本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽oa-gl21及其提纯方法与应用。
背景技术：
皮肤作为人体和外界环境之间的物理屏障，承担着诸如排汗、热感、痛觉等重要的生理功能，但与此同时，皮肤也最易受到各种物理、化学等因素的影响而造成破裂和感染等损伤。皮肤受损后的快速愈合是机体内环境稳态重建的重要先决条件，但这个过程容易受到各种因素影响，导致创伤修复的延缓，造成难愈合性慢性创伤，为病原微生物的入侵和繁殖创造条件，从而引起继发性败血症，水电解质紊乱，感染性休克，多器官衰竭甚至死亡等危害，给患者造成严重的生理和经济负担。因此，寻找效果较好的新型促创面愈合药物已经成为亟待解决的问题。跟传统的创伤修复药物（如云南白药、生长因子制剂等）相比，多肽类分子具有高活性、高特异性及高稳定性等特性，目前已有各种两栖动物来源的活性多肽如抗菌肽、抗氧化肽、镇痛肽等得以发现，但关于高活性的促创伤修复肽的报道还略显不足。
两栖动物生活环境复杂，在长期的自然选择过程中，两栖动物逐渐进化出了独特、高效的皮肤多肽防御系统，比如抵御病原微生物侵袭的抗菌肽、防止强氧化损伤的抗氧化多肽等。广泛的研究表明，两栖动物皮肤损伤后能够快速的修复，由此，我们猜测其皮肤中存在必要的物质基础来促进创伤修复：两栖动物皮肤分泌物具有很强的促创伤修复活性，但具体的作用分子还知之甚少。到目前为止，仅有少数关于两栖动物皮肤分泌物中促创伤修复活性多肽的报道，因此，对于两栖动物促创伤修复肽的研究仍有局限性并且需要更深入的研究。
我们在研究中发现臭蛙可以分泌多种生物活性肽。因此，本发明提供了一种来源于云南臭蛙(odorranaandersonii)皮肤分泌物的具有促皮肤创伤修复的活性多肽oa-gl21及其提纯方法和应用。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种多肽oa-gl21，所述多肽oa-gl21包含的氨基酸序列如seqno.1所示。
本发明的第二目的在于提供一种所述多肽oa-gl21的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用电刺激法取云南臭蛙活体皮肤分泌物，溶解于pbs，真空冷冻干燥，获得皮肤分泌物冻干粉-80℃保存备用；
（2）将所述冻干粉用sephadexg75排阻层析进行分离；
（3）将步骤（2）的分离产物进行第一次高效液相色谱反相层析，并收集具促创伤修复功能的活性组分；
（4）将所述活性组分进行第二次高效液相色谱反相层析，得到纯化的修复肽oa-gl21。
本发明的第三目的在于提供所述多肽oa-gl21的应用，所述多肽oa-gl21可促进体表皮肤创伤愈合，减少疤痕产生。
本发明的第四目的在于提供一种含有所述多肽oa-gl21的促皮肤创伤愈合的药品。
本发明的第五目的在于提供一种含有所述多肽oa-gl21的护肤品。
附图说明
图1为的第一次hplc反相c18柱层析图；
图2为多肽oa-gl21的第二次hplc反相c18柱层析图；
图3为多肽oa-gl21的动物模型促创伤修复活性图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述种皮肤创伤修复肽oa-gl21，来源于云南臭蛙（odorranaandersonii），所述修复肽oa-gl21包含的氨基酸序列如seqno.1所示。
由于所述皮肤创伤修复肽oa-gl21来源于云南臭蛙，本发明提供一种从云南臭蛙活体提纯所述多肽oa-gl21的提纯方法，包括以下步骤：
（1）用电刺激法取云南臭蛙活体皮肤分泌物，溶解于pbs，真空冷冻干燥，获得皮肤分泌物冻干粉-80℃保存备用；
（2）将所述冻干粉过sephadexg75分子筛：将皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，配置成100mg/ml的溶液，取1ml该溶液上预先用20mmol/ltris-hcl缓冲液（ph=7.8，含0.1mol/lnacl）平衡24h的sephadexg75(gehealthcare，超细)柱子（长度40cm，内径宽度1.5cm），用同样的缓冲液进行洗脱，流速为1.5ml/10min，每10min收集1次，测定其在280nm下的吸光度；
