本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶法转化制备dl-半胱氨酸的方法。
二、
背景技术：
半胱氨酸化学名为2-氨基-3-巯基丙酸，分子式为c3h7no2s，相对分子质量121.12。半胱氨酸属于脂肪族氨基酸，呈白色结晶性粉末，无臭，味酸，易被氧化，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚、苯等有机试剂。根据构型不同，半胱氨酸分d型、l型和dl型，其中dl型为半胱氨酸的外消旋体。
dl-半胱氨酸具有广泛的用途：在化妆品领域，dl-半胱氨酸或其盐可用于染发烫发，具有不损伤发质，自然光亮等优点；在医药领域，dl-半胱氨酸及其衍生物可用于肝脏解毒、解热镇痛、治疗溃疡、恢复疲劳、输液等，特别用于治疗支气管炎；在食品方面，dl-半胱氨酸可作为发酵助剂、奶粉及果汁的抗氧剂和稳定剂、动物食物的营养添加剂等。
目前，根据文献报道dl-半胱氨酸的制备方法主要有中和结晶法、化学合成法和化学消旋法。
1、中和结晶法
陈士安(cn102260202a)将dl-半胱氨酸盐酸盐晶体加水配制成一定浓度，利用氢氧化钠中和至ph6.0，反应2h后浓缩结晶，烘干得到dl-半胱氨酸晶体。该方法工艺简单、效率高，但如何获得高品质的dl-半胱氨酸盐酸盐晶体是关键。
2、化学合成法
温建华(cn102531980b)采用环乙亚胺与溴水反应得到2-溴-环乙亚胺，2-溴-环乙亚胺与氰化钠反应得到2-氰基-环乙亚胺，2-氰基-环乙亚胺与硫化钠开环反应得到2-硫基-3-氨基丙氰，最后酸水解得到dl-半胱氨酸。化学合成法不仅步骤较多，而且存在副反应，该工艺中用到剧毒化合物氰化钠，安全和环保风险大。
3、化学消旋法
何佺(氨基酸和生物资源,2005,27(3):55～57)采用纯乙酸溶剂中加乙酸酐的方法，对l-半胱氨酸等几种氨基酸进行消旋研究，消旋率可达100％，消旋速率与温度、乙酸酐用量及氨基酸结构等相关。
陈士安(cn102887842a)将l-半胱氨酸盐酸盐、冰乙酸、丙酸和丙酮以1:1:2:3的比例混合，80℃反应1h，再加入重量为l-半胱氨酸盐酸盐1/4的芳香醛，搅拌均匀后保温静置反应8h，加入与反应液等体积的冰水，降温得到结晶，乙醇洗涤后烘干，得到dl-半胱氨酸盐酸盐。
化学消旋法要用到酸、有机溶剂、高温等反应条件，环保压力大；而且反应过程复杂，收率低，产物分离存在一定难度。
酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、环境友好等优点而日益受到重视。酶法转化制备半胱氨酸近年来成为人们研究的热点，其中研究较多的酶是色氨酸合成酶。色氨酸合成酶不仅能够催化l-丝氨酸和吲哚合成l-色氨酸，还能催化l-丝氨酸和硫氢化钠反应生成l-半胱氨酸。
ken-ichiishiwata(journaloffermentationandbioengineering,67(3):169～172,1989)以l-丝氨酸和硫氢化钠为底物，色氨酸合成酶酶法合成了l-半胱氨酸，在最佳条件下反应液中l-半胱氨酸达到114g/l，转化率是以l-丝氨酸和吲哚为底物酶法合成l-色氨酸的47％。日本专利(jp62215396-a,1987；jp63007790-a,1988)报道了以l-丝氨酸为底物，以硫化氢或硫氢化物或硫化物为巯基供体，色氨酸合成酶酶法合成l-半胱氨酸的工艺。
日本专利(jp62019098-a,1987)以dl-丝氨酸和硫化物为底物，用色氨酸合成酶将l-丝氨酸转化生成l-半胱氨酸，同时分离制备了d-丝氨酸。
以上色氨酸合成酶酶法合成l-半胱氨酸的报道均是利用丝氨酸纯品为底物，存在的问题有：底物丝氨酸成本高，如果想得到dl-半胱氨酸还需要对产物l-半胱氨酸消旋。因此，要实现酶法制备dl-半胱氨酸需要解决底物丝氨酸的廉价来源及l-半胱氨酸的消旋问题。
