本发明提供一种提高表皮干细胞中crispr-cas系统基因编辑效率的方法，特别是涉及一种新的能够显著提高同源重组概率的增效因子，将所述增效因子与crispr-cas系统结合可显著提高基因组编辑效率。
背景技术：
表皮干细胞(epidermalstemcells，episcs)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transitamplifyingcellsta细胞)，ta细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(post-mitoticcells)及终末分化细胞(terminally-differentiatedcells)，以补充表皮细胞不断更新的需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(dunnwaldetal，expdermatol，2001，10：45-54.papinietal.stemcells，2003，21：481-494)，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[liangetal，stemcells，2002：20：21-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。
人类多能干细胞(humanpluripotentstemcells,hpscs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatedproteins9,crispr/cas9)技术的飞速发展。
最近研究人员利用crispr/cas9技术，建立了在人多能干细胞中进行基因敲除或者敲入的基因组编辑体系。研究以位于人2号染色体上的linc00116基因组区域为例，利用crispr/cas9技术对人多能干细胞中的该基因组区域进行了基因敲除、flag短肽序列定点插入和基因组大片段删除，获得的多个突变干细胞株为下一步对该基因组区域进行功能分析提供了特有的细胞平台。
这项研究的重要性表现在：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除；通过单链dna提供外源模板经由同源重组定点敲入flag序列；通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明crispr/cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。
利用crispr对多能干细胞中多个基因组区域进行靶向的研究结果显示，经由nhej引入碱基插入或缺失突变的效率为大于50％，提示利用crispr技术可以进行高效的基因敲除，甚至多个基因的同时敲除。
这项研究在由同源重组敲入特定点突变或者外源序列方面，通过单链核苷酸模板定点敲入flag小肽序列的效率偏低，仅为1.1％。研究还利用同时导入两条grna对基因组区域进行了大片段靶向删除，效率约为5％。靶向删除基因组大片段的效率不仅和每条grna的基因编辑活性相关，同时也和片段长度相关。靶向删除片段长度的增加可能带来效率的降低。此外，导入两条或者多条grnas，不仅可以引入基因组区域缺失，同时还可以引发其他多种染色体结构变异，包括染色体区域插入(insertion)、重复(duplication)、易位(translocation)和倒位(inversion)等。基因靶向潜在的问题是脱靶效应。这充分说明，在现有技术中，针对基因编辑技术的效果提高以及靶向性的提高有巨大的需求。
cn106399367a中公开了一种提高crispr介导的同源重组效率的方法，包括如下步骤：通过shrna抑制lig4、dna-pk和xrcc6的表达从而抑制非同源末端连接(nhej)修复途径；将靶向基因组特定位置的sgrna与shrna融合表达，形成shrna-sgrna多顺反子；将上述多顺反子置于rna聚合酶ii或rna聚合酶iii启动子下游。该方法需要同时敲除3个基因，操作复杂，并不适宜大规模推广使用。
cn107474129a是申请人之前的发明，其中公开了一种提高crispr-cas系统基因编辑效率的方法，有效克服了现有技术在动物体内发生同源重组概率低进而影响精确编辑的技术缺陷，特别是针对干细胞进行基因编辑的缺陷。该方法包括向宿主细胞中引入增效蛋白蛋白实现的。但是申请人利用该增效蛋白时发现，其只是能够在骨髓间质干细胞中具有较好的增效效果，而在其他的干细胞，特别是表皮干细胞中并不具有显著的增效效果。
因此开发一种能够在表皮干细胞中增加基因编辑效率的新方法变得迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高crispr-cas系统在表皮干细胞中基因编辑效率的方法，有效克服了现有技术在动物体内发生同源重组概率低进而影响精确编辑的技术缺陷，特别是针对干细胞进行基因编辑的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种提高crispr-cas系统在表皮干细胞中同源重组概率的方法，包括向宿主细胞中引入增效蛋白，所述增效蛋白escs-higher是由seqidno:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质。
进一步地，所述增效蛋白包含a)或b)：
a)seqidno:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质的多核苷酸序列；
b)seqidno:2所示的氨基酸序列。
进一步地，克隆增效蛋白escs-higher基因，构建egfp标记的增效蛋白escs-higher慢病毒表达载体，用gp2－293t细胞包装慢病毒，修饰干细胞。镜下观察绿色荧光蛋白表达，westernblot检测增效蛋白escs-higher的表达情况。
