本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种桑树类糖原合成酶激酶基因(mmsk)和用于检测mmsk基因表达的特异性引物及其在胁迫条件下的表达。
背景技术：
：植物中的类糖原合成酶激酶(shaggy-likekinase，sk)是果蝇(drosophilamelanogaster)shaggy(sgg)基因和哺乳动物中糖原合成酶激酶(glycogen-synthasekinase-3，gsk-3)的同源物，同属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，具有高度保守性。现有的证据表明，植物gsks可能参与植物的非生物胁迫应答、伤害应答、器官发育以及油菜素内酯等信号转导等一系列生命活动进程。目前，在拟南芥、水稻、小麦、烟草等植物中sk类基因的研究较多，但对桑树中的sk类基因研究还比较少。我国是桑树的起源中心，种质资源极为丰富。经过桑树种质资源及育种工作者几十年的努力，现在全国已收集保存有近3000份桑树种质资源，其中不少资源都具有果用价值、药用价值、经济价值等。我们用克隆得到的鲁桑品种(morusmulticaulis)育71-1mmsk基因orf序列，通过生物信息学分析其序列特征。同时，建立mmsk基因实时荧光rt-pcr检测方法，并利用该方法检测了mmsk基因在干旱、高盐、低温、aba胁迫条件下的转录水平的变化规律。通过对该基因的研究，使我们更好地了解桑树mmsk基因在不同胁迫条件下的表达情况及其在桑树响应逆境胁迫中发挥的作用及分子机制。技术实现要素：本发明要解决的一个技术问题是提供一种桑树类糖原合成酶激酶基因(mmsk)克隆和其在非生物胁迫条件下的表达，可以分析桑树类糖原合成酶激酶基因在环境胁迫下的表达调控。本发明要解决的另外一个技术问题是提供两对用于荧光rt-pcr技术检测桑树类糖原合成酶激酶基因表达的特异性引物。对于桑树类糖原合成酶激酶基因，本发明采用的技术方案是，其核苷酸序列如seqidno.1所示。上述桑树类糖原合成酶激酶基因作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。作为优选，所述植物为桑树，其拉丁文学名为morusmulticaulis。作为优选，所述的非生物胁迫为干旱、高盐、低温胁迫。对于桑树类糖原合成酶激酶相关基因编码的蛋白，本发明采用的技术方案是，其氨基酸序列如seqidno.2所示。上述桑树类糖原合成酶激酶相关基因编码的蛋白作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。作为优选，所述植物为桑树，其拉丁文学名为morusmulticaulis。作为优选，所述的非生物胁迫为干旱、高盐、低温胁迫。对于用于荧光rt-pcr技术检测桑树类糖原合成酶激酶基因表达的特异性引物，本发明采用的技术方案是，特异性引物为符合荧光pt-pcr反应特点的特异性上下游引物，该特异性上下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示；以及作为内参基因的桑树β-actin基因的特异性上下游引物，该特异性上下游引物的核苷酸序列分别如seqidn0.5和seqidno.6所示。本发明的有益效果是：本发明完善桑树基因组同时建立桑树类糖原合成酶激酶基因(mmsk)相对表达量的检测方法，探究mmsk在非生物胁迫条件下的表达分析，桑树mmsk的克隆将为进一步通过转基因技术培育抗病桑树新品种奠定基础，，可有效弥补常规育种技术的不足，从而加速桑树抗性新品种的选育进程。具体实施方式实施例1桑树类糖合成酶激酶基因(mmsk)的克隆1.1设计引物供试桑树品种为保存于中国农业科学院蚕业研究所国家种质镇江桑树圃的育71-1。利用已获得的包含mmsk基因cdna片段的ests序列及ncbi上桑树mmsk同源基因序列，设计引物克隆，并加以验证，引物序列如下：mmsk-f1：5′-ataggactctcacatggcctc-3′，mmsk-r1：5′-cttcccgtccatctacccag-3′；mmsk-f2：5′-tgccaccagaagcaattgacc-3′，mmsk-r2：5′-gacgccgttaactttaattaat-3′。1.2桑树类糖原合成酶激酶基因(mmsk)的克隆使用takara试剂盒提取桑树嫩叶rna，提取步骤按照试剂盒说明书进行，电泳检测rna条带完整；并按照takara反转录试剂盒说明书将rna反转录成cdna。以合成的cdna第1链为模板，利用mmsk-f1/r1和mmsk-f2/r2为引物进行pcr扩增，其中，pcr酶使用takara公司生产的extaq酶，pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火35s，72℃延伸40s，37个循环；72℃复性5min；4℃保存。电泳检测目的片段大小，使用takara公司agarosege1dnapurificationkit试剂盒纯化回收pcr产物，得到桑树mmsk基因片段，纯化方法参照试剂盒说明书。将目的片段用dna连接酶与pmdtm18-t载体连接。连接产物转化到宿主菌e.colitop10菌株感受态细胞，涂布于在含有amp的lb固体平板上。挑取单菌落培养后送样，由生工生物工程(上海)有限公司完成测序，利用dnastar软件将克隆得到的2个片段进行拼接，测并进行blast分析，获得1705bp的包含完整orf的mmsk基因序列(genbankaccessionnumber：ky348867)，其中，包括13bp的5′-utr，456bp的3′-utr和1236bp的完整orf。实施例2桑树类糖原合成酶激酶基因的生物信息学分析利用在线分析工具psort和smart(http：//smart.emb1-heidelberg.de/)，根据已报道的文献对目的基因进行核定位序列的预测及蛋白质结构域的分析，桑树类糖原合成酶激酶mmsk蛋白属于植物类gsk3/shaggy蛋白激酶家族，包括蛋白激酶的atp结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化结构域。