本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有肿瘤治疗功能的免疫细胞及其应用。
背景技术
现今肿瘤、癌症等疾病已成为威胁人类身体健康的重大疾病，是人类死亡的主要原因之一。据统计，2015年全球范围内新增癌症病例1410万，820万人死于癌症，预计未来20年新发病例数将增加70％。由于人口老龄化、不良生活习惯、环境污染和传统手段治愈率较低等因素，我国已成为癌症发病和死亡大国。据全国肿瘤登记中心统计显示，2015年中国癌症新增429.16万例，死亡281.42万例。其中肺癌和胃癌高居发病和死亡前两位。由于诊断不及时和缺乏个体化的治疗方案，癌症治疗的无效率高达75％。
现在对于肿瘤和癌症的治疗方法主要是以放疗、化疗、手术为主，中医疗法也是近年来治疗癌症和肿瘤的新兴的重要手段，在临床上与上述三种疗法联合使用对癌症和肿瘤进行治疗，并在一些癌症和肿瘤的治疗上取得了不错的效果，使人们恢复了健康。但是，目前放疗、化疗、手术和中医疗法都存在一些限制；对于大多数的肿瘤，上述疗法的效果还是不尽理想，因此，临床上急需研究更为有效的治疗方法和手段。
生物疗法作为目前新兴的治疗方法，它能够按照患者身体差异制备治疗药物和治疗方案，与现在的传统疗法相比，具有毒副作用较少，肿瘤针对性和特异性更强等优点，被认为是治疗肿瘤的新希望。
技术实现要素：
针对目前化疗、放疗、手术等治疗手段对于肿瘤和癌症的治疗范围，还受到较大限制，对一些肿瘤的治疗效果也还存在不尽理想的问题，本发明目的在于提供一种具有肿瘤治疗功能的免疫细胞及其应用。
生物疗法作为目前新兴的治疗方法，它能够按照患者身体差异制备治疗药物和治疗方案，与现在的传统疗法相比，具有毒副作用较少，肿瘤针对性和特异性更强等优点，被认为是治疗肿瘤的重要希望，特别是对于一些目前尚无法治愈的恶性肿瘤的方向。近年来，生物疗法当中的免疫细胞治疗得到了快速的发展，并在一些肿瘤的治疗当中取得不错的治疗效果，表明其具有重要的医学价值和广泛的市场前景。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种具有肿瘤治疗功能的免疫细胞及其应用，所述的免疫细胞为细胞毒性t细胞(ctl)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)中的一种。
优选地，所述的免疫细胞为细胞毒性t细胞(ctl)或细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)。
更优选地，所述的免疫细胞为细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)。
优选地，所述的免疫活化因子为白介素18。
优选地，所述的溶瘤腺病毒为人工改造后能够选择性感染并裂解肿瘤细胞的病毒。
更优选地，所述的溶瘤腺病毒为经过基因改造的腺病毒。
优选地，所述的病毒输注方式为将溶瘤腺病毒直接注射在肿瘤病灶所在部位。
优选地，所述的溶瘤腺病毒为将溶瘤腺病毒直接注射在肿瘤病灶所在部位。
优选地，所述的溶瘤腺病毒为能表达免疫活化基因il-18的病毒。
优选地，所述的细胞载体为慢病毒。
一种具有肿瘤治疗功能的免疫细胞的应用：
s1.进行分子克隆，制备质粒、回收dna和对dna进行酶切、连接；
s2.进行腺病毒载体的重组；
s3.构建表达luciferase的慢病毒载体；
s4.病毒制备及滴度测定；
s5.cik细胞培养和细胞杀伤能力检测；
s6.荧光定量pcr检测基因表达；
s7.免疫组化检测组织中腺病毒hexon的表达和免疫酶联吸附检测il-18的表达。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种具有肿瘤治疗功能的免疫细胞及其应用，能够增加免疫细胞在肿瘤组织内的浸润数量，增强免疫细胞的抗肿瘤作用，实现“细胞-病毒-基因”强强联合的治疗效果，对于肝脏肿瘤的治疗具有积极意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