更进一步地，提供一种在细胞中采用crispr/cas9进行基因编辑的系统，其特征在于所述系统包括：(1)用于表达seqidno：1所述的escs-higher基因的质粒；(1)用于表达sgrna的质粒；(2)用于表达cas9的质粒；(3)用于测试crispr/cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的c-端与报告基因的n-端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点。
更进一步地，提供一种在细胞中采用crispr/cas9进行基因编辑的系统，组成为：用于表达seqidno：1所述的escs-higher基因的质粒；(1)用于表达sgrna的质粒；(2)用于表达cas9的质粒；
为实现上述目的，本发明还提供一种在表皮干细胞中实现高效基因组编辑的方法，包括在生物体中表达所述基因组编辑系统。
为实现上述目的，本发明还提供一种高效编辑靶位点序列的方法，包括将所述基因编辑系统导入细胞中。
本发明提供了一种提高在表皮干细胞中crispr/cas9基因编辑效率的方法，具有以下优点：
1、本发明提供了一些新的增效蛋白escs-higher，能够显著提高表皮干细胞内crispr/cas9基因编辑效率，为提高表皮干细胞中基因编辑效率提供了新的途径；
2、本发明提供了一种更高效的基因组编辑系统，当本发明所述增效蛋白在与crispr/cas9共同使用时，可以显著提升表皮干细胞crispr/cas9的基因组编辑的效率。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为干细胞中crispr/cas9编辑效率图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明提高基因组编辑效率的方法的技术方案。
实施例1、克隆增效蛋白escs-higher及构建载体
克隆增效蛋白escs-higher基因，通过全基因合成的方法，获得seqidno：1所述的基因序列，以该序列为模板，根据上下游引物序列分别为5'-atgatatactttattagaat-3'，5'-tcaagggatttccatttctc-3'，引物和全基因组由上海生工有限公司合成。pcr反应扩增escs-higher基因目的基因片段，扩增反应体系如下:95℃、40s，57℃、1min，72℃、1min，72℃、10min，循环35次，pcr产物由上海生工有限公司进行测序，通过测序，结合与seqidno：1完全匹配。随后，将pcr扩增的目的基因连接在空载体慢病毒载体phiv-cs-cdf-cg-pre上，通过pcr扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。结合证明重组慢病毒载体构建成功。随后将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染表皮干细胞(escs)(按照cn1253558c中权利要求1的方法分离培养获得)，骨髓间质干细胞(rmscs)(购买自吉赛生物)，通过重组而包装成能表达escs-higher基因的表皮干细胞和骨髓间质干细胞。通过pcr筛选鉴定，将稳定转染的干细胞用于后续基因编辑应用。
实施例2crispr/cas9在表皮干细胞以及骨髓间质干细胞中的应用分析
基于含bsd-fsegfp融合基因pbgn质粒的crispr/cas9编辑载体
(1)bsd-fsegfp融合基因：利用常规pcr，扩增公知的bsd基因，5’-pcr引物带hindiii位点，3’-pcr引物引入i-scei和ecori位点。将pcr产物(bsd)插入egfp质粒(egfp核苷酸序列为本领域公知的序列,例如cn105647968a中的序列1和序列2所示)中cmv驱动子和egfp编码区的之间的hindiii和ecori位点，生成含bsd-fsegfp融合基因的质粒pbgn，bsd-fsegfp融合基因核苷酸序列为如cn105647968a中的序列3和序列4所示)。该融合基因由cmv驱动子或pgk驱动子驱动，但egfp由于移码而无活性，因此称fsegfp。
5’-pcr引物为
ctcaagcttaactaaaccatggccaagcctttgtctcaagaag，
3’-pcr引物为
agaattccagtagggataacagggtaatgccaggtccgccctcccacacataaccagag。
(2)选择针对人细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶hprt的基因敲除的sgrna，靶序列5’to3’gccctctgtgtgctcaagggggg,通过分子克隆，根据sgrna的23碱基对目标序列，合成两条互补的对应于sgrna目标序列正反链的寡核苷酸，退火后插入质粒pbgn的i-scei和ecori位点之间，生成带有对应目标序列的crispr/cas9基因编辑效率测试质粒pbgn-t。sgrna目标序列的插入尽管造成额外2对碱基对的移码，但仍未能纠正移码的报告基因，因而不能编码正常蛋白，在sgrna介导基因编辑前无活性可以检测。同时，利用常规操作和公知的sgrna的表达质粒。
(3)将测试质粒pbgn-t，sgrna表达质粒，公知的cas9表达质粒共转染表皮干细胞和骨髓间质干细胞。以未转染实施例1的增效基因的干细胞作为阳性对照，同时，将常规用的gfp表达质粒平行转染细胞以测定转染效率，利用转染效率校正获取的crispr/cas9基因编辑相对效率。
(4)转染2-3天后，利用流式细胞仪测量gfp+细胞的频率。
(5)计算特定sgrna介导的crispr/cas9基因编辑相对效率。这个相对效率由gfp阳性细胞频率与转染效率的比值代表，结果如图1所示。
我们发现在导入了实施例1的增效蛋白的表皮干细胞中gfp阳性细胞频率分别约为91.6％，未导入实施例1的增效蛋白的表皮干细胞中gfp阳性细胞频率分别约为50.1％。在导入了实施例1的增效蛋白的骨髓间质干细胞中gfp阳性细胞频率分别约为58.1％，未导入实施例1的增效蛋白的骨髓间充质干细胞中gfp阳性细胞频率分别约为50.6％。阴性对照没有gfp阳性细胞，其中p值均小于0.01，具有统计学意义。这充分说明，本发明提供的增效蛋白能够显著的、特异性的增加表皮干细胞中的基因编辑效率，而在骨髓间质干细胞中基本没有增效作用。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
