本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种赤眼蜂科8种赤眼蜂的早期分子检测及鉴定方法，可应用于调查赤眼蜂种类及寄生情况，评价生防效果。
背景技术：
赤眼蜂trichogramma属于膜翅目hymenoptera赤眼蜂科trichogrammatidae，是一种广泛应用于生物防治的寄生性昆虫，能够寄生于鳞翅目lepidoptera、双翅目diptera、膜翅目hymenoptera、鞘翅目coleoptera、半翅目hemiptera、广翅目megaloptera等6个目400多种有害昆虫的卵中，将害虫消灭于卵期，被世界所重视。
目前对于赤眼蜂成虫期的鉴定多采用形态学特征，部分采用分子生物学特征；但由于无法对非成虫期的赤眼蜂进行形态区分，因此对于非成虫期的鉴定，尚未见文献报道。
长期以来，田间赤眼蜂寄生率的调查，均采用田间采集寄主卵，室内饲养至成虫羽化，然后根据形态学进行鉴定，统计寄生率，评价防治效果。对于寄主卵内的赤眼蜂卵或幼虫，现有的技术中，因未找到合适的分子标记及引物，所以未进行非成虫期鉴定。若将赤眼蜂卵和幼虫饲养至成虫期鉴定，需要耗费较长时间，因此迫切需要一种新的方法来弥补传统调查方法的不足。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明提供一种赤眼蜂科8种赤眼蜂的早期分子检测及鉴定方法，通过分子生物学方法获取赤眼蜂的coi基因(mtdna的细胞色素氧化酶i)，以pcr技术为基础，设计特异性引物对待检测的寄主卵内赤眼蜂的coi基因进行扩增，将扩增出赤眼蜂coi基因片段的pcr产物作为模板，分别利用特异性内切酶sspi、vspi进行酶切，根据酶切产物电泳条带的不同，与8种赤眼蜂的标准带谱进行对比，实现对待检测的寄主卵中寄生的赤眼蜂种类的判断；
一种赤眼蜂科8种赤眼蜂的早期分子检测及鉴定方法，所述方法具体包括如下步骤：
s1：提取待检测的寄主卵内赤眼蜂dna；
s2：以s1所得dna为模板，对赤眼蜂coi基因进行pcr扩增，得到赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物，所述赤眼蜂coi基因特异性引物为：
正向引物td-6-f：5’tttatctcatagrggwccaagagt3’(seqidno.1)；
其中，r＝a或g；w＝a或t；
反向引物td-3-r：5’agaatcaggataatcagatattcg3’(seqidno.2)；
s3：以s2获得的赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物为模板，分为两组，分别采用限制性内切酶sspi、vspi进行酶切，获得sspi酶切产物和vspi酶切产物；
s4：将s3所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果(可用dnaman7.0软件)，估算待检测样品各电泳条带大小，将电泳图中的电泳条带数量及条带大小的估算值与下表所示8种赤眼蜂的标准带谱进行对比，查找到电泳条带数量及大小均与标准谱带匹配的，该标准谱带所代表的种类即为待检测样品的种类：
进一步的，所述s1中，寄主卵内赤眼蜂dna的提取方法为常规提取方法，进一步的，采用promega公司的
进一步的，所述s2中，pcr反应体系为25μl，包括：9.5μl无核酸酶水，12.5μl2xhiefftmpcrmastermix(withdye)，0.5μltd-6-f，0.5μltd-3-r，2μldna，pcr反应条件如下：95℃预变性3min，然后进入如下循环：95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，循环35次，循环结束后72℃再延伸7min，得到赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物。
进一步的，所述s3中，限制性内切酶sspi和vspi酶切反应体系均为30μl，sspi酶切反应体系包括：3μlsspi，2μl10×fastdigestgreenbuffer，15μl无核酸酶水，10μls2得到的赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物；vspi酶切反应体系包括：3μlvspi，2μl10×fastdigestgreenbuffer，15μl无核酸酶水，10μls2得到的赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物；充分混匀离心后放入pcr仪，反应条件：37℃孵化5min，65℃灭活5min。