（3）将过分子筛的产物进行第一次高效液相色谱反相层析，并收集具促创伤修复活性区段产物：将过筛产物上样于预先用超纯水（含0.1%的三氟乙酸）平衡好的hypersilods25mm柱子（伊利特产品，尺寸为4.6mm×300mm），实验仪器为waters1525高压液相系统，在流速为1ml/min的条件下，用乙腈（含0.1%的三氟乙酸）在线性梯度（0-100%in100min）条件下进行洗脱，监测波长为215nm。
（4）将所述具促创伤修复活性区段产物进行第二次高效液相色谱反相层析，得到纯化的修复肽oa-gl21：将第一次收集的具有促创伤修复活性峰，真空冷冻干燥后溶于去离子水，然后重复第一次hplc过程，得到提纯产物。
除了从云南臭蛙活体上直接提取外，本发明所述的修复肽oa-gl21还可通过人工合成的方法得到。目前生物活性肽的制备方法有很多种，包括保护化学合成法、水解法、重组dna技术等，这些方法均适用于制备本发明所述的修复肽oa-gl21。
由于本发明所述多肽oa-gl21具有来源天然、活性高、促修复能力强等特点，可用于加速体表皮肤的创口愈合，减少疤痕产生。生产含有所述皮肤创伤修复肽oa-gl21的外用药品、外用护肤品等产品，具有广阔的应用前景。
下面将结合具体实施例，对本发明进行进一步的说明。
实施例1：修复肽oa-gl21的提纯和分子鉴定
1、提纯
云南臭蛙活体采自云南保山，用电刺激法取其皮肤分泌物（溶解于pbs），真空冷冻干燥，-80°保存备用。
将获得将皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，配置成100mg/ml的溶液，取1ml（蛋白含量为100mg）上预先用20mmol/ltris-hcl缓冲液（ph=7.8，含0.1mol/lnacl）平衡24h的sephadexg75(gehealthcare，超细)柱子（长度40cm，内径宽度1.5cm），用同样的缓冲液进行洗脱，流速为1.5ml/10min，每10min收集1次，测定其在280nm下的吸光度。
将第一步所得样品上样于预先用超纯水（含0.1%的三氟乙酸）平衡好的hypersilods25mm柱子（伊利特产品，尺寸为4.6mm×300mm），实验仪器为waters1525高压液相系统，在流速为1ml/min的条件下，用乙腈（含0.1%的三氟乙酸）在线性梯度（0-100%in100min）条件下进行洗脱，监测波长为215nm，所得的分离纯化图谱如图1所示，箭头所指为具有促创伤修复活性峰（oa-gl21存在所示峰）。
收集第一次具有促创伤修复活性峰，真空冷冻干燥后溶于去离子水，然后重复第一次hplc过程，所得的分离纯化图谱如图2所示，箭头所指为纯化的oa-gl21所在峰。
2、分子鉴定
纯化得到的修复肽oa-gl21在全自动蛋白质序列测定仪（岛津ppsq-31a）上经edman降解法测定氨基酸全序列，结果如seqno.1所示。
实施例2：在动物模型中测定多肽oa-gl21的修复活性
选体重22-25g的spf级昆明种小白鼠进行实验，将小鼠随机分成两组，每组10只。首先给小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠（0.1ml/20g）麻醉小鼠，然后将小鼠背部毛剃除干净，并用75%的酒精消毒，最后在小鼠背部两侧用凿孔器凿出两个大小对称的孔,约8mm×8mm大小。术后将小鼠放在加热器旁待其醒后放回饲养室正常饲养。每天2次上样，每孔每次上样约20μl，第1组小鼠背部一侧涂生理盐水(saline)，另一侧涂oa-gl21（100μg/ml）；第2组小鼠背部一侧侧涂生理盐水(saline)，另一侧涂康复新（kfx，10mg/ml，内蒙古京新药业有限公司，z15020805）。每2天给小鼠背部创伤拍照，最后通过imagej软件计算创伤修复率。新型促皮肤创伤修复肽oa-gl21的促创伤修复活性如图3所示。
动物模型试验（图3）结果均表明：本发明所述的皮肤创伤修复肽oa-gl21具有较强的促创伤修复活性。
序列表
<110>昆明医科大学
<120>一种多肽oa-gl21及其提纯方法与应用
<130>2018
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>21
<212>prt
<213>云南臭蛙（odorranaandersonii）
<400>1
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20