本发明属于纳米粒子制备和生物荧光材料领域，具体涉及一种水溶性共轭聚合物纳米粒子的可控制备方法。
背景技术：
非侵入式的荧光生物成像具有灵敏度高、检测反馈迅速、实时成像、成本低廉等特点，能够在生物体的多个层面(分子、细胞、组织、器官)实现可视化观察生物标志物及其相互作用过程，是生物成像的重要方式之一。荧光生物成像极大拓展了人类对生物医药过程的认知，使人们更有能力去检测和治愈所面临的疾病。荧光成像需要成像设备和显影剂，然而，小分子荧光显影剂具有易淬灭、不能特异性富集、易代谢等劣势。纳米荧光成像体系则可以克服小分子显影剂的劣势，纳米粒子具有多模式成像、靶向性强、epr效应、负载能力强、生物分布可调等特点，结合荧光成像和纳米技术将会为更好地理解基本的生物过程、健康检测、诊断治疗等提供新的机遇。
当前荧光成像纳米体系主要包括无机半导体量子点、上转化纳米粒子、荧光蛋白、负载荧光小分子的纳米体系以及共轭聚合物纳米粒子等。然而，无机半导体量子点及上转化纳米粒子目前还难以克服重金属的毒性问题、荧光蛋白和小分子探针体系易发生荧光淬灭等问题，共轭聚合物纳米粒子则较好地克服了上述问题而受到更多的关注。共轭聚合物纳米粒子(conjugatedpolymernanoparticles,cpns)具有大的光学吸收系数、高的量子产率、稳定且可调的光学性质、结构尺寸和表面性质调节性强等特点；而且cpns是由有机组分构建的纳米体系，生物相容性好并具有纳米的epr效应；是一类非常有前景的纳米生物显影剂。此外，cpns还具有光热效应可用于光热治疗；光照产生生物活性的活性氧物种(ros)用于光动力治疗等，cpns还是一类兼具诊疗性质的纳米体系。
cpns主要由具有光学或电学活性的共轭聚合物构成，主要制备方法有细乳液法和纳米沉淀法。一般由单体先制备可溶的共轭聚合物，再通过细乳液法或纳米沉淀法等制备由弱相互作用驱动的多分子胶束cpns。这种策略所制备的cpns存在以下问题：(1)多组分过程，制备过程一般需要加入表面活性剂等辅助组分，辅助组分的生理毒性等限制了其应用范围；(2)尺寸可控性差，合成可溶共轭聚合物本身就难以可控，加上组装过程复杂，所得cpns尺寸难以均匀；(3)结构稳定性不足，所得cpns是多分子胶束组装体，易受到外界温度、ph、离子强度等环境因素影响；(4)表面性质不明确，该组装过程并不明确所得cpns外部的官能团，使其功能化或靶向修饰较难实现。所以如何可控制备cpns是该领域的难题。
因此，设计并构筑尺寸均一的水溶性荧光共轭聚合物纳米粒子具有一定意义。
技术实现要素：
针对现有的共轭聚合物纳米粒子合成步骤繁琐，所得产物尺寸不均一且结构不够稳定，难以确定粒子的表面性质等问题，本发明旨在提供一类表面亲水，尺寸可控的共轭纳米粒子的制备方法，具体为一种水溶性共轭聚合物纳米粒子的可控制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种水溶性共轭聚合物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
a、利用卤代酰卤对环糊精进行修饰，制备卤代环糊精；
b、在卤代环糊精中加入含噻吩的烯烃单体进行聚合反应，制备以环糊精为中心、含噻吩侧基的星形聚合物；
c、将水溶性单体通过聚合接枝到步骤b制备的以环糊精为中心、含噻吩侧基的星形聚合物上，对其表面进行修饰实现表面性质的控制，得到表面亲水、内层含噻吩侧基的星形聚合物；
d、对表面亲水、内层含噻吩侧基的星形聚合物进行氧化交联反应即得到水溶性共轭聚合物纳米粒子。
优选地，步骤a中，卤代环糊精的制备方法如下：
在环糊精中加入卤代酰卤，在0℃下搅拌反应0.5-8小时，然后升温至环境温度继续反应2-72小时，即得卤代环糊精。
优选地，所得卤代环糊精通过在正己烷中沉淀进行纯化。
优选地，所述卤代酰卤选自2-溴异丁酰溴，2-溴丙酰溴，2-溴正丁酰溴，溴乙酰溴，2-溴-3-甲基丁酰溴，2-氯异丁酰氯，2-氯丙酰氯，2-氯正丁酰氯，氯乙酰氯，2-氯-3-甲基丁酰氯。