进一步的，所述s4中，sspi酶切产物和vspi酶切产物的琼脂糖凝胶电泳方法为，分别取10μlsspi酶切产物或10μlvspi酶切产物，2μlmarker，在3％(g/ml)的琼脂糖凝胶上放置在1×tae缓冲液中进行电泳检测，电泳条件为：电压110v，电流400ma，电泳时间为40min。
前述的一种赤眼蜂科8种赤眼蜂的早期分子检测及鉴定方法在利用赤眼蜂进行农业害虫生物防治研究中的应用。利用本发明的方法，可以调查赤眼蜂种类及寄生情况，快速了解寄生目标昆虫的赤眼蜂的种类，对预测田间释放赤眼蜂后的生物防治效果提供依据。在生物防治目标害虫时，可根据各种赤眼蜂对不同昆虫的寄生偏好，针对性的对目标昆虫释放对其偏好的赤眼蜂种类。
进一步的，所述农业害虫为鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目、广翅目。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
1)本发明从分子生物学基本理论出发，首次建立了赤眼蜂科8种赤眼蜂的早期分子检测及鉴定方法，可以直接利用田间采集到的寄主卵，根据本发明提供的八种赤眼蜂的酶切图谱进行早期分子鉴定，可直观、准确地鉴定到寄主卵内寄生的赤眼蜂蜂种，解决了传统形态学方法不能对非成虫期赤眼蜂进行鉴定的难题，且适用范围广。
2)本发明提供一对用于鉴定赤眼蜂的coi序列扩增引物，特异性高，只扩增出赤眼蜂的coi序列分子标记，而不会扩增出寄主的分子标记，利用该引物进行鉴定，操作简单、检测快速，后续步骤中仅仅需要以赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物为模板，进行特异性内切酶酶切、电泳，即可有效鉴别。
3)本发明采用sspi、vspi两种内切酶对pcr产物分别酶切，将酶切结果分别与8种赤眼蜂的sspi标准带谱和vspi标准带谱对比，方法直观、简洁明了。
4)本发明提供的检测和鉴定方法对仪器设备要求低，相比形态学方法可靠性高，相对于pcr测序鉴定物种的方法更加经济、快速、节约成本。
5)本发明提供的检测方法可以为利用赤眼蜂对农业害虫进行生物防治提供指导，有利于提高利用不同种赤眼蜂对不同种靶标害虫进行生物防治的针对性。
附图说明
图1为幼虫期的8种赤眼蜂coi序列酶切鉴定电泳标准图谱
(a)sspi酶切鉴定电泳标准图谱；(b)vspi酶切鉴定电泳标准图谱。
m:marker1.玉米螟赤眼蜂t.ostriniae；2.稻螟赤眼蜂t.japonicum；
3.广赤眼蜂t.evanescens；4.松毛虫赤眼蜂t.dendrolimi；5.螟黄赤眼蜂t.chilonis；
6.卷叶蛾赤眼蜂t.cacoeciae；7.甘蓝夜蛾赤眼蜂t.brassicae；8.碧岭赤眼蜂t.bilingensis
具体实施方式
实施例1确定8种赤眼蜂的酶切sspi标准带谱和vspi酶切标准带谱
1赤眼蜂样本
8种赤眼蜂，包括甘蓝夜蛾赤眼蜂(trichogrammabrassicae)，卷叶蛾赤眼蜂(t.cacoeciae)，螟黄赤眼蜂(t.chilonis)，广赤眼蜂(t.evanescens)，稻螟赤眼蜂(t.japonicum)，玉米螟赤眼蜂(t.ostriniae)，碧岭赤眼蜂(t.bilingensis)与松毛虫赤眼蜂(t.dendrolimi)。
2供试寄主
米蛾卵。
3卵卡的制作
取新鲜的，大小形状相近，饱满度好的米蛾卵，用胶水将单粒的米蛾卵粘贴在坐标纸上制作卵卡(3cm×2cm)，一张卵卡上等距(0.4cm)粘贴20粒卵，粘贴程度为易剥不易掉。将制好的卵卡放在玻璃试管(规格为10cm×3cm)内。同时，在试管内放入1cm×1cm的滤纸块滴上两滴蒸馏水保湿，用包裹着纱布的脱脂棉塞封住玻璃试管口。
4寄生寄主卵
将制作好的新鲜米蛾卵卡分为8组，分别为甘蓝夜蛾赤眼蜂组、卷叶蛾赤眼蜂组、螟黄赤眼蜂组、广赤眼蜂组、稻螟赤眼蜂组、玉米螟赤眼蜂组、碧岭赤眼蜂组与松毛虫赤眼蜂组。各组分别采用相应种类的赤眼蜂按蜂卵比1:10接蜂15min，将接蜂后的卵卡置于玻璃试管(规格为10cm×3cm)内，放入1cm×1cm的滤纸块滴上两滴蒸馏水保湿，用包裹着纱布的脱脂棉塞封住玻璃试管口。接蜂60h后，取寄生后的米蛾卵进行dna的提取。
5dna的提取
各组米蛾卵内赤眼蜂dna的提取均是采用promega公司的