在本实施例中，通过体内外试验研究“病毒-基因”治疗联合免疫细胞治疗的抗肿瘤作用，以及联合的相关机制的抗肿瘤效果；并通过单一治疗组(adcn215-gfp，adcn215-il18，cik)和联合治疗组(adcn215-gfp和cik、adcn215-il18和cik)进行对比，检查以cik细胞作为载体，携带经过白介素18进行过基因改造的溶瘤腺病毒对于肝脏肿瘤的治疗作用和效果。具体如下：
一种具有肿瘤治疗功能的免疫细胞
病毒的制备和滴定度的测定
双调控5型溶瘤腺病毒adcn215-gfp；非复制5型腺病毒ad-egfp1为自行构建保存。慢病毒骨架质粒pcdh-ef1α，购自addgene，慢病毒包装质粒pmd2.g、pmdlg/prre及prsv-rev购于addgene；表达luciferase基因的pgl3-basic质粒来源于promega公司。表达mcherry基因的质粒nanog-2a-mcherry购于addgene。
试验所用细胞株及其来源、培养条件性质
hek293(腺病毒e1区转化的人胚肾细胞株)、hek293t(腺病毒e1区和大t抗原转化的人胚肾细胞株)、plc/prf/5、smmc7721和huh-7(人肝癌细胞系)dmem+10％fbs，贴壁生长
试验方法
1.分子克隆
1.1质粒的制备
1.2质粒dna大量提取:(采用omega试剂盒)
1.3从琼脂糖凝胶中回收dna
1.4酶切与连接
1.4.1质粒dna酶切
分别加入4μl的10×酶切buffer，再加入2ug的dna，先往里加入0.5μl限制性内切酶，随后加入无菌双蒸水补足至40μl体积，混匀，放于温度为37℃的水浴锅内酶切1-4h。
1.4.2dna片段和载体的连接
先加入2μl的10×连接buffer，再加入两个dna片段，先往里加入0.5μl连接酶，随后加入无菌双蒸水至体系为20μl，并混匀，16℃下连接4h。
1.5腺病毒载体重组
1.6表达luciferase的慢病毒载体构建
1.7病毒制备及滴度测定
1.7.1adil18、adcn215-il18、adcn215-gfp腺病毒病毒包装，纯化及滴度鉴定
1)用限制性内切酶pacⅰ线性化病毒质粒。
腺病毒质粒2.5μlpacⅰ0.5μl
lbuffer2.5μlddh2o19.5μl
总体系25μl
37℃水浴2h，酶切产物通过乙醇沉淀回收。
2)hek293细胞中包装病毒。
将回收后片段转染至hek293细胞中，转染使用effectene转染试剂盒，按说明书进行操作。
转染前夜于6孔板中每孔铺入1×106hek293细胞。次日将约1μg的pacⅰ酶线型化后的质粒加人ecbuffer中至总体积150μl，再加入enhancerbuffer8μl，涡旋振荡仪上振荡3s混匀，室温下静置5min。在上述混合物中加入转染试剂effectene25μl，涡旋振荡仪上振荡15s混匀，室温下孵育10min。hek293细胞吸弃上清，加入2ml温浴后的pbs洗涤一次，加入1ml新鲜温浴后的培养基，另加0.5ml培养基于上述质粒-转染试剂混合物中，充分混匀后加到细胞中，在含5％co2，37℃下培养6-18h后更换培养基(2ml含2％fbs的新鲜培养基)。观察细胞生长情况，病毒空斑约在9-14天出现。
4)腺病毒的扩增与纯化及滴度测定
对病毒adcn215-il18，adcn215-gfp，adil8进行扩增，纯化及滴度测定。病毒的大量扩增与纯化将hek293细胞以3×106/dish的密度接种于30-40个10cmdish(10ml含2％fbs的dmem培养基)，待细胞生长至融合度70-80％时，向每个dish中加入合适量的包装好的病毒(约107-108pfu/ml)10μl。观察细胞，感染2-3天后待细胞大部分部病变时，1200rpm离心，弃上清收集细胞。细胞沉淀用2ml密度为1.10g/mlcscl溶液重悬。通过反复冻融5次，破碎细胞。5000rpm离心10min收集破碎后的上清，并将上清用0.45μm的滤膜过滤进一步除去细胞碎片。在beckman超速离心机专用15ml离心管中分别依次铺入2.0ml的1.40g/mlcscl溶液，最上层铺入约5ml的过滤后的病毒上清。22800rpm，4℃下离心2.5h。于当时1.30-1.40g/ml交接界面收集病毒条，用巴斯德管小心地将病毒条带转移至煮沸处理过的透析袋中。在将透析袋放置于透析缓冲液(50g蔗糖，10ml1mph为8.0的tris-hcl液，2ml1mmgcl2溶液定容至1000ml)中，在4℃冰箱里透析过夜，每6h更换一次透析液。24h后收集病毒，分装后置于-80℃冰箱保存待用。
