本发明涉及农业种植
技术领域：
，尤其涉及一种柑橘专性am接种剂及其制备方法。
背景技术：
：am真菌，即丛枝菌根真菌，是农业生态系统中一类重要的土壤微生物，对作物具有促进生长发育、改善营养吸收、提高抗病性和抗逆性等诸多有益作用。丛枝菌根，1885年，德国植物生理学和森林学家frank首创“菌根”(fungus-root即mycorrhiza)这一术语。菌根是自然界中一种普遍的植物共生现象,它是土壤中的菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体。共生真菌从植物体内获取必要的碳水化合物及其他营养物质，而植物也从真菌那里得到所需的营养及水分等，从而达到一种互利互助、互通有无的高度统一。它既具有一般植物根系的特征，又具有专性真菌的特性。目前，国外已有相关的接种剂出售，其商品制剂的工厂化生产技术已趋于成熟，但因其价格昂贵，运输不便及在实际使用中存在的诸多问题，导致高质量的am接种剂还相对较少。目前，国内也开始有相关企业涉足本领域，但其产品质量参差不齐，而且产量小，购买后仍需进一步扩繁。总体而言，国内在am真菌接种剂的工厂化、商业化生产方面仍然处在起步阶段，加之am真菌不能离开宿主植物进行单独培养，因此实现am真菌接种剂的大规模商业化生产仍较为困难。现阶段对am真菌接种剂的生产工艺进行了多种改进，如专利cn02159722.7公开了一种生产丛枝菌根真菌菌剂的方法，在由草碳15～25份，蛭石15～20份，珍珠岩30～45份，沸石15～25(重量)份组成的培养基质上，接种相当于基质体积5～10％的含有丛枝菌根真菌的繁殖体的菌剂，采用多种寄主植物混播混作方式进行培养；每2～3天浇一次营养液；培养17～18周后，收集培养基质和植物根系即成；如专利申请cn201511023372.7，公开了一种丛枝菌根真菌菌剂，按照以下步骤制备得到：以白车轴草种子和麦冬种子作为宿主植物，以摩西球囊霉、网状球囊霉、幼套球囊霉或根内球囊霉为接种剂，在特定营养条件下进行培养，将生长至收获期的植株的根部以上部位去除，剩余根系及基质部分粉碎混匀，即得丛枝菌根真菌菌剂，此两种菌剂均含有各种am真菌，用于柑橘种植时有效的柑橘专性丛枝菌根真菌含量较少，效果较差。因此，寻找一种柑橘专性am接种剂是目前急需解决的问题。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种柑橘专性am接种剂及其制备方法，具体是通过以下技术方案得以实现的：(1)将无菌柑橘砧木种子经过无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡0.5-4h，用65-85％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：800-1000的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗12-16周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量15-45％，包装，即得。所述柑橘砧木种子是枳、枳橙的种子。所述专性am真菌是能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。其可以使柑橘长出簇生新根，扩大新根数量，有效增强树势，提高树的免疫抗病能力，促进弗兰克氏放线菌与非豆科植物产生根瘤，形成固氮系统，增加土壤肥力，增加微生态环境中柑橘摄取养分的来源渠道。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得和或粉碎柑橘丛植菌根获得。土壤中含有am根外菌丝体、孢子等繁殖体，柑橘丛植菌根中含有根内菌丝体和内生am菌根菌，可以按需分离获得。所述无菌温水的温度是54-55℃。此温度下，柑橘砧木种子能得到较好的激活效果，提升出芽率。所述无菌土是将田园土、蛭石、谷壳、草木灰按照田园土：蛭石：谷壳：草木灰＝(3-5):(0.5-1.5):(1.5-2.5):(2-4)的重量比进行混配，然后灭菌，即得。按此比例得到的无菌土，较为适宜专性am真菌和柑橘砧木生长。所述灭菌，是用100℃蒸汽处理2h或121℃高压灭菌30min。此时已可灭杀绝大多数有害微生物。柑橘砧木育苗期间，通过菌根菌抽样检验，确定am菌成功接种，并在砧木中存活下来。将专性am真菌与无菌土混合后，专性am真菌会有部分死亡，有时死亡率较大，导致没有专性am真菌在砧木中存活下来，影响柑橘专性am真菌接种剂的生产成功率。本发明过程中进行了一系列的研究及实验，以下选取部分过程进行披露：试验例1：对无菌土的配比进行筛选试验：按照如下比例制备无菌土待用：田园土重量份蛭石重量份谷壳重量份草木灰重量份第1组4123第2组50.51.52第3组31.51.52第4组30.52.52第5组30.51.54第6组5123第7组41.523第8组412.53第9组4124第10组3123第11组40.523第12组411.53第13组4122得到13份不同的无菌土，通过如下步骤处理：(1)将30kg无菌柑橘砧木种子经过无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干，收集待用；(2)将柑橘专性am真菌分别按照1：900的比例与各份无菌土混合。(3)将柑橘砧木种子分别在其中育苗14周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，混合均匀后检测其中孢子密度及菌丝长度。组别孢子密度(个/10g)菌丝总长度(米/10g)第1组138.2180.6第2组87.3126.3第3组91.4137.5第4组92.5140.1第5组88.6139.6第6组111.5165.4第7组117.8167.6第8组116.4170.3第9组120.4173.7第10组109.6159.6第11组102.4168.6第12组105.6165.2第13组103.4163.7由上数据可知，无菌土中合适的田园土：蛭石：谷壳：草木灰比例，可以有效的提升孢子密度及菌丝总长度，按照田园土：蛭石：谷壳：草木灰＝4:1:2:3的重量比配置得到的无菌土，更适宜柑橘专性am真菌的生长。试验例2：对柑橘砧木育苗时间进行筛选试验：通过如下步骤进行前期准备：(2)将30kg无菌柑橘砧木种子经过无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干，收集待用；(2)将田园土、蛭石、谷壳、草木灰按照田园土：蛭石：谷壳：草木灰＝4:1:2:3的重量比进行混配，然后灭菌，制得无菌土，待用；(3)将柑橘专性am真菌分别按照1：700、1：800、1：900、1：1000、1：1100的比例与无菌土混合，得到5份不同的柑橘专性am真菌培养土。