(1)配置mix，作为提取dna的缓冲液。缓冲液的体系为275μl，包括nucleilysissolution(200μl)，0.5medta(ph8.0)(50μl)，proteinasek(20mg/ml)(20μl)，rnaseasolution(4mg/ml)(5μl)。
(2)用解剖针沾取mix将含有未羽化赤眼蜂的寄主卵/未被寄生寄主卵转移到1.5ml的离心管中，用移液器(gilson、eppendorf)加入50μlmix并用塑料研磨棒进行研磨。
(3)研磨充分后，吸取225μlmix冲洗研磨棒。
(4)漩涡混匀，并进行简单的离心，将样品放置在提前设定好温度(55℃)的水浴锅中进行孵育，孵育16-18h。
(5)孵育后，在每个样品中加入250ml
(6)混匀后，取全部液体转移到minicolumassembly，放入离心机(德国eppendorf)中离心(4333g/min)。
(7)离心后，取出过滤管，倒掉收集管中的液体，再将过滤管重新放回收集管，加入500μlwashsolution，再将收集管放入离心机中离心(13000g/min)。该步骤重复4次。
(8)离心后，取出过滤管，倒掉收集管中的液体，再将过滤管重新放回收集管，直接放入离心机中离心(6500g/min)。
(9)离心后，取下过滤管放置到剪去盖的新的1.5ml离心管中，在室温条件下放置10min。
(10)加入70μl65℃的无核酸酶水。在室温条件下，放置2min后，放入离心机中离心(13000g/min)。
(11)离心后，丢掉过滤管，离心管中得到的液体即为样品的dna，将提取的dna转移到pcr管，编号(种+数字)，置于-20℃的冰箱(siemens)中保存备用。
6pcr扩增和测序
6.1pcr引物序列
本实验基于昆虫mtdna的细胞色素氧化酶i(coi)基因选用了一对引物，以松毛虫赤眼蜂的coi全长，结合稻螟赤眼蜂与玉米螟赤眼蜂的coi全长为基础，通过primerpremier6软件(primer,usa)设计引物(表1)，只扩增出赤眼蜂的coi序列。
表1用于本实验的pcr引物
其中，r＝a或g；w＝a或t；
6.2pcr扩增反应体系及条件
分别用上述引物对提取的样品dna进行coi基因的扩增。本实例的扩增体系为25μl，pcr反应体系如表2所示。
表2pcr反应体系
pcr反应条件如下：
95℃预变性3min，然后进入如下循环：95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，循环35次，循环结束后72℃再延伸7min。
将所得的pcr产物用于酶切或者用于电泳检测。以2kbmarker作为对照，取5μl扩增产物及marker在1％(g/ml)的琼脂糖凝胶上放置在1×tae缓冲液中进行电泳检测，电泳条件为：电压140v，电流400ma，电泳时间为20min。用凝胶成像仪(美国bio-rad)对电泳结果进行拍照留存并记录结果。
6.3测序
将扩增出的coi基因片段的pcr产物送至南京擎科生物科技有限公司进行测序。
7限制性内切酶的选择及反应体系与条件
将6.3获得的序列导入dnaman7.0中，进行酶切位点的分析，筛选出所需的限制性内切酶为sspi和vspi(thermofisherscientificinc.,usa)，用于后续的酶切反应。
将扩增出的coi基因片段的pcr产物作为模板进行酶切。酶切反应体系为30μl，pcr反应体系分别如表3、4所示。
表3pcr反应体系
表4pcr反应体系
充分混匀离心后放入普通pcr仪(美国appliedbiosystems)中。
反应条件：37℃孵化5min，65℃灭活5min。
将所得的酶切产物进行电泳检测。以2kbmarker作为对照，取10μl酶切产物及2μlmarker在3％(g/ml)的琼脂糖凝胶上放置在1×tae缓冲液中进行电泳检测，电泳条件为：电压110v，电流400ma，电泳时间为40min。用凝胶成像仪对电泳结果进行拍照留存并记录结果，得到8种赤眼蜂的sspi酶切标准带谱和vspi酶切标准带谱(图1)，dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，8种赤眼蜂的sspi酶切标准带谱和vspi酶切标准带谱的电泳条带数量及大小如表5所示。
表58种赤眼蜂的coi基因片段酶切带谱信息
实施例2玉米螟赤眼蜂的检测验证
待检测的寄主卵为亚洲玉米螟卵，寄生赤眼蜂为玉米螟赤眼蜂t.ostriniae。
取待检测的亚洲玉米螟卵内赤眼蜂dna。dna提取采用promega公司的