三、
技术实现要素：
本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处，提供一种高效、低成本制备dl-半胱氨酸的方法。本发明可以通过以下技术方案来达到：
一种酶法转化制备dl-半胱氨酸的方法，其特征由以下步骤构成：
(1)将黄单胞菌来源具有d-苏氨酸醛缩酶活性的菌株、恶臭假单胞菌来源具有氨基酸消旋酶活性的菌株、大肠杆菌来源具有色氨酸合成酶活性的菌株分别在培养基中培养，分别产生高活性的d-苏氨酸醛缩酶、氨基酸消旋酶、色氨酸合成酶；
(2)以50～180g/l的甘氨酸为底物，加入具有d-苏氨酸醛缩酶活性的菌体细胞或酶粗提液，0.05～0.5g/l的磷酸吡哆醛，20～40℃，流加100～370g/l的甲醛水溶液，用氢氧化钠水溶液控制ph6～9，酶促转化得到d-丝氨酸；
(3)d-丝氨酸转化液经离心去除菌体细胞，加入硫氢化钠，ph7～10，30～50℃，加入氨基酸消旋酶菌体细胞或粗酶液、色氨酸合成酶菌体细胞或粗酶液，双酶偶联催化合成dl-半胱氨酸；
(4)将生成的dl-半胱氨酸通空气或滴加双氧水氧化，等电点结晶法分离得到dl-胱氨酸，再经电解还原制得dl-半胱氨酸。
上述步骤(1)中培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或乳糖，培养基中总碳源质量浓度为1～20g/l；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～20g/l；
上述步骤(2)中流加甲醛水溶液时控制反应体系中甲醛终浓度不高于5g/l；
上述步骤(3)中加入的硫氢化钠，可以用硫氢化铵或硫化钠替代。
本发明以甘氨酸和甲醛为原料，先利用d-苏氨酸醛缩酶催化合成d-丝氨酸，再以d-丝氨酸和硫氢化钠为底物，利用氨基酸消旋酶和色氨酸合成酶偶联催化合成了dl-半胱氨酸。酶法制备dl-半胱氨酸的工艺路线如下：
本发明提供的技术方案解决了以下两个问题：一、提供了一种多酶偶联催化制备dl-半胱氨酸的工艺，该工艺绿色环保，催化效率高，省去了中间产物分离提取过程，与现有技术相比具有较强的竞争力；二、解决了底物丝氨酸的廉价来源问题，甘氨酸和甲醛都是廉价易得的工业原料，极大地降低了丝氨酸的生产成本。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明采用多酶偶联催化制备dl-半胱氨酸，反应条件温和，对环境友好，符合现代绿色化工的发展趋势；
(2)酶法催化立体选择性强，催化效率高，d-苏氨酸醛缩酶合成产物d-丝氨酸过程中，甘氨酸的摩尔转化率达98％以上；氨基酸消旋酶和色氨酸合成酶双酶偶联合成dl-半胱氨酸过程中，丝氨酸的摩尔转化率90％以上；
(3)原料廉价易得，甘氨酸和甲醛为最简单的化工原料，极大降低了dl-半胱氨酸的生产成本，具有良好的经济效益和社会效益；
(4)本发明工艺流程简单，省去了中间产物分离提取过程，适合工业化生产。
四、具体实施方式
以下实施例仅用于对本发明进行具体说明，但本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。
实施例一
1.取具有d-苏氨酸醛缩酶活性的黄单胞菌湿菌体10g，加入到1000ml转化液中，转化液中含50g/l甘氨酸和0.05g/l磷酸吡哆醛，流加100g/l甲醛水溶液200ml，控制反应体系中甲醛终浓度不高于5g/l，同时利用5mol/l氢氧化钠水溶液控制反应液ph6.0，20℃振荡反应10h，高效液相检测反应液中d-丝氨酸浓度57.7g/l，甘氨酸摩尔转化率99％，停止反应。
