一种生产低温甾醇酯酶的菌株及其发酵方法与流程

本发明涉及微生物学、生物化学及发酵工程等领域，具体涉及对一株莓实假单胞菌进行低温驯化，并利用新的低温菌株发酵获得甾醇酯酶的方法。

背景技术

甾醇酯酶（sterolesterase，ec3.1.1.13）是一种酯类水解酶，它能催化甾醇酯水解生成甾醇和脂肪酸，在适宜条件下也可通过酯化或酯交换反应催化甾醇酯合成。甾醇酯酶可帮助机体消化吸收油脂类营养物质，因其与人体脂质代谢及胆固醇吸收有关，甾醇酯酶是检测血液中总胆固醇含量的重要酶制剂之一。在造纸工业中，可利用甾醇酯酶与脂肪酶结合使用的方法，有效水解木材甾醇酯，改善纸张生产过程中的“树脂障碍”问题。目前，对微生物发酵生产甾醇酯酶的研究主要集中在甾醇酯酶高产菌株的分离鉴定、诱变育种、甾醇酯酶的分离纯化以及在工程菌中克隆表达阶段，其中均为中高温甾醇酯酶。而低温甾醇酯酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，因此，在工业化生产中具有节约能源的优势；经过温和的热处理即可使低温酶丧失活力，而低温或适温处理不会影响产品的品质。低温甾醇酯酶的应用将对传统的食品、医药等领域产生深远的影响。目前国内外还未见海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶的研究报道，如若海洋微生物发酵甾醇酯酶实现工业化生产则可创造良好的经济效益和社会效益。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种低温莓实假单胞菌即一种生产低温甾醇酯酶的菌株，并提供了其发酵生产甾醇酯酶的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种生产低温甾醇酯酶的菌株，命名为q-06，该菌株来自对原始菌株pseudomonasfragi（cgmccno.1.3349）低温驯化，申请人已针对菌株q-06发展了一套培养技术，能从该菌稳定发酵生产低温甾醇酯酶。

所述生产低温甾醇酯酶的菌株生物化学特征为：

菌落形态特征为：

在甾醇酯培养基上生长良好，菌株q-06的单菌落近似圆形，边缘整齐，表面隆起，呈淡黄色，不透明，用接种环易于挑取，中心有光泽；

菌体形态特征为：

菌株呈杆状，多为单个排列，革兰氏染色结果呈阴性；

主要生理生化特征：

氧化酶试验、接触酶试验呈阳性，能够氧化分解葡萄糖，能够生成吲哚乙酸，不能生成硫化氢，不能水解淀粉，硝酸盐还原试验、伏普（vp）试验、甲基红（mr）试验、明胶水解试验均呈阴性，精氨酸双水解酶试验呈阳性反应；

遗传学特征：

所述的甾醇酯酶生产菌株q-06进行序列鉴定，pcr扩增产物序列长度为1489bp。

本发明所述的一种海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶的方法具体包括以下步骤:

1）对菌株pseudomonasfragi进行低温驯化得到菌株q-06，驯化温度由高到低为：30℃→28℃→26℃→24℃→22℃→20℃→18℃，使其在低温环境中生长良好；

2）将1）低温驯化得到的菌株接种于固体种子培养基上，在18～24℃培养48-96小时；

3）按常规方法将低温驯化后的菌株用于生产甾醇酯酶。在18~24℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；

4）将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的5～10%接种量接入液体发酵培养基中，在18~24℃培养48～120h时，即海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶结束；

5）将4）的发酵液在8,000～12,000rpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液；

6）根据不同需要和使用对象不同，将5）得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

具体的，步骤1）中驯化所用的低温驯化培养基为：植物甾醇酯10.0~30.0g，酵母粉5.0~10.0g，kh2po42.0~5.0g，mgso4·7h2o0.5~1.5g，(nh4)2so41.0~3.0g，葡萄糖5.0~15.0g，琼脂粉18.0~20.0g，自来水1.0l，ph值6.0~8.0，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；

步骤2）所用固体种子培养基为：酵母膏5.0~10.0g，蛋白胨3.0g~5.0g，nacl5.0~7.0g，k2hpo41.0~3.0g，feso4·7h2o0.05~0.1g，mgso4·7h2o0.1~0.3g，琼脂粉18.0~20.0g，自来水1.0l，ph值6.0~8.0，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；

步骤3）培养所用液体种子培养基为：酵母膏5.0~10.0g，蛋白胨3.0g~5.0g，nacl5.0~7.0g，k2hpo41.0~3.0g，feso4·7h2o0.05~0.1g，mgso4·7h2o0.1~0.3g，自来水1.0l，ph值6.0~8.0，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。

步骤4）所用发酵产酶培养基为：植物甾醇酯5.0~15.0g，酵母粉3.0~5.0g，kh2po41.0~2.0g，mgso4·7h2o0.3~0.5g，(nh4)2so40.5~1.0g，葡萄糖5.0~10.0g，自来水1.0l，ph6.0~8.0，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。

按本发明产酶条件发酵生产低温甾醇酯酶，低温驯化后的菌株q-06在4℃环境中可保存2个月，用10~25vt%甘油制成的菌悬液在-80℃条件下可以长期保藏。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的生产低温甾醇酯酶的菌株q-06生产低温甾醇酯酶最适温度为18-24℃，无需加热/冷却等耗能即可制得低温甾醇酯酶，降低生产成本，满足工业生产需求；

本发明的生产低温甾醇酯酶的菌株q-06具有生产甾醇酯酶的能力，该菌能高效地产生稳定的低温甾醇酯酶；

本发明生产低温甾醇酯酶的菌株发酵生产的低温甾醇酯酶用于在制备功能性降胆固醇食品、聚氨酯的生物降解、临床胆固醇测定试剂盒的制备等方面的研究，其在食品、医药、化工等领域都有着很广泛的应用价值。