配制不同密度的cscl溶液，并于4℃保存。
5)腺病毒滴度的测定(采用cellbiolabs公司腺病毒病毒检测试剂盒)
1.7.2慢病毒毒包装，纯化及滴度鉴定
1)hek293细胞中包装病毒(磷酸钙转染法包装慢病毒)
a)病毒包装前12h，hek293t细胞以1×107个/瓶的密度铺于75cm2的细胞培养瓶中；
b)病毒包被前2h，更新的换细胞培养液；
c)把30μgpcdh-ef1α-luciferase-2a-mcherry,20μgpgk-gfp；5μgpmdlg/prre；3μgprsv-rev；12μgpmd2.g按比例混合好，加1ml2×hepes混合均匀；
d)将混合溶液逐滴加入1ml0.5mcacl2溶液，反复用移液器吹打混匀；
e)混匀后的混合液于室温放置20min；
f)用移液枪逐滴将混合溶液加入75cm2的细胞培养瓶中，混合均匀；
g)转染5-8h后，弃去原有细胞培养液，加入15ml新的温浴的含dmem培养液(含2％fbs)；
h)转染48h后，收集培养上清，并继续加入15ml新的温浴的含dmem培养液(含2％fbs)；
i)转染72h后，收集培养上清，与48h收集的上清合并，用0.45μm孔径滤膜过滤后保存于-80℃冰箱，用于后续试验。
2)慢病毒的纯化(用试剂盒纯化)
3)慢病毒滴度测定
a)感染前12h将hek293t细胞按2×105每孔培养于24孔培养板中；
b)感染前2h更换培养基，换用含5％fbs的dmem培液继续培养；
c)感染时，每孔加入1μl浓度为16mg/mlpolybrene；
d)将纯化得到的病毒(0.1μl、1μl、10μl)分别加入细胞中。培养72h后利用流式细胞仪检测hek293细胞荧光阳性比例；
e)通过公式计算病毒原液中的病毒有效滴度。
t＝(p×n)/(d×v)
式中：t表示每毫升中的包含的感染单位即病毒的滴度，单位tu/ml；
p表示mcherry阳性细胞的比例；
n表示感染时细胞的数量；
d表示稀释的倍数；
v表示加入的病毒液体积。
1.8cik细胞培养
1.8.1pbmc细胞分离
外周血单个核细胞分离，采用葡聚糖密度梯度分离的方式。
具体步骤为：
1.将采集好的50ml外周血用20ml注射器收集后平均分装至两个50ml无菌管(a、b管)中，分别加入6％hes(羟乙基淀粉)5ml。
2.混匀后静置30min，红细胞和hes结合沉降于离心管底部。
3.将a、b管上部含有白细胞的血浆移至新的离心管(c管)。将a和b管离心(400×g,10min)后,取红细胞上部的少量血浆也加入c管。
4.将离心管c以400×g离心10min,上清液移至新离心管(d管)；c管下部的细胞用于pbmc分离。
5.将d管放入56℃水浴锅中灭活补体30min。
6.d管离心(800×g,20min)除去絮状沉淀物，将上清移至新离心管(e管)。
7.e管中的上清(约25ml)作为患者的自体血浆可在细胞培养中添加使用。
8.加入15mlpbs于上述c管中，反复颠倒5-6次充分混匀。
9.取2个新的50ml无菌管，铺加15ml人淋巴细胞分离液，用一次性无菌移液管将生理盐水稀释后的血液15ml缓慢加入至分离液上层。于23℃下750×g离心20min。
10.吸取中间层白色条带至50ml无菌离心管，加入所吸取液体4倍体积的生理盐水混匀后离心10min。
11.弃上清，收集细胞沉淀，加入10mlrpmi1640培养基。于1200rpm下离心5min。并重复以上步骤一次。10ml培液将细胞重悬。
1.8.2cik细胞培养
1.用10ml含10％fbs的rpm1640培养基重悬分离后细胞，将细胞浓度调整为2.0×106/ml铺于75cm2flask中。于5％co2、37℃孵箱培养2h。