序列表
<110>洛阳轩智生物科技有限公司
<120>特异性增强crispr-cas系统在表皮干细胞中进行基因编辑效率的方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2280
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
atgatatactttattagaataatcatgggccagactgggaagaaatctgagaagggacca60
gtttgttggcggaagcgtgtaaaatcagagtacatgcgactgagacagctcaagaggttc120
agacgagctgatgaagtaaagagtatgtttagttccaatcgtcagaaaattttggaaaga180
acggaaatcttaaaccaagaatggaaacagcgaaggatacagcctgtgcacatcctgact240
tctgtgagctcattgcgcgggactagggagtgttcggtgaccagtgacttggattttcca300
acacaagtcatcccattaaagactctgaatgcagttgcttcagtacccataatgtattct360
tggtctcccctacagcagaattttatggtggaagatgaaactgttttacataacattcct420
tatatgggagatgaagttttagatcaggatggtactttcattgaagaactaataaaaaat480
tatgatgggaaagtacacggggatagagaatgtgggtttataaatgatgaaatttttgtg540
gagttggtgaatgcccttggtcaatataatgatgatgacgatgatgatgatggagacgat600
cctgaagaaagagaagaaaagcagaaagatctggaggatcaccgagatgataaagaaagc660
cgcccacctcggaaatttccttctgataaaatttttgaagccatttcctcaatgtttcca720
gataagggcacagcagaagaactaaaggaaaaatataaagaactcaccgaacagcagctc780
ccaggcgcacttcctcctgaatgtacccccaacatagatggaccaaatgctaaatctgtt840
cagagagagcaaagcttacactcctttcatacgcttttctgtaggcgatgttttaaatat900
gactgcttcctacatcgtaagtgcaattattcttttcatgcaacacccaacacttataag960
cggaagaacacagaaacagctctagacaacaaaccttgtggaccacagtgttaccagcat1020
ttggagggagcaaaggagtttgctgctgctctcaccgctgagcggataaagaccccacca1080
aaacgtccaggaggccgcagaagaggacggcttcccaataacagtagcaggcccagcacc1140
cccaccattaatgtgctggaatcaaaggatacagacagtgatagggaagcagggactgaa1200
acggggggagagaacaatgataaagaagaagaagagaagaaagatgaaacttcgagctcc1260
tctgaagcaaattctcggtgtcaaacaccaataaagatgaagccaaatattgaacctcct1320
gagaatgtggagtggagtggtgctgaagcctcaatgtttagagtcctcattggcacttac1380
tatgacaatttctgtgccattgctaggttaattgggaccaaaacatgtagacaggtgtat1440
gagtttagagtcaaagaatctagcatcatagctccagctcccgctgaggatgtggatact1500
cctccaaggaaaaagaagaggaaacaccggttgtgggctgcacactgcagaaagatacag1560
ctgaaaaaggacggctcctctaaccatgtttacaactatcaaccctgtgatcatccacgg1620
cagccttgtgacagttcgtgcccttgtgtgatagcacaaaatttttgtgaaaagttttgt1680
caatgtagttcagagtgtcaaaaccgctttccgggatgccgctgcaaagcacagtgcaac1740
accaagcagtgcccgtgctacctggctgtccgagagtgtgaccctgacctctgtcttact1800
tgtggagccgctgaccattgggacagtaaaaatgtgtcctgcaagaactgcagtattcag1860
cggggctccaaaaagcatctattgctggcaccatctgacgtggcaggctgggggattttt1920
atcaaagatcctgtgcagaaaaatgaattcatctcagaatactgtggagagattatttct1980
caagatgaagctgacagaagagggaaagtgtatgataaatacatgtgcagctttctgttc2040
aacttgaacaatgattttgtggtggatgcaacccgcaagggtaacaaaattcgttttgca2100
aatcattcggtaaatccaaactgctatgcaaaagttatgatggttaacggtgatcacagg2160
ataggtatttttgccaagagagccatccagactggcgaagagctgttttttgattacaga2220
