本发明涉及一种唾液乳杆菌特异性培养基及其应用，属于微生物检测领域。
背景技术：
：唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)属于厚壁菌门乳杆菌属，菌落光滑圆润，呈乳白色，边缘整齐，最初是从口腔中分离得到，由于其广泛存在于人体肠道、口腔、阴道等部位的分泌液中，故被认为是人体的原籍菌。中华人民共和国卫生部于2010年将唾液乳杆菌列入允许用于食品的菌株，美国食品药品监督管理局(fda)也将其列入安全菌种之一。大量研究表明，唾液乳杆菌具有良好的细胞粘附能力及耐酸耐胆盐能力，同时具备调节肠道菌群、拮抗致病菌、刺激免疫反应、治疗和预防肠道炎症等多种生理功能。因此，唾液乳杆菌可作为潜在的益生菌株广泛添加于食品、药品等领域，具有巨大的应用潜力。宿主肠道是唾液乳杆菌的主要生境，若通过特异性培养基进行选择性富集，增加唾液乳杆菌在粪便样本中的丰度，即可大大提高该菌种的选育效率。因此，设计开发针对唾液乳杆菌的特异性培养基具有重要意义。目前国内外还没有任何涉及到唾液乳杆菌特异性培养分离的相关文献报道，对唾液乳杆菌的分离还局限于针对肠道乳杆菌的普适性筛选方法(如glu-van-mrs乳杆菌分离培养基)。运用该类方法筛选得到唾液乳杆菌的效率低，同时大量消耗人力物力。目前在对混菌样本中单菌的筛选，相应的特异性分离培养基逐渐出现，譬如申请号为201610827496.9、名称为“发酵乳杆菌特异性培养基及其应用”的专利申请，以及申请号为201510947745.3、名称为“植物乳杆菌特异性培养基及其应用”的专利申请，这两个发明分别公开了对发酵乳杆菌及植物乳杆菌的定性检测方法，主要通过对普通培养基的改造，实现对目标菌株的特异性培养筛选，具有简便、针对性好、效率高等特点。但针对唾液乳杆菌，并没有出现类似的特异性培养基，大大阻碍了该类益生菌的选育和开发。因此，本发明研究以肠道唾液乳杆菌为目标菌株，通过对普适性培养基的改良，达到对唾液乳杆菌的特异性分离培养，进而提高唾液乳杆菌的得率。技术实现要素：本发明要解决的第一技术问题，是提供一种唾液乳杆菌特异性培养基，通过对碳源、抗生素的优化，使该培养基能够特异性培养唾液乳杆菌并对其进行活菌计数。在此基础上还提供了上述唾液乳杆菌特异性培养基的一种应用，主要是在粪便样本等含有一系列乳杆菌的样品中通过富集提高唾液乳杆菌在样本中的丰度，从而高效的筛选分离出唾液乳杆菌，操作方法简单，选择性较好，成本低廉。本发明主要采取的技术方案是：本发明的第一个目的提供了一种唾液乳杆菌特异性筛选培养基，所述培养基中含有唯一碳源及万古霉素、链霉素等物质。在本发明的一种实施方式中，所述唯一碳源为鼠李糖。在本发明的一种实施方式中，所述培养基为液体培养基或固体培养基。在本发明的一种实施方式中，所述培养基包括如下组分：蛋白胨8-12g/l，酵母提取物4-6g/l，唯一碳源18-22g/l，无水乙酸钠1.8-2.2g/l，柠檬酸氢二胺1.8-2.2g/l，k2hpo4·3h2o2.4-2.8g/l，mgso4·7h2o0.4-0.6g/l，mnso4·7h2o0.24-0.26g/l，吐温-800.8-1.2g/l，万古霉素18×10-3-22×10-3g/l，链霉素0.250-0.262g/l，ph值为4.9-5.1，余量为蒸馏水。在本发明的一种实施方式中，所述唯一碳源20g/l，万古霉素20×10-3g/l，链霉素0.256g/l，ph为5。在本发明的一种实施方式中，所述液体培养基的制备方法为：(1)按配方称取除抗生素外的其他组分，混合后充分溶解，调ph至4.9-5.1，灭菌；(2)将万古霉素、链霉素配溶液，在培养基温度≤55℃时通过无菌滤膜将万古霉素、链霉素配溶液加入培养基中，制备得到液体培养基。在本发明的一种实施方式中，所述固体培养基的制备方法为：(1)按配方称取除抗生素外的其他组分，混合后充分溶解，调ph至4.9-5.1，加入18-22g/l的琼脂搅拌均匀，灭菌；(2)将万古霉素、链霉素配溶液，在培养基温度≤55℃时通过无菌滤膜将万古霉素、链霉素溶液加入培养基中，制备得到固体培养基。在本发明的一种实施方式中，所述抗生素在培养基灭菌后添加，且需在培养基温度≤55℃时无菌添加。