2.轻轻摇晃flask，收集未贴壁细胞，将细胞密度调整为1.0×106/ml，加入inf-γ至1000u/ml，于5％co2、37℃孵箱培养24h。
3.24h后，向细胞中加入cd3单抗okt-3(50ng/ml),il-1α(100u/ml),il-2(300u/ml)。于5％co2、37℃孵箱中培养。
4.根据细胞生长情况，每2-3日等体积加入新鲜培养液，每次补加il-2(300u/ml)。培养10-14天的细胞用于后续试验。
1.8.3cik细胞的表面标志的表达水平检测
1.收集细胞
收集培养至14天的cik细胞于离心管中，以转速1000rpm离心3min，弃上清收集沉淀细胞，用含1％bsa的pbs重悬细胞至密度1.0×106/ml。
2.荧光标记
pbs重悬的细胞以每管100μl分装，分别加入10μl荧光标记的抗体，或同型对照，轻弹管底，充分混匀细胞，于4℃冰箱中孵育30min。孵育完毕后，用pbs洗涤2次，1200rpm转速离心3min。最后将细胞悬浮于300μl含1％bsa的pbs中，进行流式细胞仪检测。
1.9细胞杀伤能力检测
1.9.1cck8检测腺病毒对肝癌细胞的杀伤能力
(1)于96孔细胞培养板中，按1.5×105/ml的密度将正常细胞或肝癌细胞铺于96孔板中，每孔100μl；
(2)12h后，吸弃原有培养基，每孔加入100μl含指定moi的腺病毒，每组8个重复；
(3)在加入病毒后指定的时间点向细胞中加入10μlcck8检测液，37℃继续培养2h后用酶标仪检测490nm下各孔光吸收值。
(4)通过公式计算腺病毒对细胞生长的抑制率：
细胞存活率＝(实验组od值-空白对照组od值)/(阴性对照组od值-空白对照组od值)。
1.9.2luciferase发光强度法检测cik细胞及cik联合溶瘤病毒对靶细胞的杀伤能力
1.9.2.1.利用pcdh-ef1α-luciferase-2a-mcherry慢病毒构建稳定表达luciferase的细胞系
1)将需要感染慢病毒的细胞系以1.5×105/ml密度铺于6孔细胞培养板中，每孔2ml液体；
2)细胞贴壁生长12h后，更换含5moipcdh-ef1α-luciferase-2a-mcherry慢病毒，8μg/mlpolybrene的新鲜培养基；
3)病毒加入6h后，吸弃原有培养基，加入新鲜完全培养基；
4)病毒感染72h后，胰蛋白酶消化细胞，收集细胞进行流式分选(针对mcherry进行分选)。
1.9.2.2.验证luciferase发光强度与细胞数成线性关系
1)将稳定表达luciferase的细胞系分别从1×103-2×104按1×103密度梯度铺于96孔板中；
2)细胞贴壁生6h后，吸弃上清，加入50μlpromega公司荧光素酶分析检测试剂盒中的plb1×裂解buffer，于室温下放置5min；
3)4℃下2000rpm离心5min除去细胞碎片；
4)吸取上清10μl至白底96孔板中，加入发光底物50μl；
5)将板于酶标仪中检测发光流明强度值
6)通过细胞数与发光流明强度值进行线性分析；
1.9.2.3.检测cik细胞及cik联合溶瘤病毒对靶细胞的杀伤能力
1)将稳定表达luciferase的靶细胞按1×104铺于96孔板中；
2)将效应细胞按效靶比5:1的比例将cik细胞加入靶细胞中；
3)病毒组或病毒联合cik组，按病毒moi数将病毒加入孔中，单cik组或阴性对照组加入相应体积的pbs；
4)24h、48h、72h、96h不同时间点收集靶细胞进行luciferase的发光强度检测。
5)肿瘤抑制率＝1-(实验组流明值-空白对照组流明值)/(阴性对照组流明值-空白对照组流明值)×％。
2.0荧光定量pcr检测基因表达
2.1免疫组化检测组织中腺病毒hexon的表达
1、脱蜡和水化
1)石蜡切片置于二甲苯中浸泡10min；
2)于无水乙醇浸泡5min；
3)于95％乙醇中浸泡5min；
4)于70％乙醇中浸泡5min；
2.1.1抗原修复
抗原热高压热修复，在沸水中加入edta(ph8.0)缓冲溶液。将玻片置于金属染色架上，高压修复10min后，去除热源，置入凉水中。
