本发明提供一种猪肉作为主要基质的单核细胞增生李斯特氏菌标准样品及其制备方法，属于微生物学检测方面的质量控制领域。
背景技术
猪饲养简易，猪肉又具有骨细筋少肉多的特点，是世界范围内主要的肉类食品。猪肉富含蛋白质及脂肪、碳水化合物、钙、铁、磷等营养成分，经过烹调加工后肉味特别鲜美，是我国餐桌上重要的动物性食品之一。我国猪肉的主要消费形式是经过加工的冷鲜肉，由于猪肉营养物质和水分含量都比较高，所以很容易受到微生物的污染。在屠宰过程中，猪肉不可避免要携带来自环境和动物肠道、皮毛等部位的大量微生物，所以生产加工和储藏过程中，如果处理不当很容易造成微生物的二次污染。受微生物污染的猪肉，如果携带致病菌，或者迅速繁殖，可能会对公众健康构成潜在的威胁，因此，提高产品质量、加强猪肉微生物的检测和控制对保障食品安全至关重要。
单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患病的食源性致病菌，人类感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，并且在4℃的条件下仍可生长繁殖，是威胁人类健康的主要病原菌之一，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。因此，制备单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，尤其是有合适食品基质的标准样品对实验室能力验证、质量控制、方法验证等都有深远的意义。在单核细胞增生李斯特氏菌标准样品中，如果目标菌易发生变化(繁殖或死亡等)，会导致标准样品均匀性和稳定性较差，影响标准样品的使用效果和保质期。因此，在制备猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品时，需要综合考虑选用标准菌株的生化特性，冻干的工艺条件，冻干前对目标菌的低温刺激和基质中保护剂的添加等交互的关系，以达到最佳的冻干效果。
单核细胞增生李斯特氏菌最常见的污染食品为肉及肉制品，猪肉是我国最主要肉食消费品，所以猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌的检测直接关系猪肉的卫生质量和致病风险。制备均匀性和稳定性良好的以猪肉为基质的单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，可以避免单核细胞增生李斯特氏菌检验的随意性和不确定性，对实验室进行能力验证、方法验证、仪器校准、测试结果的质量控制等都具有特殊重要的意义。
技术实现要素：
本发明是将猪肉作为一种基质，向其中加入一定量的单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株，经过一系列冷冻干燥的工艺处理，同时加入针对单核细胞增生李斯特氏菌的保藏干燥保护剂，制成猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，目的是克服单核细胞增生李斯特氏菌标准样品中目标菌的活菌数在运输、储藏和检测等过程中容易发生变化的问题，提供一种均匀性、稳定性符合标准样品要求的猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，并确保该制备方法的工艺简单可行，成功率高。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：
本发明提供了一种单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，包括目标菌和背景菌群，所述目标菌为单核细胞增生李斯特氏菌，所述背景菌群由英诺克李斯特氏菌，绵羊李斯特氏菌，金黄色葡萄球菌组成。
本发明的标准样品以猪肉、丙酮酸钠、维生素c和无菌生理盐水为基质，其中丙酮酸钠的浓度为500mg/kg、维生素c的浓度为500mg/kg。在本领域中，标准样品经常发生目标菌繁殖或死亡的现象，大大影响标准样品的均匀性和稳定性。为克服该现象，本发明在基质中加入特制的干燥保护剂，浓度为500mg/kg。
所述的干燥保护剂成分为：脱脂乳粉，谷氨酸钠、羧甲基纤维素钠，瓜尔胶、海藻酸钠。重量比为：5:1-2:1-3:2-5:1-3。
现有公开的文献中，关于微生物干燥保护剂的成分比较多，常见的成分都是脱脂乳粉、海藻糖、谷氨酸钠等，本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌在真空冷冻条件下容易死亡、不易保存的特点，提供一种特定的保护剂，利用羧甲基纤维素钠吸湿性的特点，防治在冷冻干燥下，微生物大量失水造成目标菌的死亡，羧甲基纤维素钠可以让水分缓慢蒸发，提高目标菌的成活率。瓜尔胶为大分子天然亲水胶体，属于天然半乳甘露聚糖，品质改良剂之一，一种天然的增稠剂。瓜尔胶可以保护微生物在保藏过程中对极端低温条件下的反应，让微生物更好的处于休眠状态。
所述样品中目标菌的目标浓度为102～103cfu/g，背景菌群的目标浓度为103～104cfu/g。
本发明还提供一种制备所述的菌标准样品的方法，包括样品基质的选择及制备、添加菌株的选择、菌株复苏传代、增菌、对目标菌的低温刺激、菌悬液配制、样品分装、真空冷冻干燥和包装、储存等，具体过程为：
(1)样品基质的选择及制备
选购猪的脊椎骨内侧的条状嫩肉，即猪的里脊肉，要求其色泽红润，肉质透明，质地紧密，富有弹性，手按后能够很快复原，并除去连在肉上的筋和膜，只保留质嫩无筋的瘦肉。将猪肉混合搅匀，每5kg搅碎猪肉中加1kg丙酮酸钠和1kg维生素c溶液，丙酮酸钠的浓度为500mg/kg、维生素c的浓度为500mg/kg，混匀制成肉浆。
(2)添加菌株的选择
根据选择单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogens)atcc13932，英诺克李斯特氏菌(listeriainnocua)atcc33090，绵羊李斯特氏菌(listeriaivanuii)atccbaa-139，金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc29213。
