本发明涉及十二碳二元酸产品及其制备方法，特别涉及发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法。
背景技术：
长链二元酸有着非常广泛的用途，以长链二元酸为原料可以合成特种尼龙、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等，其结构式为hooc(ch2)ncooh，其中n为大于7的整数。长链二元酸通常可以用化学法或生物法来合成。化学法合成路线长，反应需要高温高压，对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。而生物法是以长链烷烃等为底物，通过微生物转化得到，利用微生物双末端氧化的特殊功能发酵正构烷烃制取长链二元酸。由微生物氧化烷烃生成长链二元酸的机理研究可知，其主反应为α,ω-氧化反应，发生在微粒体和细胞基质，催化正构烷烃的双末端氧化，得到主产物长链二元酸；副反应之一为脂肪酸合成途径，在微生物中，脂肪酸合成酶系是一种由1分子脂酰基载体蛋白(acp)和7种酶单体所构成的多酶复合体；在脂酸合成酶系内各种酶的催化下，依次进行酰基转移、缩合、还原、脱水、再还原等连续反应，每次循环脂酸骨架增加2个碳原子，①乙酰基转移：由乙酰转移酶催化生成乙酰-半胱-e1，②丙二酰基转移：生成丙二酰-泛-e2，③缩合反应：β-酮丁酰-泛-e2的生成，同时有co2脱落，④第一次还原反应(加氢)：β-羟丁酰-泛-e2的生成，⑤脱水反应：α,β-烯丁酰-泛-e2的生成，⑥第二次还原反应(加氢)：丁酰-泛-e2的生成，丁酰-泛-e2是第一轮产物,经酰基转移、缩合、还原、脱水、再还原，碳原子增加2个。在十二碳二元酸的合成过程中，有部分脂肪酸通过脂肪酸合成途径合成十四碳二元酸，过量的十四碳二元酸会影响十二碳二元酸的纯度和质量。
技术实现要素：
本发明的第一方面目的在于提供一种发酵法生产的十二碳二元酸产品，该发酵法生产的十二碳二元酸产品中十四碳二元酸杂质含量非常低，以解决目前发酵法生产的十二碳二元酸产品中十四碳二元酸杂质含量高，影响后续应用的技术问题。
一种发酵法生产的十二碳二元酸产品，其中十四碳二元酸杂质含量低于或等于0.15wt％；优选地，低于或等于0.1wt％；所述十四碳二元酸杂质含量是所述十四碳二元酸占所述发酵法生产的十二碳二元酸产品的质量百分数。
本发明的第二方面目的在于提供上述十二碳二元酸产品的发酵生产方法，该发酵生产方法的发酵过程能抑制十四碳二元酸的生成，经分离纯化后能得到十四碳二元酸杂质含量非常低的十二碳二元酸产品。
一种如上文所述的十二碳二元酸产品的发酵生产方法，包括发酵过程，所述发酵过程通过热带假丝酵母(candidatropicalis)或清酒假丝酵母(candidasake)利用发酵培养基发酵，将底物转化为十二碳二元酸，所述底物包括或者是十二碳正构烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；在所述发酵过程中控制所述底物浓度低于5％(v/v)，优选低于2％(v/v)；进一步，在所述发酵过程的转化期控制所述底物浓度低于5％(v/v)，优选低于2％(v/v)，所述底物浓度是指所述底物占发酵液的体积百分比浓度。
在上述技术方案的基础上进一步，所述发酵过程控制温度28～32℃，通风比为0.3～0.7vvm，罐压(表压)为0.05～0.14mpa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％，优选10％～70％，更优选40％～70％；发酵起始ph为5.0-7.0，待稀释30倍后菌体光密度od620大于0.5时，进入转化期开始批次加入所述底物，控制ph为5.0-8.0,。
或者，在上述技术方案的基础上进一步，所述发酵过程包括以下步骤：
将种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为4～6l，接种量10％～30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加0～10％(v/v，相对发酵起始体积)的所述底物，所述发酵过程控制温度为28～32℃，通风比为0.3～0.7vvm，罐压(表压)为0.05～0.14mpa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％，优选10％～70％，更优选40％～70％；发酵起始ph为5.0-7.0，待菌体光密度(od620)大于0.5(稀释30倍)时，进入转化期开始批次加入所述底物，控制ph为5.0-8.0,控制发酵液中烷烃含量不超过5％(v/v)，优选不超过2％(v/v)，总发酵周期约为100～180小时。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述的一种十二碳二元酸产品的发酵生产方法，其中，还包括获得种子液的过程，所述获得种子液的过程包括以下步骤：
取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％～30％(v/v)，接种后发酵体系的起始ph值为6.0～6.8，28～32℃下，通风比0.3～0.7vvm，罐压0.05～0.14mpa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的do大于等于10％，优选10％～70％，更优选40％～70％，培养15～30h；
优选地，菌体在种子罐中培养，培养成熟种子的标准为稀释30倍后菌体光密度od620为0.5～1.0。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述的十二碳二元酸产品的发酵生产方法，其中，还包括菌种活化的过程，所述菌种活化的过程包括以下步骤：