利用dnastar软件和在线分析软件expasy(http：//prosite.expasy.org/prosite.html/)对桑树类糖原合成酶激酶mmsk基因进行较全面的分析，获得该基因所编码的氨基酸序列seqidno.2，基因编码桑树类糖原合成酶激酶mmsk蛋白质的等电点为8.61，分子质量为46.55kda。实施例3一种采用荧光rt-pcr技术检测桑树mmsk基因表达的方法3.1rna提取及cdna第一链的合成采用各种通用的rna提取方法和纯化方法，从桑树嫩叶中提取得到纯化的桑叶总rna；以桑叶总rna为模板按照takara反转录试剂盒说明书将rna反转录成cdna，反应体系为20μl。3.2设计引物根据桑树mmsk基因的序列，使用primer6软件设计适用于实时荧光rt-pcr检测的特异性引物，引物序列如下：mmsk-f：5’-ccagaggatgccactcattta-3’，mmsk-r：5’-tgtggcttcacatccctatg-3’；β-actin基因是看家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，看家基因的表达只受启动序列或启动子与rna聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此看家基因β-actin常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。根据ncbi里提供的桑树β-actin基因的cds序列设计用于实时荧光rt-pcr内对照的特异性引物，引物序列如下：β-actin-f：5’-caggaatccacgagactactta-3’，β-actin-r：5’-tctgcaataccagggaacatag-3’。利用琼脂糖凝胶电泳检测2对引物质量，电泳结果显示2对引物扩增后的产物长度均与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光rt-pcr检测。3.3荧光rt-pcr荧光rt-pcr检测采用美国罗氏faststartuniversalsybrgreenmastermixkit试剂盒，利用96rea1-timepcrsystem进行。将上述3.1中合成的桑叶cdna稀释4倍，取1μl作为模板，3.2中mmsk-f/r和β-actin-f/r为特异性引物，进行荧光rt-pcr反应，pcr反应体系的配制：试剂体积sybrgreenmastermix10μlpcrforwardprimer(10μm)1μlpcrreverseprimer(10μm)1μl适当稀释的模板cdna1μlddh2o7μl总体积20μlpcr反应程序：退火温度参照上海生物工程公司合成引物的tm值。每个反应均有3个生物学重复和3次技术重复；待测基因的相对表达量rq＝2-δδct，其中δct＝ctsample-ctactin，且δδct＝δctsample-δctcontrol。实施例4桑树类糖原合成酶激酶基因(mmsk)在各种胁迫条件下的表达模式在供试桑苗的新梢生长至约20cm长时，对桑苗分别进行干旱、高盐、低温、aba胁迫处理。在整个胁迫诱导处理过程中，所有试验用苗的温度，光照强度，光周期以及湿度等非生物条件均保持不变。当桑苗在各种胁迫处理下表现出明显受害症状时，分别取对照和各种胁迫条件下的桑树幼叶，用铝箔纸包裹后迅速投入液氮中，放于-80℃的冰箱中保存。采用荧光rt-pcr的方法，以桑树稳定表达的肌动蛋白基因(β-actin)作为内参，测定桑树在胁迫条件下目的基因的表达水平。所有胁迫实验均为3个生物学重复3个技术重复。高盐胁迫：供试桑苗用浓度为300mm的nacl溶液进行盐胁迫诱导处理。试验桑苗和对照桑苗放置于同一个光照培养箱，温度25℃，每天16小时光照，8小时黑暗。分别于1天、2天、4天、7天和10天时取盐胁迫条件下的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。干旱胁迫：供试桑苗放置于温度25℃光照培养箱，一直不浇水，每天16小时光照，8小时黑暗。分别于1天、3天、5天、10天和15天取桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。低温胁迫：供试桑苗放置于温度4℃光照培养箱，每天16小时光照，8小时黑暗。分别于12小时、1天、3天、6天和10天取桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料，后放置于温度25℃光照培养箱进行常温复性，每天16小时光照，8小时黑暗，复性2天和5天取桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。aba胁迫：供试桑苗用浓度为0.1mol/l的aba溶液进行aba胁迫诱导处理，放置于温度25℃光照培养箱，每天16小时光照，8小时黑暗。分别于2小时、6小时、12小时、1天、3天和5天取桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。不同非生物胁迫下桑树类糖原合成酶激酶mmsk基因相对表达量变化显示：桑树mmsk基因对高盐胁迫的反应很强烈，胁迫下mmsk基因表达量急剧增高，在第2d时达到最高值，为正常条件下的6.77倍，有极显著差异(p≤0.01)，到第4d时，表达量骤减为正常条件下的1.94倍，随着高盐胁迫的持续进行，在第7d时，mmsk表达量略有增高，随后在第10d，表达量降低到最小值，为正常条件下的1.03倍，可以看出高盐胁迫能促使桑树mmsk基因表达量的增加。在干旱胁迫诱导下，桑树mmsk基因的表达量先是逐渐升高，到第5d时升高到最大值，为正常条件下的7.44倍，差异极显著(p≤0.01)，之后缓慢降低，到第15d时mmsk表达量为正常条件下的3.33倍，在整个干旱胁迫过程中，桑树mmsk基因的表达量都是高于正常条件下的，说明桑树可以通过增加mmsk基因的表达量来适应干旱胁迫。