优选地，步骤b中，所述聚合反应的条件为：20-80℃油浴中反应1-40小时；所述含噻吩的烯烃单体选自3-噻吩甲基丙烯酸酯，3-乙烯基噻吩，3-噻吩甲基-2-丙烯基胺，丙烯酸(3-噻吩甲酯)，甲基丙烯酸(3-噻吩甲酯)，丙烯酸(3-噻吩乙酯)，甲基丙烯酸(3-噻吩甲酯)。
优选地，步骤c中，所述聚合接枝的反应条件为：-20-60℃下反应0.1-40小时；所述水溶性单体选自寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯，n-乙烯基吡咯烷酮。
优选地，步骤d中，所述氧化交联反应具体为：在表面亲水、内层含噻吩侧基的星形聚合物中加入三氯化铁，在-20-60℃下反应1-48小时。
优选地，所述三氯化铁溶于醇溶液中，优选地，溶于甲醇溶液中，三氯化铁的浓度为1-20mol·l-1，三氯化铁浓度过低则难以完全氧化交联，浓度过高则会形成沉淀，不利于后续纯化处理。
本发明提供了一种如前所述的方法制备水溶性共轭聚合物纳米粒子，所述纳米粒子为共价结构，其内部为共轭聚合物，外围共价接枝亲水性聚合物链。
优选地，所述纳米粒子的粒径为2-100nm。
本发明还提供了一种水溶性共轭聚合物纳米粒子在非侵入式荧光生物成像中的应用。
本发明以溴代环糊精为引发剂，采用多步原子转移自由基聚合法引入含噻吩侧基的聚合物链段和亲水性的聚乙二醇甲基丙烯酸酯链段，进一步对噻吩链段进行氧化交联，得到一种水溶性共轭聚合物纳米粒子。该聚合物纳米粒子合成工艺简单，尺寸均一且重现性好，有望应用于非侵入式的荧光生物成像、健康检测、诊断治疗等领域。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明创造性的提出一类水溶性尺寸可控共轭纳米粒子的制备方法，能够获得尺寸均一的水溶性纳米粒子，结构稳定、表面性质明确。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例1-4的合成路线示意图；
图2为本发明实施例1-4的核磁示意图；
图3为本发明实施例3和4所得聚合物的gpc示意图；
图4为本发明实施例3-5中聚合物的丁达尔效应示意图；
图5为本发明实施例5中水溶性尺寸可控的共轭纳米粒子cd-(oxi-path)-poegma的荧光光谱图；
图6为实施例5的合成示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例提供了一种水溶性共轭聚合物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
a、利用卤代酰卤对环糊精进行修饰，制备卤代环糊精；
b、在卤代环糊精中加入含噻吩的烯烃单体进行聚合反应，制备以环糊精为中心、含噻吩侧基的星形聚合物；
c、将水溶性单体通过聚合接枝到步骤b制备的以环糊精为中心、含噻吩侧基的星形聚合物上，对其表面进行修饰实现表面性质的控制，得到表面亲水、内层含噻吩侧基的星形聚合物；
d、对表面亲水、内层含噻吩侧基的星形聚合物进行氧化交联反应即得到水溶性共轭聚合物纳米粒子。
步骤a中，卤代环糊精的制备方法如下：
在环糊精中加入卤代酰卤，在0℃下搅拌反应0.5-8小时，然后升温至环境温度继续反应2-72小时，即得卤代环糊精。
所得卤代环糊精通过在正己烷中沉淀进行纯化。
所述卤代酰卤选自2-溴异丁酰溴，2-溴丙酰溴，2-溴正丁酰溴，溴乙酰溴，2-溴-3-甲基丁酰溴，2-氯异丁酰氯，2-氯丙酰氯，2-氯正丁酰氯，氯乙酰氯，2-氯-3-甲基丁酰氯。
步骤b中，所述聚合反应的条件为：30-80℃油浴中反应1-40小时；所述含噻吩的烯烃单体选自3-噻吩甲基丙烯酸酯，3-乙烯基噻吩，3-噻吩甲基-2-丙烯基胺，丙烯酸(3-噻吩甲酯)，甲基丙烯酸(3-噻吩甲酯)，丙烯酸(3-噻吩乙酯)，甲基丙烯酸(3-噻吩甲酯)。
步骤c中，所述聚合接枝的反应条件为：-20-40℃下反应0.1-40小时；所述水溶性单体选自寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯，n-乙烯基吡咯烷酮。
步骤d中，所述氧化交联反应具体为：在表面亲水、内层含噻吩侧基的星形聚合物的溶液中加入三氯化铁，在-20-60℃下反应1-48小时。