将每种柑橘专性am真菌培养土平均分为5组。将柑橘砧木种子分别在其中育苗10、12、14、16、18周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，混合均匀后检测其中孢子密度及菌丝长度。由上数据可知，提升am真菌与无菌土比例，可以提升孢子密度及菌丝长度的增长速度，但是过高的am真菌比例，会导致孢子密度上限较低；并且柑橘砧木种子育苗时间在12-16周时孢子密度基本达到峰值，继续育苗会导致孢子密度下降，并且菌丝长度也没有较明显提升。柑橘根毛较少，对土壤中的丛植菌根真菌的依赖性较强，丛植菌根真菌与柑橘共生能增强根系对水分、矿物营养特别是磷的吸收而促进植物的生长。丛枝菌根扩大了柑橘根系吸收范围，增加了根系对水分及营养物质的吸收，提高植物的抗逆能力，改善植物营养条件。促进根圈微生物固氮菌、磷细菌的生长，并对共生固氮微生物的结瘤有良好的影响。柑橘专性am真菌接种剂能够促进柑橘根部的生长，使柑橘长出簇生新根，扩大新根数量，有效增强树势，提高树的免疫抗病能力，促进弗兰克氏放线菌与非豆科植物产生根瘤，形成固氮系统，增加土壤肥力，增加微生态环境中柑橘摄取养分的来源渠道，改善柑橘生长的生态环境，对柑橘黄龙病有很好的辅助治疗效果。由于am真菌具有的专性共生的性质，目前还无法对其进行单独的无菌培养，只能依赖活体植物对其进行繁殖，尚未有较好的大规模am真菌接种剂生产方法。本发明通过将分离获得的柑橘专性am真菌按照1：800-1000的比例与无菌土混合，并在其中进行柑橘砧木育苗12-16周，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生，然后将柑橘砧木根系及其培养土粉碎后包装得到。本发明通过严格控制柑橘专性am真菌与无菌土混合的比例，且控制柑橘砧木育苗的时间，最终得到了一种am真菌含量高，接种活性好，并且其中根外菌丝体、孢子、根内菌丝体、内生am菌根菌等比例较为适宜的柑橘专性am真菌接种剂。与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：本发明通过将分离获得的柑橘专性am真菌按照1：800-1000的比例与无菌土混合，并在其中进行柑橘砧木育苗12-16周，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生，然后将柑橘砧木根系及其培养土粉碎后包装得到。本发明通过严格控制柑橘专性am真菌与无菌土混合的比例，且控制柑橘砧木育苗的时间，最终得到了一种am真菌含量高，接种活性好，并且其中根外菌丝体、孢子、根内菌丝体、内生am菌根菌比例较为适宜的柑橘专性am真菌接种剂。具体实施方式下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。实施例1一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳木种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过54.5℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：900的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗14周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量30％，包装，即得。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得和粉碎柑橘丛枝菌根获得的，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。所述无菌土是普通田园土灭菌后得到。实施例2一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳木种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过30℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡0.5h，用65％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：800的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗12周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量15％，包装，即得。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得和粉碎柑橘丛枝菌根获得的，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。所述无菌土是普通田园土灭菌后得到。实施例3一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳木种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过70℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡4h，用85％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：1000的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗16周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量45％，包装，即得。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得和粉碎柑橘丛枝菌根获得的，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。所述无菌土是将田园土、蛭石、谷壳、草木灰按照田园土：蛭石：谷壳：草木灰＝4:1:2:3的重量比进行混配，然后用100℃蒸汽处理2h灭菌，即得。