本发明的第二个目的是提供一种应用所述培养基分离筛选肠道菌群中唾液乳杆菌的方法，所述方法具体步骤如下：(1)富集：取样品接种于上述液体培养基中，36-38℃下培养16-20h；(2)稀释涂布：将富集后的菌液稀释，取80-120μl后涂布于上述固体培养基，36-38℃下培养16-20h；(3)一级划线纯化：从固体培养基中计数范围在30-300的平板上，挑取几个菌落，在mrs固体培养基上划线，36-38℃培养46-48h；二级划线纯化：取上述一级划线纯化后的单菌落，继续在mrs固体培养基上划线，倒置平皿，36-38℃培养46-48h；(4)单菌扩大培养：取二级纯化后的单菌落，接种于mrs液体培养基中，36-38℃下培养16-20h；(5)菌种鉴定。在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的菌种鉴定的具体方法为：(1)取1ml扩培后的菌液8000rpm离心2min，取上清，菌泥用等量无菌水重悬，重悬后的菌液8000rpm离心2min，弃上清，重复洗涤两次后，取等量无菌水重悬，做为dna模板；(2)pcr所用引物即为16srrna通用引物，对dna模板进行pcr验证。本发明的有益效果：通过选择性培养基进行样品处理时，高效地去除了绝大多数杂菌，普遍提高了唾液乳杆菌的得率，大大提高了唾液乳杆菌的筛选效率。具体实施方式下面结合实施案例对本发明的技术方案作进一步说明。实施案例1常规乳酸菌培养基对唾液乳杆菌的筛选得率目前，唾液乳杆菌并没有针对性的特异性培养基，主要采用的是乳杆菌普适性培养基进行筛选分离，于是，本实施案例考察了普适性培养基对唾液乳杆菌的筛选得率。本实施案例中所涉及的乳杆菌普适性培养基(即glu-van-mrs培养基)配方：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l，ph5.0，万古霉素0.02g/l。mrs生长培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l。上述普适性培养基的制备方法：按重量要求称取除万古霉素之外的其他所需成分，混合溶解后，用hcl溶液调节培养基ph至5.0，115℃高压灭菌20min，灭菌后的培养基温度低于55℃后通过0.22μm的无菌滤膜加入所需的万古霉素。该培养基的为液体培养基，如需制备固体培养基还需在灭菌前加入20g/l的琼脂。上述mrs生长培养基的制备方法：按重量要求称取除万古霉素之外的其他所需成分，混合溶解后，115℃高压灭菌20min。该培养基的为液体培养基，如需制备固体培养基还需在灭菌前加入20g/l的琼脂。利用乳杆菌普适性培养基进行粪便样本的筛选分离，具体实验过程如下：(1)富集：取人群粪便，分别按2％的接种量接种至上述普适性富集液体培养基中，37℃下培养18h；(2)稀释涂布：富集后的菌液用生理盐水依次稀释至10-5，10-2至10-5的四个稀释梯度分别取100μl菌液涂布于普适性固体培养基，倒置平皿，37℃培养48h。(3)一级划线纯化：从普适性培养基中计数范围在30-300的平板上，挑取尽可能不同形态的单菌落，若形态差异小则尽可能多取几个菌落，在mrs生长固体培养基上划线，倒置平皿，37℃培养48h；(4)二级划线纯化：取上述一级划线纯化后的单菌落，继续在mrs生长固体培养基上划线，倒置平皿，37℃培养48h；(5)单菌扩大培养：取二级纯化后的单菌落，接种于5mlmrs生长液体培养基中，37℃下培养18h；(6)菌种保藏：取扩培后的菌液与无菌的60％的甘油溶液按1：1的比例混匀，取1ml加入无菌的保菌管中，至于-80℃冻存。(7)菌种鉴定：取1ml扩培后的菌液8000rpm离心2min，取上清，菌泥用等量无菌水重悬，重悬后的菌液8000rpm离心2min，弃上清，重复洗涤两次后，取等量无菌水重悬，做为dna模板。pcr所用引物即为16srrna通用引物，上游引物为27f，下游引物为1492r。pcr体系为2xtaqmastermixdye12.5μl，无菌水11μl，10μm的27f引物溶液0.25μl，10μm的1492r引物溶液0.25μl，及模板1μl；pcr反应条件为：95℃，15min；30个循环：95℃，10s；55℃，30s；72℃，1min；72℃，5min；4℃，10min；pcr产物通过含1％琼脂糖的凝胶进行核酸电泳，出现目标条带的pcr产物送经生物公司测序，测序结果通过blast进行比对。