取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有ypd培养基的种子瓶中，ph自然，28～32℃下，200～250rpm摇床培养1～2天。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述发酵培养基或所述种子培养基包括：
优选地，所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、阿拉伯糖、鼠李糖、甲醇和乙醇中的一种或多种；
优选地，所述氮源包括或者是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种；
优选地，所述磷源包括或者是磷酸正盐、磷酸一氢盐和磷酸二氢盐中的一种或多种；更优选地，包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种；
优选地，所述微量金属元素源包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种；更优选地，所述微量金属元素源包括或者是氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁和硫酸铜中的一种或多种；
优选地，所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种；更优选地，所述生长因子包括或者是维生素b1、维生素b2、维生素c和生物素中的一种或多种。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述种子培养基是一种水溶液培养基，包含如下成分：蔗糖10-30g/l，玉米浆液1.5-10g/l，酵母提取液1-10g/l，kh2po44-12g/l，尿素0.5-5g/l，底物0-30ml/l。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述发酵培养基是一种水溶液培养基，包含如下成分：葡萄糖10～50g/l、硝酸钾0.2～6g/l、磷酸二氢钾0.2～6g/l、硫酸铵0.5～3g/l以及硫酸镁0.5～3g/l。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述的十二碳二元酸产品的发酵生产方法，其中，还包括分离纯化过程，所述分离纯化过程包括以下步骤：
将十二碳二元酸发酵液酸化，得固形物和发酵处理液，分离得所述固形物，再将所述固形物溶解在有机溶剂中，分离得清液，将所述清液结晶，得十二碳二元酸产品；
优选地，所述酸化的ph值为2.5～5，优选为3～4；
和/或，所述固形物包括长链二元酸颗粒；或者，所述固形物包括长链二元酸颗粒和菌体；
和/或，所述分离的方法为离心或过滤；
和/或，所述有机溶剂包括或者是醇、酸、酮和酯中的一种多种；其中，所述醇包括或者是甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种；所述酸包括或者是乙酸；所述酮包括或者是丙酮；所述酯包括或者是乙酸乙酯和/或乙酸丁酯；
和/或，所述固形物溶解在有机溶剂后，脱色，再分离得清液，所述脱色的方法优选活性炭脱色；所述活性炭的添加量为不超过溶液体积的5％；所述脱色的温度为85～100℃；所述脱色的时间为15～165min；
和/或，所述结晶为降温结晶；所述降温结晶包括以下步骤：降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶；
和/或，所述结晶后，分离出晶体，由此得到长链二元酸；所述分离的方法为离心分离。
本发明的第三方面提出了一种十二碳二元酸发酵液，一种十二碳二元酸发酵液，所述十二碳二元酸发酵液中十四碳二元酸与十二碳二元酸的质量比低于0.8％；优选地，低于0.6％，更优选地，低于0.4％。因为十二碳二元酸发酵液中十四碳二元酸含量低，分离纯化得到十二碳二元酸产品后，从母液中继续回收残余的十二碳二元酸，纯度会更高。
本发明的第四方面提出了一种聚合物，一种包含上文所述的发酵法生产的十二碳二元酸产品作为聚合单体的聚合物，优选为聚酰胺或聚酯。
在上述技术方案的基础上进一步，所述聚合物为由所述发酵法生产的十二碳二元酸产品与c5～c12脂肪胺聚合所得的聚酰胺；所述脂肪胺优选为戊二胺、己二胺或癸二胺。
所披露的十二碳二元酸产品通过微生物发酵法制得，通过披露的制备方法，可得到纯度更高、杂质含量尤其是十四碳二元酸杂质含量更低的十二碳二元酸产品。高纯度、低十四碳二元酸杂质含量的十二碳二元酸产品满足高档聚酰胺、聚酯等产品的质量要求，所得的聚合物产品性能更加优异。而且，本发明提供的十二碳二元酸产品制备方法条件温和、环境友好、产品转化率高且品质好，可以替代化学法用于十二碳二元酸产品的工业化规模生产。
具体实施方式
本发明中测定发酵液中的二元酸浓度，可以采用本领域技术人员熟知的技术，例如气相色谱检测法，分别检测十二碳二元酸和十四碳二元酸，详情如下：
发酵液经前处理后气相色谱检测(内标法)，色谱条件：色谱柱：supelcospb-5030m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。气相色谱仪(shimadzu，gc-2014)。
方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，fid温度280℃，进样量4μl。
根据产物峰面积和已知浓度的内标峰面积比进行产物浓度计算，根据产物峰面积和杂质峰面积计算杂质含量。
最终获得的十二碳二元酸产品中十二碳二元酸和十四碳二元酸的含量的测定，也可以采用本领域技术人员熟知的技术，例如气相色谱检测法，具体步骤如下：
样品经前处理后气相色谱检测(归一法)，色谱条件：色谱柱：supelcospb-5030m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。气相色谱仪(shimadzu，gc-2014)。