在低温胁迫诱导下，mmsk基因的表达量总体趋势是缓慢上升，然后缓慢下降，在胁迫第3d时，表达量达到处理阶段的最大值，为正常条件下的9.25倍，25℃复性5d时，mmsk的表达量基本下降到正常条件下水平(p＞0.05)。当桑树遭受aba胁迫处理时，前2h，mmsk基因表达量没有显著变化(p＞0.05)，到6h时，表达量缓慢升高到正常条件下的1.25倍，差异显著(p≤0.05)，之后继续升高，到1d时达到处理阶段的最高值，为正常条件下的2.17倍，有极显著差异(p≤0.01)，接下来随着处理时间的延长，mmsk基因表达量开始降低，到第5d时，降到与12h时的相同水平。桑树mmsk基因在不同非生物胁迫处理下均上调表达，这表明该基因参与了桑树的抗逆过程，在非生物胁迫条件下，诱发mmsk基因的表达，使植物积极响应外界胁迫。通过荧光rt-pcr检测分析，利用mmsk基因在干旱胁迫、高盐胁迫、低温胁迫和aba胁迫条件下总体表达的升降情况、在不同的胁迫时间内相对基因表达量指标，以及mmsk基因在植物中的保守性，可以以此标识植物是否处于高盐、低温、干旱或aba胁迫等生长环境。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。序列表<110>安徽省农业科学院蚕桑研究所<120>桑树类糖原合成酶激酶基因及其检测和应用<130>no<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1680<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ataggactctcacatggcctccatgcccttggggcctcaccatccaccaccactgccaga60caacagcaatgagcctctgaagatcatcggtcgccgcgtctccgacatggaaaccgataa120ggatatgtctgctactgttatcgaggggaacgatcaggtaactggtcacatcatttccac180gaccattggtggcaagaatggtgaacccaaacggacaattagttacatggcagagcgtgt240tgtcggaacaggatcatttggaattgtttttcaagcaaaatgtcttgaaactggagaaac300ggtggcaataaagaaggttttgcaggacagacgttataaaaatcgcgagttgcagctaat360gcgcttgatggatcacccaaatgtagtttcactaaagcattgcttcttctctacaacgag420taaagatgagctatttctaaatttggtcatggaatatgtacctgaaaccatgtatagagt480tttgaagcactatagtagtatgaaccagaggatgccactcatttatgtgaaactctatac540ctaccaaatttttaggggcttggcttatatccatactgtgcctggagtctgccataggga600tgtgaagccacaaaaccttttggttgatcctctcactcaccaagttaagctttgtgattt660tggaagtgcgaaagttttggtgaagggtgaagccaatatatcctatatatgttctcgtta720ctatcgagctccagaactcatttttggtgcaacagaatacgcaacatcaattgatatttg780gtcagctggttgtgtccttgccgagcttcttctgggacagcctctgtttccaggagagaa840tgcagtggaccaacttgtagagattattaaggttcttggtactccaactcgagaagaaat900tcgatgcatgaacccaagttatacagattttaggttccctcagattaaggctcatccttg960gcacaaggtcttccataagcgaatgccaccagaagcaattgaccttgcatcacggcttct1020tcaatattcaccaagtcttcgctgcactgctctagaagcatgttcacatcctttctttga1080tgaactccgtgaaccgaatgtgcgccttccaaatggtcgtccattgccaccactattcaa1140cttcaagcaggaattatctggagcatcaccggaactgatcaacaggcttatacctgaaca1200tgtacggcggctggcaaatctcagcttcccgcatccagtaggtacttaattgtaaagcta1260caaaacaggaaatcatcttttctgtgctgggtagatggacgggaagcaaaaagagggcat1320cttgtttggtcttataacacttaactgagcattttggcctaagcaaaagctcttcctctc1380gcccttggcaagaatgtacacatatactcactgttccgcttaacttggagatcggtgatt1440ctgtctacactgtcattttagtataaagaaaacatactattttcacgcatagatgtacat1500cgttttggtcgcaaggattcacgcaaaggtagagtattaagaaggaatgtttattgttag1560ataggggcttgcctaaccgagtgggagcccaaggactcggatcatattgtacccccccgg1620gctttctttctctctttgttttctacttttgtttgtggcattctgggcaccaactctatt1680<210>2<211>411<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6当前第1页12