(1)配置mix，作为提取dna的缓冲液。缓冲液的体系为275μl，包括nucleilysissolution(200μl)，0.5medta(ph8.0)(50μl)，proteinasek(20mg/ml)(20μl)，rnaseasolution(4mg/ml)(5μl)。
(2)用解剖针沾取mix将含有未羽化赤眼蜂的寄主卵/未被寄生寄主卵转移到1.5ml的离心管中，用移液器(gilson、eppendorf)加入50μlmix并用塑料研磨棒进行研磨。
(3)研磨充分后，吸取225μlmix冲洗研磨棒。
(4)漩涡混匀，并进行简单的离心，将样品放置在提前设定好温度(55℃)的水浴锅(memmert)中进行孵育，孵育16-18h。
(5)孵育后，在每个样品中加入250ml
(6)混匀后，取全部液体转移到minicolumassembly，放入离心机(德国eppendorf)中离心(4333g/min)。
(7)离心后，取出过滤管，倒掉收集管中的液体，再将过滤管重新放回收集管，加入500μlwashsolution，再将收集管放入离心机中离心(13000g/min)。该步骤重复4次。
(8)离心后，取出过滤管，倒掉收集管中的液体，再将过滤管重新放回收集管，直接放入离心机中离心(6500g/min)。
(9)离心后，取下过滤管放置到剪去盖的新的1.5ml离心管中，在室温条件下放置10min。
(10)加入70μl65℃的无核酸酶水。在室温条件下，放置2min后，放入离心机中离心(13000g/min)。
(11)离心后，丢掉过滤管，离心管中得到的液体即为样品的dna，将提取的dna转移到pcr管，编号(种+数字)，置于-20℃的冰箱(siemens)中保存备用。
以上述所得样品dna为模板，用seqidno.1、seqidno.2所述赤眼蜂coi基因特异性引物对赤眼蜂coi基因进行pcr扩增，pcr反应体系为25μl，包括：9.5μl无核酸酶水，12.5μl2xhiefftmpcrmastermix(withdye)，0.5μltd-6-f，0.5μltd-3-r，2μldna，pcr反应条件如下：95℃预变性3min，然后进入如下循环：95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，循环35次，循环结束后72℃再延伸7min，得到赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物。
将以上获得的赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物为模板，分为a、b两组，a组采用限制性内切酶sspi进行酶切，b组vspi采用限制性内切酶进行酶切，sspi酶切反应体系包括：3μlsspi，2μl10×fastdigestgreenbuffer，15μl无核酸酶水，10μls2得到的赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物；vspi酶切反应体系包括：3μlvspi，2μl10×fastdigestgreenbuffer，15μl无核酸酶水，10μls2得到的赤眼蜂coi基因片段的pcr扩增产物；充分混匀离心后放入pcr仪，反应条件：37℃孵化5min，65℃灭活5min。
a组获得sspi酶切产物，b组获得vspi酶切产物；将所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。以2kbmarker作为对照，取10μlsspi酶切产物，10μlvspi酶切产物及2μlmarker在3％(g/ml)的琼脂糖凝胶上放置在1×tae缓冲液中进行电泳检测，电泳条件为：电压110v，电流400ma，电泳时间为40min。用凝胶成像仪对电泳结果进行拍照留存并记录结果。
dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，得到sspi酶切下的4条带估算值，分别为213bp、599bp、28bp和88bp，vspi酶切下的4条带估算值，分别为81bp、47bp、219bp和581bp，查找到条带数量及大小均与玉米螟赤眼蜂t.ostriniae的标准谱带匹配，证实检测正确。
实施例3稻螟赤眼蜂的检测验证
待检测的寄主卵为棉铃虫卵，寄生赤眼蜂为稻螟赤眼蜂t.japonicum。
其他操作与实施例2相同。