筛菌结果如下如表1-1所示：表1-1乳杆菌在普适性培养基中筛选结果通过乳杆菌普适性培养基对人粪便样本的筛选分离发现，其中，植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、黏膜乳杆菌、antri、发酵乳杆菌、类食品乳杆菌的筛选得率较高，然而，仅通过乳杆菌普适性培养基对样品的筛选，获得唾液乳杆菌的效率较低，因此，本研究旨在通过对普适性培养基的优化改良，提高唾液乳杆菌在粪便样本中的丰度，从而提高唾液乳杆菌的分离效率。实施案例2不同乳杆菌对碳源的利用能力分析根据伯杰氏手册对各种乳杆菌特性的表征发现，不同乳杆菌对各种碳源的利用能力存在差异，其中根据相关记载，鼠李糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇这四种碳源对于唾液乳杆菌的区分度比较高，但手册未标出上述所有的乳杆菌的糖利用情况，因此，本实施案例考查了上述9种乳杆菌对这四种糖的利用情况，分别挑取9种乳杆菌的一株或几株进行实验。碳源改良的培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，碳源20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l，ph7.0，琼脂20g/l，溴甲酚紫15g/l。受试碳源：甘露醇、棉子糖、山梨醇、鼠李糖。上述培养基的制备方法：根据碳源不同分别制备4种不同的培养基，分别称取除琼脂和溴甲酚紫外的其他所需组分及含量，混匀待其完全溶解，溶液通过naoh溶液调节ph至7.0，而后加入溴甲酚紫溶液和琼脂，115℃高压灭菌20min，灭完菌的固体培养基分别倒入无菌培养皿中待凝。为考察碳源的筛选效果，具体实验流程如下：活化目标菌株：将冻存在保菌管里的菌液在mrs生长固体培养基上划线活化，37℃培养48h，而后挑取单菌落至mrs生长液体培养基中传代培养，37℃培养18h。调节目标菌株的od600一致：将在mrs生长培养基中活化后的23株菌8000rpm离心3min，去上清，用生理盐水稀释重悬，调节菌液od600为0.3。菌液滴板：分别取5μl调好od600的菌液均匀滴在4种培养基上，待其干燥后，置于37℃培养箱中倒置培养48h后观察各种菌利用不同碳源的产酸变色情况。结果如下表所示：表2-1乳杆菌对不同碳源的利用结果注：-即为不能产酸变色即不能利用；+即为能利用相应的碳源产酸变色即能利用；d即为部分能利用。从上表统计可看出，通过4种不同碳源的筛选，未发现只有唾液乳杆菌能利用而其他菌菌不利用的糖，其中罗伊氏乳杆菌、黏膜乳杆菌、antri、发酵乳杆菌、魏斯氏菌、类食品乳杆菌这6种菌不能利用鼠李糖或山梨醇，而唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌四种乳杆菌均能利用棉子糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇这四种糖。实施案例3乳杆菌在不同碳源中的富集能力分析根据实施案例2显示，有6种肠道乳杆菌不能利用鼠李糖和山梨醇，但这两种糖无法区分唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌，考虑到这四种乳杆菌在含这2种不同碳源的培养基中的富集能力是否有差异，至于唾液乳杆菌的富集能力是否优于其他3种菌，通过富集后的丰度差异控制稀释度能否达到一个筛菌的效果？于是，本实施案例以含葡萄糖的培养基为阳性对照，考察了不同菌在接种量一致的条件下，在含山梨醇或鼠李糖的液体培养基中的富集情况。glu-mrs培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l。rha-mrs培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，鼠李糖20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l。sor-mrs培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，山梨醇20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l。上述受试培养基的制备方法：分别称取不同培养基所需的各组分及含量，混合溶解完全，置于115℃高压灭菌20min。