方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，fid温度280℃，进样量4μl。
根据产物峰面积和杂质峰面积计算产物纯度和杂质含量。
本案发明人发现，在所述发酵过程中控制所述底物浓度为0-5％，优选地，在所述发酵过程的转化期控制所述底物浓度为0-2％，能有效降低发酵液中十四碳二元酸和十二碳二元酸的比例，进而有效降低十二碳二元酸产品中十四碳二元酸的含量，将十二碳二元酸产品中的十四碳二元酸含量控制在现有技术达不到的范围内。本案发明人推测，可能底物浓度对于合成十四碳二元酸的路径影响远远大于合成十二碳二元酸路径的影响。
因此，本具体实施方式得到了一种发酵法生产的十二碳二元酸产品，其中十四碳二元酸杂质含量低于或等于0.15wt％；优选地，低于或等于0.1wt％；所述十四碳二元酸杂质含量是所述十四碳二元酸占所述发酵法生产的十二碳二元酸产品的质量百分数。
在一个优选的具体实施方式中，所述发酵的菌种是热带假丝酵母(candidatropicalis)或清酒假丝酵母(candidasake)。本具体实施方式采用的热带假丝酵母和清酒假丝酵母均保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，并且在本申请前已在专利公报中公布，具体情况如下：
在一个优选的具体实施方式中，所述十二碳二元酸产品的发酵生产方法包括以下过程：
1、获得活化菌种：
在一个优选的具体实施方式中，获得活化菌种的过程包括取假丝酵母(热带假丝酵母catn145，下同)的甘油管菌种接种于装有ypd培养基的种子瓶中，ph自然，28～32℃下，200～250rpm摇床培养1～2天。
ypd培养基包括：20g/l葡萄糖，10g/l酵母浸粉，20g/l蛋白胨。ph7.0-7.5。
2、获得种子液：
在一个优选的具体实施方式中，获得种子液的过程包括取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量10％～30％(v/v)，接种后起始ph值为6.0～6.8，28～32℃下，通风比0.3～0.7vvm，罐压0.05～0.14mpa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的溶解氧大于等于10％，优选10％～70％，更优选40％～70％，培养15～30h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后菌体光密度od620为0.5～1.0。
在一个优选的具体实施方式中，种子培养基包括：10-30g/l蔗糖，1.5-10g/l玉米浆液，1-10g/l酵母提取液，4-12g/lkh2po4，0.5-5g/l尿素。所述培养基用水制备，并在121℃下灭菌20min。尿素单独灭菌，110℃下灭菌15min，冷却后与灭过菌的其他成分混合，作为种子培养基使用。
3、发酵：
在一个优选的具体实施方式中，所述发酵过程包括：将种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为4～6l，接种量10％～30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加0～10％(v/v，相对发酵起始体积)的所述底物，所述发酵过程控制温度为28～32℃，通风比为0.3～0.7vvm，罐压(表压)为0.05～0.14mpa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％，优选10％～70％，更优选40％～70％；发酵起始ph为5.0-7.0，待菌体光密度(od620)大于0.5(稀释30倍)时，开始批次加入所述底物，控制ph为5.0-8.0,进入转化期，控制发酵液中底物含量不超过5％(v/v)，优选不超过2％(v/v)，所述底物浓度是指所述底物占发酵液的体积百分比浓度，总发酵周期约为100～180小时。
在一个优选的具体实施方式中，所述发酵转化期是发酵接种后菌体培养至od620(稀释30倍后)0.5～1.0起至发酵结束。
在一个优选的具体实施方式中，底物包括或者是c12的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中，所述发酵培养基包括：碳源，10～60g/l；氮源，1～10g/l；磷源，1～10g/l；一种或多种微量金属元素源，每种均为0～50ppm；一种或多种生长因子，每种均为0～1ppm。
在一个优选的具体实施方式中，所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、阿拉伯糖、鼠李糖、甲醇和乙醇中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中，所述氮源包括或者是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中，所述磷源包括或者是磷酸正盐、磷酸一氢盐和磷酸二氢盐中的一种或多种；优选包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中，所述微量金属元素源包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种；优选地，所述微量金属元素源包括或者是氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁和硫酸铜中的一种或多种。
在一个优选的具体实施方式中，所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种；优选地，所述生长因子包括或者是维生素b1、维生素b2、维生素c和生物素中的一种或多种。
4、分离纯化：