附图说明：

图1甾醇酯酶生产菌q-06的菌落形态；

图2甾醇酯酶生产菌q-06的菌体形态；

图3甾醇酯酶生产菌q-06的16srdnapcr扩增产物电泳图；

图4甾醇酯酶生产菌的q-06的16srdna序列系统发育树；

图5甾醇酯酶粗酶液最适作用温度；

图6甾醇酯酶粗酶液最适作用ph曲线。

具体实施方式：

实施例1

低温甾醇酯酶生产菌q-06的获得：

1）原始菌株pseudomonasfragi（cgmccno.1.3349）的活化：活化培养基为：胰蛋白胨8.0~10.0g，酵母粉4.0g~9.0g，nacl8.0~10.0g，琼脂18.0~20.0g，自来水1.0l，ph值为6.0~8.0，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。

2）低温驯化：对1）的菌株进行低温驯化得到低温甾醇酯酶生产菌q-06，驯化温度由高到低为：30℃→28℃→26℃→24℃→22℃→20℃→18℃，使其在低温环境中生长良好；所用低温驯化培养基为：植物甾醇酯10.0~30.0g，酵母粉5.0~10.0g，kh2po42.0~5.0g，mgso4·7h2o0.5~1.5g，(nh4)2so41.0~3.0g，葡萄糖5.0~15.0，琼脂粉18~20.0g，自来水1.0l，ph值为7.0，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。

所用菌株pseudomonasfragi购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmccno.1.3349。

实施例2

低温甾醇酯酶生产菌q-06的分离鉴定：

菌落形态特征为：

在甾醇酯培养基上生长良好，菌株q-06的单菌落近似圆形，边缘整齐，表面隆起，呈淡黄色，不透明，用接种环易于挑取，中心有光泽（见图1）；

菌体形态特征为：

菌株呈杆状，多为单个排列，革兰氏染色结果呈阴性（见图2）；

主要生理生化特征：

氧化酶试验、接触酶试验呈阳性，能够氧化分解葡萄糖，能够生成吲哚乙酸，不能生成硫化氢，不能水解淀粉，硝酸盐还原试验、伏普（vp）试验、甲基红（mr）试验、明胶水解试验均呈阴性，精氨酸双水解酶试验呈阳性反应（见表1）；

表1菌株q-06的生理生化特征

遗传学特征：

所述的甾醇酯酶生产菌株q-06进行序列鉴定，pcr扩增产物序列长度为1489bp（见图3）。

本发明菌株与假单胞菌属有相似性，用mega5.0软件对其16srdna序列进行系统学分析，并用邻接法（neighbor-joining）构建系统树表明本菌株与莓实假单胞菌属于同一类群，关系最紧密。16srdna序列分析表明，与genbank国际基因序列数据库记录的相似的菌株pseudomonasfragi(nr112077.1)的同源性最高（见图4）。

实施例3

低温甾醇酯酶生产菌q-06菌株的发酵工艺：

1）培养基制备

①菌种活化培养基：胰蛋白胨8.0g，酵母粉5.0g，nacl8.0g，琼脂粉20.0g，自来水1.0l，ph值为6.5，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；

②液体种子培养基：酵母膏8.0g，蛋白胨3.5g，nacl7.0g，k2hpo42.0g，feso4·7h2o0.1g，mgso4·7h2o0.2g，自来水1.0l，ph值为8.0，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；

③发酵产酶培养基：植物甾醇酯5.0g，酵母粉3.0g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.3g，(nh4)2so40.5g，葡萄糖5.0g，自来水1.0l，ph值为6.0，于0.1mpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。

2）将产生低温甾醇酯酶的菌株q-06按中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc）提供的菌株说明进行初始活化；

3）将菌株q-06接种于固体种子培养基上，在18～24℃培养48-96小时；

4）按常规方法将低温驯化后的甾醇酯酶产生菌在18~20℃培养48~72h，然后按5vt%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；

5）将4）中制备的二级种子按发酵液体积按5~7%的接种量接入发酵产酶培养基中，在18~20℃培养48~72h时，即海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶结束；

6）将5）的发酵液在8,000~12,000rpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液；

7）根据不同需要和使用对象不同，将6）得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温甾醇酯酶制剂。

实施例3

低温甾醇酯酶粗酶液最适作用温度

将菌株q-06发酵生产的甾醇酯酶粗酶液分别置于不同温度条件下（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）测定其酶活，相对酶活计算以同组最高酶活为100%，绘制温度-相对酶活折线图，结果显示该酶最适作用温度为30℃。（见图5）

实施例4

低温甾醇酯酶粗酶液最适作用ph

将菌株q-06发酵生产的甾醇酯酶粗酶液分别置于不同ph值（4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）的磷酸盐缓冲液反应体系中，测定其酶活，相对酶活计算以同组最高酶活为100%，绘制ph值-相对酶活折线图，结果显示该酶最适作用ph为7.0。（见图6）

实施例5

不同化学物质对甾醇酯酶酶活性的影响

以原始的甾醇酯酶发酵液为对照，在发酵液中加入不同化学物质，使znso4·7h2o、agno3、mgso4·7h2o、cuso4·5h2o、cocl2·6h2o、mncl2·4h2o、fecl3、cacl2和kcl终浓度均为1mmol/l，鳌合剂乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，edta）及十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，sds）终浓度为0.1%，测定甾醇酯酶活性，结果如表2所示。

表2不同化学物质对甾醇酯酶酶活性的影响

序列表

<110>大连大学

<120>一种生产低温甾醇酯酶的菌株及其发酵方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1489

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