实施例4一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳木种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过54.5℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：900的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗14周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量30％，包装，即得。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得和粉碎柑橘丛枝菌根获得的，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。所述无菌土是将田园土、蛭石、谷壳、草木灰按照田园土：蛭石：谷壳：草木灰＝4:1:2:3的重量比进行混配，然后用100℃蒸汽处理2h灭菌，即得。实施例5一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳木种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过54.5℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：900的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗14周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量30％，包装，即得。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得和粉碎柑橘丛枝菌根获得的，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。所述无菌土是将田园土、蛭石、谷壳、草木灰按照田园土：蛭石：谷壳：草木灰＝4:1:2:3的重量比进行混配，然后用100℃蒸汽处理2h灭菌，即得。实施例6一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳木种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过54.5℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：900的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗14周，期间通过菌根菌抽样检验，确定am菌成功接种，并在砧木中存活下来，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量30％，包装，即得。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得和粉碎柑橘丛枝菌根获得的，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。实施例7一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳木种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过54.5℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：900的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗14周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量30％，包装，即得。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。实施例8一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳木种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过54.5℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：900的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗14周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量30％，包装，即得。所述专性am真菌是通过粉碎柑橘丛枝菌根获得的，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。实施例9一种柑橘专性am真菌接种剂，通过如下方法制备：(1)取1kg无菌枳橙种子作为柑橘砧木种子，将无菌柑橘砧木种子经过54.5℃无菌温水清洗后，再用无菌温水浸泡2h，用75％酒精漂洗晾干；(2)将柑橘专性am真菌按照1：900的比例与无菌土混合，在其中培育晾干的柑橘砧木种子，进行柑橘砧木育苗，使柑橘专性am真菌得到充分的扩繁并且与柑橘砧木根系充分共生；(3)柑橘砧木育苗14周，最后将柑橘砧木根系及其培养土经过粉碎处理，使土壤中的am根外菌丝体、孢子等繁殖体；柑橘砧木根系中的根内菌丝体、内生am菌根菌，混合均匀后包装，即得柑橘专性am真菌接种剂；(4)控制柑橘专性am真菌接种剂水分含量30％，包装，即得。所述专性am真菌是通过从土壤中分离获得和或粉碎柑橘丛枝菌根获得的，并且能使柑橘产生丛枝菌根的共生菌。对比例1：按照专利cn02159722.7的实施例1制得。对比例2：按照专利cn201511023372.7的实施例1制得。果园施用对比实验：选择柑橘果园中12块不相邻的种植有柑橘的地块，每块0.5亩，分别施用实施例1-9和对比例1-2所得的am真菌接种剂，留一块不施用作为空白对照组，测定4个月后各地块柑橘的真菌侵染率、当年柑橘产量并对当年所产柑橘进行营养价值测定。对比可知，本发明得到的柑橘专性am真菌接种剂，真菌侵染率高，对提升柑橘产量有着较好的效果，并且能极大的提升柑橘的可溶性固形物及维生素c的含量，还有略微的提升总糖含量和降低总酸含量，可以使柑橘的风味得到进一步的提升。最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12