染色20～30min，拍照，对基因组dna进行纯化和全基因组测序；(3)获得数据库中看家基因序列：从副猪嗜血杆菌mlst数据库中下载所有看家基因(rpob、atpd、g3pd、infb、mdh、_6pgd、frdb)的序列进行本发明试验，看家基因名称、功能和序列长度信息见表1所示；(4)看家基因确定：采用dnaman软件对数据库中副猪嗜血杆菌的7个看家基因的各任取的一个碱基序列与全基因组序列进行序列比对，将对应片段前后各多取50bp，再将这个片段于副猪嗜血杆菌mlst数据库中进行比对，按提示截取，即可获得看家基因；(5)数据分析：每个基因位点上的特定序列定义为一个等位基因，不同等位基因之间可能有一个或多个碱基差异；根据每个看家基因中碱基的差异，将每个看家基因不同的等位基因赋予数字代码，这样每个菌株在这个看家基因位点上就获得了相应的等位基因号，这样每个菌株都获得了一个由7个看家基因的等位基因号码组成的数字组合，即菌株的序列型。表1基因功能序列长度(bp)atpdatp合成酶519infb翻译起始因子399mdh苹果酸脱氢酶444rpobdna定向rna聚合酶亚单元3306pgd苹果酸脱氢酶465g3pd甘油醛-3-磷酸脱氢酶441frdb延胡索酸盐还原酶453进一步的，菌株的序列型通过在线采用副猪嗜血杆菌mlst数据库进行序列型分析，按照不同菌株的序列型可将2种菌株有效区分。与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：本发明经过反复试验，筛选确定了7个看家基因组合，用dnaman软件对测序结果进行多序列比对与分析，在副猪嗜血杆菌mlst分型网站上申请获得菌株序列型(st)。充分利用公共数据库数据，对菌株进行分型，结果反馈快速高效。本发明方法可用于副猪嗜血杆菌分类鉴定和遗传多样性研究，目的是解决该病菌因分类和变异情况较复杂给实际工作中带来一些问题，研究探讨副猪嗜血杆菌群体遗传结构及亲缘关系，为从遗传进化的角度去认识副猪嗜血杆菌，从分子水平对它们进行分类与鉴定，进一步开展该病菌致病力分析与致病机理研究，发展分子检测技术，改进育种策略等提供科学依据。附图说明图1为副猪嗜血杆菌基因组dna提取质量检测图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例：1、细菌基因组dna的提取按照dna提取试剂盒(离心柱型)说明书步骤，提取细菌基因组dna。2、检测与测序提取的细菌基因组dna采用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行检测,缓冲液为lxtaebuffer、电压为90v的条件下电泳30min，染色30min，拍照见图1，由图1可知，1～4均代表hps1菌株的dna条带，表明细菌基因组dna提取完全。后再对基因组dna进行纯化和全基因组测序。3、获得数据库中看家基因序列从副猪嗜血杆菌mlst数据库中下载所有看家基因(rpob、atpd、g3pd、infb、mdh、_6pgd、frdb)的序列进行本发明试验，看家基因信息见表1，如表1所示为7个看家基因的名称、功能和序列长度。4、看家基因确定采用dnaman软件对数据库中副猪嗜血杆菌的7个看家基因的各任取的一个碱基序列与全基因组序列进行序列比对，将对应片段前后各多取50bp，再将这个片段于副猪嗜血杆菌mlst数据库中进行比对，按提示截取，即可获得看家基因序列。5、数据分析每个基因位点上的特定序列定义为一个等位基因，不同等位基因之间可能有一个或多个碱基差异；根据每个看家基因中碱基的差异，将每个看家基因不同的等位基因赋予数字代码，这样每个菌株在这个看家基因位点上就获得了相应的等位基因号见表2，由表2一表2等位基因名等位基因型序列相似度序列长度(bp)atpd29100％519infb39100％399mdh33100％444rpob1100％3306pgd61100％465g3pd3100％441frdb51100％453株副猪嗜血杆菌mlst分型结果可知该副猪嗜血杆菌7个看家基因的等位基因号，这样每个菌株都获得了一个由7个看家基因的等位基因号码组成的数字组合，即菌株的序列型。当前第1页12