(3)菌株复苏传代
将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基上，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定。
(4)增菌
将鉴定后符合要求的标准菌株接种到营养肉汤中，在36±1℃下进行培养，目标菌培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，备用。
(5)低温刺激
将对数生长期的目标菌放到4±1℃下继续培养，培养至稳定期，备用。
(6)菌悬液的配制
将上述过程(4)和(5)得到的菌液，用无菌生理盐水进行梯度稀释，稀释到目标菌的目标浓度为105～106cfu/ml，背景菌群的目标浓度为106～107cfu/ml，将目标菌和背景菌群的稀释液1:1混合均匀，得到备用混合菌液。
(7)样品分装
向步骤(1)得到的猪肉肉浆中加入步骤(6)得到的混合菌液7ml，加入干燥保护剂，进一步混合，使用搅拌器不断搅拌，确保菌液和肉糜混合均匀，将混合均匀的肉糜分装到样品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实，每瓶重量为1.5g。
(8)真空冷冻干燥和包装
将装有肉糜的样品瓶开盖放入冻干机中，真空冷冻干燥48～50h，当样品冻干程序结束后，直接在冻干机内进行压塞，关闭机器，进行放气，取出样品时样品瓶内为真空状态；
(9)储存
取出的样品再加盖金属盖进行密封，放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品进行均匀性和稳定性实验。
所述样品的均匀性和稳定性试验依据cnas-gl03:2006《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》进行。
本发明均匀性、稳定性符合标准样品要求，可以最大程度保证测试样品的稳定性，从满足特殊运输的条件着手，通过特殊工艺的研究、稳定性和均匀性的研究等形成一套完善的标准样品制备技术，适合于制备符合标准样品要求的猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，适用于实验室的能力验证、质量控制、方法验证等用途。本发明也解决了国内肉类食品中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品紧缺的状况，不同基质的致病菌标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。
具体的，本发明的有益效果是：
1.模拟真实食物(猪肉)基质，并严格限制使用猪的脊椎骨内侧的条状嫩肉，即猪的里脊肉，在匀浆制成肉糜的过程中，加入丙酮酸钠和维生素c的溶液，有利于冻干后目标菌的复苏和防止猪肉特定内含成分氧化的作用。
2.活的微生物、数量不易发生变化、生化特征不易发生变化，冷冻真空干燥的冻干程序使冻干彻底，保存效果更好。
3.本发明的产品运输方便，保质期长，样品均匀稳定，可用于相关检测的能力验证、质量控制等，产品具有显著的经济价值和市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1
单核细胞增生李斯特氏菌标准样品，包括目标菌和背景菌群，所述目标菌为单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogens)，所述背景菌群由英诺克李斯特氏菌(listeriainnocua)，绵羊李斯特氏菌(listeriaivanuii)，金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)组成。
所述样品以猪肉、丙酮酸钠、维生素c和无菌生理盐水为基质，其中丙酮酸钠的浓度为500mg/kg、维生素c的浓度为500mg/kg。加入特制的干燥保护剂，浓度为500mg/kg。
所述样品中目标菌的目标浓度为102～103cfu/g，背景菌群的目标浓度为103～104cfu/g。
实施例2
一种实施例1中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品的制备方法，包括样品基质的选择及制备、添加菌株的选择、菌株复苏传代、增菌、对目标菌的低温刺激、菌悬液配制、样品分装、真空冷冻干燥和包装、储存、样品的均匀性和稳定性试验等，具体过程为：
(1)样品基质的选择及制备
选购猪的脊椎骨内侧的条状嫩肉，即猪的里脊肉，要求其色泽红润，肉质透明，质地紧密，富有弹性，手按后能够很快复原，并除去连在肉上的筋和膜，只保留质嫩无筋的瘦肉。将猪肉混合搅匀，每5kg搅碎猪肉中加1kg丙酮酸钠和1kg维生素c溶液，丙酮酸钠的浓度为500mg/kg、维生素c的浓度为500mg/kg，混匀制成肉浆；
(2)添加菌株的选择
按照目标菌：单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogens)，背景菌群：英诺克李斯特氏菌(listeriainnocua)，绵羊李斯特氏菌(listeriaivanuii)，金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)组成选择标准菌株，所选标准菌株均购于美国典型菌种保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)，附有菌株证书，保证了菌株的溯源性；
(3)菌株复苏传代
将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基上，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；
(4)增菌