2.取1000mld-丝氨酸转化液，4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液中加入硫氢化钠52.8g，控制反应液ph7.0，加入具有氨基酸消旋酶活性的恶臭假单胞菌湿菌体5g和具有色氨酸合成酶活性的大肠杆菌湿菌体10g，30℃振荡反应12h，高效液相检测反应液中dl-半胱氨酸浓度59.8g/l，丝氨酸摩尔转化率90％，停止反应。
3.将dl-半胱氨酸转化液4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液用6mol/l盐酸调ph1.5，加热去除h2s，活性碳脱色，抽滤，滤液用浓氨水调ph5.0，将滤液中的dl-半胱氨酸通空气氧化，析出白色沉淀，真空抽滤，80％乙醇洗涤，烘干得56.8gdl-胱氨酸粗品，精制后得53.6gdl-胱氨酸精品，比旋光
实施例二
1.取具有d-苏氨酸醛缩酶活性的黄单胞菌湿菌体15g，加入到1000ml转化液中，转化液中含80g/l甘氨酸和0.1g/l磷酸吡哆醛，流加200g/l甲醛水溶液160ml，控制反应体系中甲醛终浓度不高于5g/l，同时利用5mol/l氢氧化钠水溶液控制反应液ph7.0，30℃振荡反应8h，高效液相检测反应液中d-丝氨酸浓度95.6g/l，甘氨酸摩尔转化率99％，停止反应。
2.取1000mld-丝氨酸转化液，4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液中加入硫氢化钠87.4g，控制反应液ph8.5，加入具有氨基酸消旋酶活性的恶臭假单胞菌湿菌体10g和具有色氨酸合成酶活性的大肠杆菌湿菌体15g，37℃振荡反应10h，高效液相检测反应液中dl-半胱氨酸浓度100.3g/l，丝氨酸摩尔转化率91％，停止反应。
3.将dl-半胱氨酸转化液4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液用6mol/l盐酸调ph1.5，加热去除h2s，活性碳脱色，抽滤，滤液用浓氨水调ph5.0，将滤液中的dl-半胱氨酸通空气氧化，析出白色沉淀，真空抽滤，80％乙醇洗涤，烘干得94.2gdl-胱氨酸粗品，精制后得89.5gdl-胱氨酸精品，比旋光
实施例三
1.取具有d-苏氨酸醛缩酶活性的黄单胞菌湿菌体20g，加入到1000ml转化液中，转化液中含100g/l甘氨酸和0.2g/l磷酸吡哆醛，流加300g/l甲醛水溶液134ml，控制反应体系中甲醛终浓度不高于5g/l，同时利用5mol/l氢氧化钠水溶液控制反应液ph8.0，35℃振荡反应12h，高效液相检测反应液中d-丝氨酸浓度122.3g/l，甘氨酸摩尔转化率99％，停止反应。
2.取1000mld-丝氨酸转化液，4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液中加入硫氢化钠111.8g，控制反应液ph9.0，加入具有氨基酸消旋酶活性的恶臭假单胞菌湿菌体10g和具有色氨酸合成酶活性的大肠杆菌湿菌体20g，40℃振荡反应15h，高效液相检测反应液中dl-半胱氨酸浓度126.8g/l，丝氨酸摩尔转化率90％，停止反应。
3.将dl-半胱氨酸转化液4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液用6mol/l盐酸调ph1.5，加热去除h2s，活性碳脱色，抽滤，滤液用浓氨水调ph5.0，将滤液中的dl-半胱氨酸通空气氧化，析出白色沉淀，真空抽滤，80％乙醇洗涤，烘干得120gdl-胱氨酸粗品，精制后得110.9gdl-胱氨酸精品，比旋光
实施例四
1.取具有d-苏氨酸醛缩酶活性的黄单胞菌湿菌体20g，加入到1000ml转化液中，转化液中含120g/l甘氨酸和0.2g/l磷酸吡哆醛，流加300g/l甲醛水溶液160ml，控制反应体系中甲醛终浓度不高于5g/l，同时利用5mol/l氢氧化钠水溶液控制反应液ph9.0，40℃振荡反应15h，高效液相检测反应液中d-丝氨酸浓度143.4g/l，甘氨酸摩尔转化率99％，停止反应。