所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，sspi酶切下的3条带估算值，分别为812bp、28bp、和88bp，vspi酶切下的1条带估算值，为928bp，查找到条带数量及大小均与稻螟赤眼蜂t.japonicum的标准谱带匹配，证实检测正确。
实施例4广赤眼蜂的检测验证
待检测的寄主卵为稻纵卷叶螟卵，寄生赤眼蜂为广赤眼蜂t.evanescens。
其他操作与实施例2相同。
所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，sspi酶切下的2条带估算值，分别为812bp和116bp，vspi酶切下的3条带估算值，分别为81bp、47bp和800bp，查找到条带数量及大小均与广赤眼蜂t.evanescens的标准谱带匹配，证实检测正确。
实施例5松毛虫赤眼蜂的检测验证
待检测的寄主卵为稻纵卷叶螟卵，寄生赤眼蜂为松毛虫赤眼蜂t.dendrolimi。
其他操作与实施例2相同。
所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，sspi酶切下的5条带估算值，分别为153bp、60bp、599bp、28bp和88bp，vspi酶切下的4条带估算值，分别为81bp、47bp、219bp和581bp，查找到条带数量及大小均与松毛虫赤眼蜂t.dendrolimi的标准谱带匹配，证实检测正确。
实施例6螟黄赤眼蜂的检测验证
待检测的寄主卵为稻纵卷叶螟卵，寄生赤眼蜂为螟黄赤眼蜂t.chilonis。
其他操作与实施例2相同。
所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，sspi酶切下的3条带估算值，分别为812bp、28bp和88bp，vspi酶切下的3条带估算值，分别为81bp、47bp和800bp，查找到条带数量及大小均与螟黄赤眼蜂t.chilonis的标准谱带匹配，证实检测正确。
实施例7卷叶蛾赤眼蜂的检测验证
待检测的寄主卵为稻纵卷叶螟卵，寄生赤眼蜂为卷叶蛾赤眼蜂t.cacoeciae。
其他操作与实施例2相同。
所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，sspi酶切下的3条带估算值，分别为812bp、28bp和88bp，vspi酶切下的2条带估算值，分别为81bp和847bp，查找到条带数量及大小均与卷叶蛾赤眼蜂t.cacoeciae的标准谱带匹配，证实检测正确。
实施例8甘蓝夜蛾赤眼蜂的检测验证
待检测的寄主卵为稻纵卷叶螟卵，寄生赤眼蜂为甘蓝夜蛾赤眼蜂t.brassicae。
其他操作与实施例2相同。
所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，vspi酶切下的2条带估算值，分别为840bp和88bp，vspi酶切下的4条带估算值，分别为81bp、47bp、219bp和581bp，查找到条带数量及大小均与甘蓝夜蛾赤眼蜂t.brassicae的标准谱带匹配，证实检测正确。
实施例9碧岭赤眼蜂的检测验证
待检测的寄主卵为稻纵卷叶螟卵，寄生赤眼蜂为碧岭赤眼蜂t.bilingensis。
其他操作与实施例2相同。
所得的sspi酶切产物和vspi酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，dnaman7.0软件对电泳结果进行分析，vspi酶切下的3条带估算值，分别为812bp、28bp和88bp，vspi酶切下的4条带估算值，分别为81bp、47bp、219bp和581bp，查找到条带数量及大小均与碧岭赤眼蜂t.bilingensis的标准谱带匹配，证实检测正确。
相对于赤眼蜂成虫期形态学鉴定，早期分子鉴定方法，将pcr技术和限制酶切技术结合使用，用限制酶酶切目的基因的pcr扩增产物，通过对电泳检测所得的八种赤眼蜂的不同酶切图谱(图1)，可快速准确地鉴定相应的赤眼蜂蜂种，极大地缩小形态学鉴定所消耗的时间，并克服了无法利用形态对非成虫期赤眼蜂进行鉴定的不足，准确、快速、节约成本。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种赤眼蜂科8种赤眼蜂的早期分子检测及鉴定方法及应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tttatctcatagrggwccaagagt24
<210>2
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
agaatcaggataatcagatattcg24