受试菌株活化：活化方法同实施案例2；调节各菌株的od600一致：活化好的以下8株菌8000rpm离心2min，弃上清后用生理盐水分别调节od600至5；富集：调好od600的菌株按体积比2％的比例将8株菌分别接种至3种液体培养基中，37℃培养18h；计数：富集后的菌液用生理盐水依次稀释至10-5，10-2至10-5的四个稀释梯度分别取100μl菌液加入无菌平皿中，而后倒入温度≤55℃的mrs生长固体培养基，混匀待凝，37℃倒置培养48h，计数。倾注计数结果如下：表2-2涉及不同碳源的各乳杆菌的计数结果从上表的数据可看出，就每种菌对3种不同碳源的富集能力上，鼠李糖乳杆菌对葡萄糖的利用能力稍逊于其他2种碳源，而植物乳杆菌则对于鼠李糖的富集能力相对弱，副干酪乳杆菌在鼠李糖、葡萄糖的利用能力上不及山梨醇，唾液乳杆菌则是在山梨醇上的利用较好。但就乳杆菌的富集能力比较而言，对于山梨醇，鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌富集后的丰度基本能高于109cfu/ml，而对于鼠李糖，鼠李糖乳杆菌的利用能力相对强，富集丰度能达到109cfu/ml，目标菌株唾液乳杆菌在山梨醇富集后丰度能达到108cfu/ml，而利用鼠李糖后至少能达到107cfu/ml，可作为之后筛菌过程中样本富集后稀释梯度的参考。此外唾液乳杆菌在利用这两种糖的富集后并没有出现优势，但比较丰度发现，唾液乳杆菌在利用含鼠李糖的培养基富集后的丰度与其他3种菌的差异较小，因此，可考虑鼠李糖做为唾液乳杆菌特异性培养基的唯一碳源。实施案例4特异性培养基中抗生素种类的确定考察实施案例2和3的实验结果发现，仅通过碳源的改良并不能完全分离植物乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌这四种乳杆菌，考虑到不同菌具有不同的耐药谱，因此，在以上基础上，本实施案例考察这四种菌对不同抗生素的敏感性，由于目前并没有任何研究报道各种乳杆菌对不同抗生素的耐药谱，因此本研究综合文献中提到的唾液乳杆菌对常用抗生素的耐药性来确定抗生素的种类及浓度，以普通mrs液体培养基为基底，所添加的受试抗生素种类及浓度如表4-1所示：mrs生长培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l。表4-1唾液乳杆菌特异性培养基中受试抗生素及受试浓度抗生素浓度(μg/ml)卡那霉素128链霉素32氨苄青霉素10万古霉素128环丙沙星64庆大霉素10新霉素30四环素512红霉素15克林霉素0.0625氯霉素2利奈唑胺1甲氧苄啶0.25利福平1上述生长培养基的制备方法：按重量要求称取除抗生素之外的其他所需成分，混合溶解后，115℃高压灭菌20min。抗生素的制备：13种抗生素分别用无菌ddh2o制成对应浓度的溶液。本实施案例通过乳杆菌在含抗生素的培养基中是否出现抑菌圈来考察乳杆菌的所耐受的抗生素，具体实施过程如下：受试菌株活化：活化方式同实施案例1中菌株活化方式；调节各菌株的od600一致：调节方式同实施案例1中菌株od600调节方式；菌液倾注：取活化好的各个乳杆菌100μl至无菌平皿中，倾注普通mrs固体培养基，混匀待凝，凝固后的含菌培养基均匀打孔；分别取各抗生素100μl至各个含不同菌的培养基孔内，做好标记后，将平皿正放置于4℃冰箱中过夜；培养：待抗生素在培养基中完全扩散后，将平皿转移至37℃培养箱中倒置培养48h，测其抑菌圈。实验结果如下：表3-2单一浓度下各抗生素对不同乳杆菌的抑菌圈大小注：孔径：9mm，上述抑菌圈均未减去孔径，-为未出现抑菌圈。从上表可看出，通过13种抗生素的筛选，发现在上述浓度下，唾液乳杆菌在含氨苄青霉素、利福平、环丙沙星、红霉素的培养基中均出现了抑菌圈，即对这四种抗生素敏感，而在含克林霉素、新霉素、氯霉素、万古霉素、利奈唑胺、庆大霉素、甲氧苄啶、链霉素、卡那霉素这9种抗生素的培养基中未出现抑菌圈，即对这9种相应浓度下的抗生素耐受，但植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌也耐受这9种抗生素，因此，上述不同浓度的抗生素并不能区分这四种菌，考虑到不同菌对这9种抗生素的耐受程度可能有差异，因此，本研究将继续考察抗生素的浓度对菌活性的影响。