2.取1000mld-丝氨酸转化液，4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液中加入硫氢化钠131g，控制反应液ph10.0，加入具有氨基酸消旋酶活性的恶臭假单胞菌湿菌体10g和具有色氨酸合成酶活性的大肠杆菌湿菌体20g，50℃振荡反应15h，高效液相检测反应液中dl-半胱氨酸浓度150.4g/l，丝氨酸摩尔转化率91％，停止反应。
3.将dl-半胱氨酸转化液4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液用6mol/l盐酸调ph1.5，加热去除h2s，活性碳脱色，抽滤，滤液用浓氨水调ph5.0，将滤液中的dl-半胱氨酸通空气氧化，析出白色沉淀，真空抽滤，80％乙醇洗涤，烘干得141.4gdl-胱氨酸粗品，精制后得131.5gdl-胱氨酸精品，比旋光
实施例五
1.取具有d-苏氨酸醛缩酶活性的黄单胞菌湿菌体30g，加入到1000ml转化液中，转化液中含150g/l甘氨酸和0.3g/l磷酸吡哆醛，流加370g/l甲醛水溶液162ml，控制反应体系中甲醛终浓度不高于5g/l，同时利用5mol/l氢氧化钠水溶液控制反应液ph7.5，35℃振荡反应20h，高效液相检测反应液中d-丝氨酸浓度179g/l，甘氨酸摩尔转化率99％，停止反应。
2.取1000mld-丝氨酸转化液，4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液中加入硫氢化钠163.6g，控制反应液ph8.2，加入具有氨基酸消旋酶活性的恶臭假单胞菌湿菌体15g和具有色氨酸合成酶活性的大肠杆菌湿菌体30g，35℃振荡反应20h，高效液相检测反应液中dl-半胱氨酸浓度185.6g/l，丝氨酸摩尔转化率90％，停止反应。
3.将dl-半胱氨酸转化液4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液用6mol/l盐酸调ph1.5，加热去除h2s，活性碳脱色，抽滤，滤液用浓氨水调ph5.0，将滤液中的dl-半胱氨酸通空气氧化，析出白色沉淀，真空抽滤，80％乙醇洗涤，烘干得174.5gdl-胱氨酸粗品，精制后得162.3gdl-胱氨酸精品，比旋光
实施例六
1.取具有d-苏氨酸醛缩酶活性的黄单胞菌湿菌体40g，加入到1000ml转化液中，转化液中含180g/l甘氨酸和0.5g/l磷酸吡哆醛，流加370g/l甲醛水溶液195ml，控制反应体系中甲醛终浓度不高于5g/l，同时利用5mol/l氢氧化钠水溶液控制反应液ph7.0，37℃振荡反应28h，高效液相检测反应液中d-丝氨酸浓度209g/l，甘氨酸摩尔转化率99％，停止反应。
2.取1000mld-丝氨酸转化液，4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液中加入硫氢化钠191g，控制反应液ph8.2，加入具有氨基酸消旋酶活性的恶臭假单胞菌湿菌体20g和具有色氨酸合成酶活性的大肠杆菌湿菌体35g，37℃振荡反应30h，高效液相检测反应液中dl-半胱氨酸浓度217g/l，丝氨酸摩尔转化率90％，停止反应。
3.将dl-半胱氨酸转化液4000r/min离心15min去除菌体细胞，上清液用6mol/l盐酸调ph1.5，加热去除h2s，活性碳脱色，抽滤，滤液用浓氨水调ph5.0，将滤液中的dl-半胱氨酸通空气氧化，析出白色沉淀，真空抽滤，80％乙醇洗涤，烘干得203gdl-胱氨酸粗品，精制后得189gdl-胱氨酸精品，比旋光