在一个优选的具体实施方式中，将十二碳二元酸发酵液酸化，得固形物和发酵处理液，分离得所述固形物，再将所述固形物溶解在有机溶剂中，分离得清液，将所述清液结晶，得十二碳二元酸产品；
优选地，所述酸化的ph值为2.5～5，优选为3～4；
和/或，所述固形物包括长链二元酸颗粒；或者，所述固形物包括长链二元酸颗粒和菌体；
和/或，所述分离的方法为离心或过滤；
和/或，所述有机溶剂包括或者是醇、酸、酮和酯中的一种多种；其中，所述醇包括或者是甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种；所述酸包括或者是乙酸；所述酮包括或者是丙酮；所述酯包括或者是乙酸乙酯和/或乙酸丁酯；
和/或，所述固形物溶解在有机溶剂后，脱色，再分离得清液，所述脱色的方法优选活性炭脱色；所述活性炭的添加量为不超过溶液体积的5％；所述脱色的温度为85～100℃；所述脱色的时间为15～165min；
和/或，所述结晶为降温结晶；所述降温结晶包括以下步骤：降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶；
和/或，所述结晶后，分离出晶体，由此得到长链二元酸；所述分离的方法为离心分离。
下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。
如没有特别说明，本发明所述的浓度均为质量百分比浓度。
实施例1
取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有ypd培养基的种子瓶中，ph自然，28℃下，200rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，种子培养基包括：10g/l蔗糖，10g/l玉米浆液<总氮含量2.5wt％，下同>，1g/l酵母提取液(<购自英格兰oxoidltd.>，下同)，12g/lkh2po4，5g/l尿素，接种量为10％，接种后发酵体系的起始ph值为6.0，28℃下，通风量0.3vvm，罐压0.10mpa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的do不低于10％，培养30h。菌体在种子罐中培养，培养成熟种子的标准为稀释30倍后od620大于0.5。将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：葡萄糖60g/l；硫酸铵1g/l，尿素3g/l；磷酸二氢钾10g/l。接种后起始体积为4l，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵过程控制温度28℃，通风量为0.5vvm，罐压(表压)为0.10mpa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。补加10％的液碱控制发酵液的ph值；发酵起始ph为6.0，待菌体光密度(od620)大于0.5(稀释30倍)时，控制ph5.5，批次加入十二碳正构烷烃((本实施例使用的底物正十二烷烃，正十二烷烃含量在99％以上，且无法检出正十四碳烷烃，以下实施例同))，控制发酵液中烷烃含量不超过2％(v/v)，直至发酵结束。总发酵周期约为100h，产生十二碳二元酸142mg/g，发酵液中十四碳二元酸与十二碳二元酸的质量比为0.49％。将发酵液用硫酸调节ph至ph3，进行酸化，得固形物和发酵处理液，离心分离得固形物，其中，固形物中绝大多数为长链二元酸颗粒；再将固形物溶解在醋酸中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在90℃条件下脱色60min，过滤分离得清液，将清液降温至80℃保温1.5h，再降温至30℃，结晶；离心分离得十二碳二元酸产品，经检测，其中含十四碳二元酸0.15wt％。
实施例2
取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有ypd培养基的种子瓶中，ph自然，32℃下，220rpm摇床培养1天；取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，种子培养基包括：30g/l蔗糖，5g/l玉米浆液，10/l酵母提取液，4g/lkh2po4，0.5g/l尿素，接种量为30％(v/v，相对发酵起始体积)，接种后发酵体系的起始ph值为6.6，30℃下，通风量0.7vvm，罐压0.05mpa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的do不低于40％，培养24h。菌体在种子罐中培养，培养成熟种子的标准为稀释30倍后od620大于1.0。将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：蔗糖10g/l；玉米浆7g/l，酵母膏3g/l；磷酸二氢钾1g/l。接种后起始体积为6l，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加1％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳正构烷烃，发酵过程控制温度30℃，通风量约为0.7vvm，罐压(表压)约为0.05mpa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。补加10％的液碱控制发酵液的ph值；发酵起始ph约为5.0，待菌体光密度(od620)大于0.5(稀释30倍)时，控制ph6.5，批次加入十二碳正构烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过2％(v/v)。总发酵周期约为160h，产生十二碳二元酸149mg/g，发酵液中十四碳二元酸与十二碳二元酸的质量比为为0.46％。将发酵液用硫酸调节ph至ph3.5，进行酸化，得固形物和发酵处理液，离心分离得固形物，其中，固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体；再将固形物溶解在乙醇中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在95℃条件下脱色75min，过滤分离得清液，将清液降温至80℃保温1h，再降温至35℃，结晶；离心分离得十二碳二元酸产品。经检测，其中含十四碳二元酸0.12wt％。