实施案例5唾液乳杆菌特异性培养基中抗生素浓度的确定根据实施案例4表明，在上述实验条件下，这13种抗生素并不能分离4种乳杆菌，其中四种菌对9种抗生素菌具有耐药性，因此本实施案例继续考察不同浓度的抗生素对四种菌的存活能力是否具有显著的影响差异，进而通过不同乳杆菌对各抗生素不同浓度的耐受能力差异达到选择性效果。根据国际上抗生素耐药性的浓度要求对涉及抗生素种类及浓度的选择性培养基的进一步筛选，以普通mrs液体生长培养基为基底，所添加的受试抗生素种类及浓度梯度即见表5-1。表5-1唾液乳杆菌选择性培养基中受试抗生素及受试浓度梯度注：上述培养基均是待各组分溶解完全后调节溶液ph至5.0±0.1，稳定后在115℃下高温高压灭菌20分钟，而后待培养基温度低于55℃时，根据不同浓度条件要求加入抗生素进行实验。mrs生长培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l。上述生长培养基的制备方法：按重量要求称取除抗生素之外的其他所需成分，混合溶解后，115℃高压灭菌20min。96孔板的设置：同一行即为一组，1-10号孔分别是加有等量的培养基和同一等量菌液，以及不同浓度的抗生素，11号孔中只含等量的培养基和菌液，12号孔中只含培养基。每组设2个平行。抗生素的制备：每种抗生素分别用ddh2o稀释成上表中各抗生素最高浓度的10倍，待用。抗生素耐受性实验流程如下：受试菌株活化：活化方式同实施案例1中菌株活化方式；调节各菌株的od600一致：调节方式同实施案例1中菌株od600调节方式；菌株活化：培养基的分配：在96孔板的第一列中加入180μl的mrs生长培养基，剩余11列中均加入100μl的mrs生长培养基。抗生素的稀释：取20μl制备好的抗生素分别加入1号孔，吹吸混匀，取100μl混合体系加入2号孔，混匀后继续稀释至10号孔。接种：将调节好od的菌液分别按2％的接种量加入所需加入的孔中，96孔板的最后一列不加菌液。培养：37℃下正置培养18h，用酶标仪测各孔的od600。敏感度判定标准：根据国际标准中菌株对抗生素的敏感性判定标准，前11列孔的od600分别减去第12列孔所得的值为各菌在各抗生素不同浓度中的真值，再分别与11列孔的20％od600比较，若小于该值则判定为敏感即s，否则判定为r。通过敏感度判定标准考察后，各乳杆菌对抗生素的耐受结果见表4-2、4-3、4-4、4-5。表4-2植物乳杆菌对7种不同浓度抗生素的耐受能力注：r为耐受，s为敏感。表4-3副干酪乳杆菌对7种不同浓度抗生素的耐受能力注：r为耐受，s为敏感。表4-4鼠李糖乳杆菌对7种不同浓度抗生素的耐受能力注：r为耐受，s为敏感。表4-5唾液乳杆菌对7种不同浓度抗生素的耐受能力注：r为耐受，s为敏感。根据表4-2至4-5，可得到7种抗生素分别对副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌以及唾液乳杆菌的最小抑制浓度，进而比较各乳杆菌对抗生素的耐受能力差异。统计结果如下：表4-6各抗生素对不同乳杆菌的最小抑菌浓度抗生素(μg/ml)副干酪乳杆菌植物乳杆菌鼠李糖乳杆菌唾液乳杆菌庆大霉素>128>64>16>64链霉素>128>256>8>256新霉素>256>64>64>128氯霉素>1>1>2>0.5利奈唑胺>0.5>0.25>1>0.125甲氧苄啶>32>4>64>2克林霉素>0.0625>0.125>0.125>0.03125由上述各表统计可知，通过7种抗生素各浓度的筛选比较，浓度256μg/ml的链霉素能抑制副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，但不能抑制唾液乳杆菌和植物乳杆菌，因此考虑256μg/ml的链霉素和万古霉素的共同作用，提高筛选唾液乳杆菌的几率。实施案例6人群粪便样本中唾液乳杆菌在rha-van-str-mrs特异性培养基中的分离选育情况综合以上实施案例，本实施案例中的所用的特异性富集培养基配方及含量如下：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，鼠李糖20g/l，无水乙酸钠2g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，k2hpo4·3h2o2.6g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso4·7h2o0.25g/l，吐温-801g/l，蒸馏水1000g/l，万古霉素20×10-3g/l，链霉素0.256g/l，ph值为5.0。