所述三氯化铁溶于醇溶液中，优选地，溶于甲醇溶液中，三氯化铁的浓度为1-20mol·l-1，三氯化铁浓度过低则难以完全氧化交联，浓度过高则会形成沉淀，不利于后续纯化处理。
以下实施例还提供了一种如前所述的方法制备水溶性共轭聚合物纳米粒子，所述纳米粒子为共价结构，其内部为共轭聚合物，外围共价接枝亲水性聚合物链。
所述纳米粒子的粒径为2-100nm。
实施例1
本实施例制备溴代环糊精的方法包括以下步骤：
在氩气(ar)氛围中将环糊精(cd)溶于无水n-甲基吡咯烷酮中并冷却到0℃。在磁力搅拌下向cd溶液中逐滴加入2-溴异丁酰溴，在0℃下反应2小时，然后回复到环境温度再继续反应22小时，纯化后可得产物溴代环糊精cd-br。其反应方程如图1所示，核磁表征如图2所示。
实施例2
本实施例制备含噻吩的烯烃单体：3-噻吩甲基丙烯酸酯(ath)，包括以下步骤：
在氩气(ar)氛围中将3-噻吩甲醇(100mmol)和三乙胺(120mmol)溶于超干二氯甲烷(150ml)中并冷却到0℃，在磁力搅拌下向溶液中逐滴加入丙烯酰氯(110mmol)，在0℃下反应2小时，然后回复到环境温度搅拌过夜，洗涤纯化，硅胶柱层析得粗产物后减压蒸馏得到纯净产物。其反应方程如图1所示，核磁表征如图2所示。
实施例3
本实施例制备尺寸可控的星形聚合物(cd-path)，包括以下步骤：
在室温和氩气(ar)氛围中，将实施例1得到的cd-br(0.01mmol)，实施例2得到的ath(42mmol)溶解在dmf(12ml)中，冷冻-解冻一次后在氩气保护下加入cubr(0.42mmol)和配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(hmteta,0.42mmol)，继续冷冻-解冻循环三次，在50℃油浴中反应4小时，得到的混合物用氯仿稀释后过中性三氧化二铝柱，浓缩后在甲醇中沉淀，反复溶解、沉淀三遍后烘干。其反应方程如图1所示，核磁表征如图2所示，gpc表征如图3所示，说明其尺寸可控。丁达尔现象如图4所示，说明溶液中存在均匀分散的纳米粒子。
实施例4
本实施例制备亲水性的星形聚合物(cd-path-poegma)，包括以下步骤：
在室温和氩气(ar)氛围条件下，将实施例3得到的cd-path(0.001mmol)，oegma(8.0mmol)溶于dmf中，冷冻-解冻循环三次后在氩气保护下加入cubr(0.042mmol)和五甲基二乙烯三胺(0.042mmol)，密封后在冰水浴(0℃)中反应15min，得到的混合物用氯仿稀释过中性三氧化二铝柱，浓缩后在乙醚中沉淀离心，反复溶解、沉淀三遍后烘干得到产物。其反应方程如图1所示，核磁表征如图2所示，gpc表征如图3所示，说明其尺寸可控，其丁达尔现象如图4所示，说明溶液中存在均匀分散的纳米粒子。
实施例5
本实施例制备水溶性共轭聚合物纳米粒子(cd-(oxi-path)-poegma)，包括以下步骤：
在一定温度(-20-60℃)下取一定量实施例4得到的星形聚合物cd-path-poegma(0.001mmol)溶于氯仿(30ml)中，搅拌下滴加18mol·l-1三氯化铁的甲醇溶液2ml，反应24小时，得到的混合物用氯仿稀释过中性三氧化二铝柱，浓缩得到产物。其反应方程如图6所示，丁达尔现象如图4所示，说明溶液中存在均匀分散的纳米粒子，其荧光光谱如图5所示。所得纳米粒子的粒径为15nm。
需要说明的是，本发明采用2-溴丙酰溴，2-溴正丁酰溴或溴乙酰溴代替2-溴异丁酰溴，或者采用3-乙烯基噻吩，3-噻吩甲基-2-丙烯基胺，丙烯酸(3-噻吩甲酯)，甲基丙烯酸(3-噻吩甲酯)，丙烯酸(3-噻吩乙酯)，甲基丙烯酸(3-噻吩甲酯)代替3-噻吩甲基丙烯酸酯，或者采用n-乙烯基吡咯烷酮代替寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯用于上述实施例中，也同样能制备得到水溶性共轭聚合物纳米粒子，其丁达尔现象、荧光光谱与实施例5基本一致。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。