2.1.2免疫组织化学染色
1)pbs浸泡2～3次，每次5min；
2)滴加血清封闭液,室温静置20分钟，甩去多余液体；
3)滴加稀释后ⅰ抗50μl，4℃放置过夜；
4)4℃过夜后在37℃复温45min；
5)pbs浸泡2～3次，每次5min；
6)滴加稀释后ⅱ抗50μl，室温静置1h；
7)pbs浸泡2～3次，每次5min
8)dab显色5～10min，在显微镜下掌握染色程度；
9)自来水下冲洗10min；
10)苏木精复染2min，盐酸酒精分化；
11)自来水冲洗10～15min；
12)脱水、透明、封片、镜检。
2.1.3免疫酶联吸附检测il-18的表达(采用elisaset试剂盒检测)
通过将溶瘤病毒adcn215-il18在bel7404、huh-7、smmc7721等肿瘤细胞系和正常肝细胞akn-1中的病毒复制能力进行对比分析，试验结果显示溶瘤病毒adcn215-il18在bel7404、huh-7、smmc7721等肿瘤细胞系中能够进行复制，病毒扩增约为120倍，而adcn215-il18在正常肝细胞中基本上很难复制，复制能力较差，这显示溶瘤病毒的复制具有肿瘤特异性；而elsia检测显示感染溶瘤病毒adcn215-il18后的bel7404和huh-7肿瘤细胞系以及正常肝细胞akn-1的il18表达情况，结果显示肿瘤细胞系中的il18表达水平也明显要高于在正常肝细胞akn-1中的表达水平，表明外源基因il18表达具有肿瘤特异性；通过对比溶瘤病毒adcn215-il18对肿瘤细胞bel7404、huh-7、hep3b的体外杀伤作用也明显要强于其对正常肝细胞akn-1的体外杀伤作用，杀伤能力差异明显具有生物学意义，这表明adcn215-il18对于肿瘤具有靶向杀伤能力。
在检测cik细胞对效应细胞的杀伤作用以及探讨il-12对cik细胞杀伤能力是否具有促进作用的试验结果显示，单纯的il-18对肿瘤细胞的生长没有抑制作用，在效靶20:1的情况下，il-18提升cik细胞的体外抗肿瘤作用，由14.5％±2.45％提升至36.55％±1.56％，p＝0.000488，在40:1的情况下抗肿瘤作用由50.25％±1.35％提升至73.36％±1.05％，p＝0.002355，提示il-18可以显著提升cik细胞对肝癌细胞的抑制作用。
在检测表达il-18增强cik细胞的体外抗肿瘤作用的试验结果显示，溶瘤病毒与cik细胞联合的抗肿瘤作用以及表达il-18的溶瘤病毒联合治疗是否能够进一步提升抗肿瘤能力；在效靶比10:1，病毒感染系数为10moi的情况下，对于肝癌细胞系huh-7，在48h的时间点cik细胞联合adcn215-gfp组较单cik组，肿瘤细胞存活率降低，差异显著，cik细胞联合adcn215-il18组较单cik组肿瘤细胞存活率降低，差异极显著；72h的时间点cik联合adcn215-il18组较联合adcn215-gfp组的肿瘤抑制作用更强，差异显著。
体内移植瘤模型治疗结果显示，单一治疗组(adcn215-gfp，adcn215-il18，cik)相对pbs组而言具有一定的肿瘤抑制效果，且差异显著，但是单一治疗组之间并无显著差异。cik细胞联合adcn215-gfp组较单一治疗组adcn215-gfp和cik具有显著差异。cik细胞联合adcn215-il18组具有最强的抗肿瘤作用，其较所有单一治疗组具有极显著差异，较cik联合adcn215-gfp组抗肿瘤效果更显著。治疗过程中发现，cik细胞联合adcn215-il18组中有3只小鼠肿瘤完全消失。
最后，cik细胞联合表达il-18基因的双靶向性溶瘤病毒adcn215-il18具有协同抗肿瘤作用，发现溶瘤病毒的肿瘤裂解作用和肿瘤局部高浓度il-18的表达增加了cik细胞在肿瘤组织内的浸润数量，增强了cik细胞的抗肿瘤作用，实现了“细胞-病毒-基因”强强联合的治疗效果，对于肝脏肿瘤的治疗具有积极意义。(试验结果如表1所示)
表1
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。