上述培养基的制备方法：按配方称取除抗生素外的其他组分，混合后充分溶解，利用hcl将溶液的ph调至5.0，115℃下灭菌20min。将万古霉素、链霉素根据浓度要求用超纯水配成相应的溶液，待灭菌后培养基降至55℃及以下后，通过0.22μm的无菌滤膜将抗生素加入培养基中。上述所述的培养基为液体培养基，若需固体培养基即在上述培养基调节ph前加入20g/l的琼脂，混匀后调节ph并灭菌。为考证特异性培养基的效果，现通过对实际样本的应用进行试验，对人群粪便样本的分离筛选的实验过程如下所示：富集：取吉林桦甸的人群粪便3份，分别是fjlhd7、fjlhd9、fjlhd18，按2％的接种量接种至上述特异性富集液体培养基中，37℃下培养18h；稀释涂布：富集后的菌液用生理盐水依次稀释至10-5，10-2至10-5的四个稀释梯度分别取100μl菌液涂布于特异性固体培养基，倒置平皿，37℃培养48h。对照组则是将同一粪便样本，按相同的接种量接种至实施案例1中所述的普适性液体培养基中，37℃下培养18h，富集后的菌液用生理盐水稀释后，分别取相同梯度的菌液100μl菌液涂布于普适性固体培养基，倒置平皿，37℃培养48h。一级划线纯化：从特异性培养基和普适性培养基中计数范围在30-300的平板上，挑取尽可能不同形态的单菌落，若形态差异小则尽可能多取几个菌落，在实施案例1中所述的普通mrs固体培养基上划线，倒置平皿，37℃培养48h；二级划线纯化：取上述一级划线纯化后的单菌落，继续在普通mrs固体培养基上划线，倒置平皿，37℃培养48h；单菌扩大培养：取二级纯化后的单菌落，接种于5ml普通mrs液体培养基中，37℃下培养18h；菌种保藏：取扩培后的菌液与无菌的60％的甘油按1：1的比例混匀，取1ml加入无菌的保菌管中，至于-80℃冻存。菌种鉴定：取1ml扩培后的菌液8000rpm离心2min，取上清，菌泥用等量无菌水重悬，重悬后的菌液8000rpm离心2min，弃上清，重复洗涤两次后，取等量无菌水重悬，做为dna模板。pcr所用引物即为16srrna通用引物，上有引物为27f，下有引物为1492r。pcr体系为2xtaqmastermixdye12.5μl，无菌水11μl，10μm的27f引物溶液0.25μl，10μm的1492r引物溶液0.25μl，及模板1μl；pcr反应条件为：95℃，15min；30个循环：95℃，10s；55℃，30s；72℃，1min；72℃，5min；4℃，10min；pcr产物通过含1％琼脂糖的凝胶进行核酸电泳，出现目标条带的pcr产物送经生物公司测序，测序结果通过blast进行比对。结果如下：表5-1特异性培养基和普适性培养基对样本fjlhd7的筛选结果通过对fjlhd7的筛菌结果显示，普适性培养基筛到唾液乳杆菌2株，占比22.2％，而通过特异性培养基的富集筛选，筛到6株唾液乳杆菌，占比66.7％，相比于普适性培养基对于唾液乳杆菌的分离效率提高了166.7％。表5-2特异性培养基和普适性培养基对样本fjlhd9的筛选结果通过对fjlhd9的筛菌结果显示，普适性培养基筛到唾液乳杆菌2株，占比20％，而通过特异性培养基的富集筛选，筛到4株唾液乳杆菌，占比40％，相比于普适性培养基对于唾液乳杆菌的分离效率提高了100％。表5-3特异性培养基和普适性培养基对样本fjlhd14的筛选结果通过对fjlhd14的筛菌结果显示，普适性培养基筛到唾液乳杆菌0株，占比0％，而通过特异性培养基的富集筛选，筛到4株唾液乳杆菌，占比50％，相比于普适性培养基对于唾液乳杆菌的分离效率显著提高。根据本实施案例对3份不同个体的筛菌情况分析可知，利用本实施案例中所述的特异性培养基能显著提高唾液乳杆菌在样本中的丰度，进而在筛菌过程中增加了筛到唾液乳杆菌的几率，因此，该特异性培养基可考虑做为唾液乳杆菌的特异性筛选分离方法。上述实施案例，仅是本发明的较佳实施案例，并非是对本发明所作的其他形式的限定。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示或改性为同等变化的等效实施案例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施案例所做出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。当前第1页12