将鉴定后符合要求的标准菌株接种到100ml营养肉汤中，在36±1℃下，使用摇床进行培养，目标菌培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，备用；
(5)低温刺激
将对数生长期的目标菌放到4±1℃下继续培养，培养至稳定期，备用；
(6)菌悬液的配制
将上述过程(4)和(5)得到的菌液，用无菌生理盐水进行梯度稀释，稀释到目标菌的目标浓度为105～106cfu/ml，背景菌群的目标浓度为106～107cfu/ml，将目标菌和背景菌群的稀释液1:1混合均匀，得到备用混合菌液；
(7)样品分装
向步骤(1)得到的猪肉肉浆中加入步骤(6)得到的混合菌液7ml，加入特制的干燥保护剂，浓度为500mg/kg；进一步混合，使用搅拌器不断搅拌，确保菌液和肉糜混合均匀，将混合均匀的肉糜分装到样品瓶(玻璃西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实，每瓶重量为1.5g；
所述的干燥保护剂成分为：脱脂乳粉，谷氨酸钠、羧甲基纤维素钠，瓜尔胶、海藻酸钠。重量比为：5:1:1:3:1。
(8)真空冷冻干燥和包装
将装有肉糜的样品瓶开盖放入冻干机中，真空冷冻干燥机参数设置如下：
采用德国christ冻干机(型号：epsilon2-6d)进行样品的冷冻干燥。-50℃预冷冻6h，-70℃并且0.1mbar真空度冷冻10h，-10℃-30℃快速升温干燥8h以上，直至完全干燥，得到样品冻干粉。
真空冷冻干燥持续48h，当样品冻干程序结束后，直接在冻干机内进行压塞，关闭机器，进行放气，取出样品时样品瓶内为真空状态；
(9)储存
取出的样品再加盖金属盖进行密封，放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品进行均匀性和稳定性实验。
所述样品的均匀性和稳定性试验依据cnas-gl03:2006《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》进行。
所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：
从制备好的猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品中随机选取12个样品，按照cnas-gl03:2006《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》中的均匀性检验的单因子方差分析进行。随机选取的12个样品，按照gb4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》方法的第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法进行检测，在重复条件下测试2×12份样品的单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数。结果数据用单因子方差分析进行统计处理，统计结果见表1。猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品的结果进行单因素方差分析，结果见表2。
表1猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品均匀性检验结果
表2猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品单因素方差分析
按α＝0.05，v1＝11，v2＝12查表，f临界值f0.05(11,12)＝2.72，计算的f值为2.50，小于f临界值，表明样品均匀性符合能力验证样品的要求。
采用平均值一致性检验法评价样品的稳定性检验。按下式计算t值：
式中：—第一次检验测量数据的平均值；
—第二次检验测量数据的平均值；
—第一次检验测量数据的标准偏差；
—第二次检验测量数据的标准偏差；
—第一次检验测量的测量次数；
—第二次检验测量的测量次数。
若t＜显著性水平α(通常α＝0.05)自由度为n1+n2-2的临界值tα(n1+n2-2)，则两个平均值之间无显著性差异。
采用两种类型的稳定性试验：一种是在2℃～8℃低温条件下的稳定性试验，分别进行15天和30天这两个保存时间的检测；一种是在25℃±1℃高温条件下的稳定性试验，该温度模拟样品的快递运输条件，分别进行5天和10天这两个时间点的检测。稳定性检验每个温度的每个时间点各随机选取6个样品，按照gb4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》方法的第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法进行检测，在重复条件下测试2×6份样品的单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数。将稳定性结果分别与均匀性检验结果相比较进行t检验，与t临界值t0.05(16)＝2.12相比较，计算得到的t值均小于t临界值，这表明在0.05显著性水平时，样品中的单核细胞增生李斯特氏菌的数量是稳定的。具体实验数据见表3和4。
表3猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品25℃±1℃稳定性检验结果
表4猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品2℃～8℃稳定性检验结果
实施例3
本实施例中所述的猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌标准样品的制备方法的各个步骤均与实施例2中的相同，不同的技术参数为：菌株培养基选用脑心浸液琼脂斜面培养基；菌悬液配制中，目标菌的浓度按照5×102cfu/ml配制，其他浓度保持不变；冻干过程50h。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。