实施例3
取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有ypd培养基的种子瓶中，ph自然，30℃下，250rpm摇床培养1天；取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，种子培养基包括：20g/l蔗糖，1.5g/l玉米浆液，10g/l酵母提取液，8g/lkh2po4，0.5g/l尿素，接种量为20％(v/v，相对发酵起始体积)，接种后发酵体系的起始ph值为6.8，32℃下，通风量0.5vvm，罐压0.14mpa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的do不低于70％，培养15h。在一个优选的方式中，菌体在种子罐中培养，培养成熟种子的标准为稀释30倍后od620大于0.8。将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：葡萄糖30g/l；玉米浆5g/l，硫酸铵3g/l；磷酸二氢钾5g/l。接种后起始体积为4l，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加10％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳正构烷烃，发酵过程控制温度32℃，通风量约为0.3vvm，罐压(表压)约为0.14mpa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。补加10％的液碱控制发酵液的ph值；发酵起始ph约为7.0，待菌体光密度(od620)大于0.5(稀释30倍)时，控制ph8.0，批次加入十二碳正构烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过2％(v/v)，直至发酵结束。总发酵周期约为180h，产生十二碳二元酸134mg/g，发酵液中十四碳二元酸和十二碳二元酸的质量比为0.43％。将发酵液用硫酸调节ph至ph3.2，进行酸化，得固形物和发酵处理液，过滤得固形物，其中，固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体；再将固形物溶解在醋酸中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在85℃条件下脱色70min，过滤分离得清液，将清液降温至65℃保温1h，再降温至35℃，结晶；离心分离得十二碳二元酸产品。经检测，其中含十四碳二元酸0.10wt％。
对比例1
取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有ypd培养基的种子瓶中，ph自然，32℃下，220rpm摇床培养1天；取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，种子培养基包括：30g/l蔗糖，5g/l玉米浆液，10/l酵母提取液，4g/lkh2po4，0.5g/l尿素，接种量为30％(v/v，相对发酵起始体积)，接种后发酵体系的起始ph值为6.6，30℃下，通风量0.7vvm，罐压0.05mpa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的do不低于40％，培养24h。在一个优选的方式中，菌体在种子罐中培养，培养成熟种子的标准为稀释30倍后od620大于1.0。将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：蔗糖10g/l；玉米浆7g/l，酵母膏3g/l；磷酸二氢钾1g/l。接种后起始体积为6l，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加1％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳正构烷烃，发酵过程控制温度30℃，通风量约为0.7vvm，罐压(表压)约为0.05mpa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。补加10％的液碱控制发酵液的ph值；发酵起始ph约为5.0，待菌体光密度(od620)大于0.5(稀释30倍)时，控制ph6.5，批次加入十二碳正构烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％(v/v)。总发酵周期约为154h，产生十二碳二元酸143mg/g，发酵液中十四碳二元酸和十二碳二元酸的质量比为1.26％。将发酵液用硫酸调节ph至ph3.5，进行酸化，得固形物和发酵处理液，离心分离得固形物，其中，固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体；再将固形物溶解在乙醇中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在95℃条件下脱色75min，过滤分离得清液，将清液降温至80℃保温1h，再降温至35℃，结晶；离心分离得十二碳二元酸产品。经检测，其中含十四碳二元酸0.42wt％。