tacagccaggctgatgccctgaagtatgtcggcatcgaaagagaaatggaaatcccttga2280
<210>2
<211>759
<212>prt
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>2
metiletyrpheileargileilemetglyglnthrglylyslysser
151015
glulysglyprovalcystrparglysargvallysserglutyrmet
202530
argleuargglnleulysargpheargargalaaspgluvallysser
354045
metpheserserasnargglnlysileleugluargthrgluileleu
505560
asnglnglutrplysglnargargileglnprovalhisileleuthr
65707580
servalserserleuargglythrargglucysservalthrserasp
859095
leuasppheprothrglnvalileproleulysthrleuasnalaval
100105110
alaservalproilemettyrsertrpserproleuglnglnasnphe
115120125
metvalgluaspgluthrvalleuhisasnileprotyrmetglyasp
130135140
gluvalleuaspglnaspglythrpheileglugluleuilelysasn
145150155160
tyraspglylysvalhisglyaspargglucysglypheileasnasp
165170175
gluilephevalgluleuvalasnalaleuglyglntyrasnaspasp
180185190
aspaspaspaspaspglyaspaspproglugluarggluglulysgln
195200205
lysaspleugluasphisargaspasplysgluserargproproarg
210215220
lyspheproserasplysilepheglualailesersermetphepro
225230235240
asplysglythralaglugluleulysglulystyrlysgluleuthr
245250255
gluglnglnleuproglyalaleuproproglucysthrproasnile
260265270
aspglyproasnalalysservalglnarggluglnserleuhisser
275280285
phehisthrleuphecysargargcysphelystyraspcyspheleu
290295300
hisarglyscysasntyrserphehisalathrproasnthrtyrlys
305310315320
arglysasnthrgluthralaleuaspasnlysprocysglyprogln
325330335
cystyrglnhisleugluglyalalysgluphealaalaalaleuthr
340345350
alagluargilelysthrproprolysargproglyglyargargarg
355360365
glyargleuproasnasnserserargproserthrprothrileasn
370375380
valleugluserlysaspthraspseraspargglualaglythrglu
385390395400
thrglyglygluasnasnasplysgluglugluglulyslysaspglu
405410415
thrserserserserglualaasnserargcysglnthrproilelys
420425430
metlysproasnilegluproprogluasnvalglutrpserglyala
435440445
glualasermetpheargvalleuileglythrtyrtyraspasnphe
450455460
cysalailealaargleuileglythrlysthrcysargglnvaltyr
465470475480
glupheargvallysgluserserileilealaproalaproalaglu
485490495
aspvalaspthrproproarglyslyslysarglyshisargleutrp
500505510
alaalahiscysarglysileglnleulyslysaspglyserserasn
515520525
hisvaltyrasntyrglnprocysasphisproargglnprocysasp
530535540
sersercysprocysvalilealaglnasnphecysglulysphecys
545550555560
glncysserserglucysglnasnargpheproglycysargcyslys
565570575
alaglncysasnthrlysglncysprocystyrleualavalargglu
580585590
cysaspproaspleucysleuthrcysglyalaalaasphistrpasp
595600605
serlysasnvalsercyslysasncysserileglnargglyserlys
610615620
lyshisleuleuleualaproseraspvalalaglytrpglyilephe
625630635640
ilelysaspprovalglnlysasnglupheileserglutyrcysgly
645650655
gluileileserglnaspglualaaspargargglylysvaltyrasp
660665670
lystyrmetcysserpheleupheasnleuasnasnaspphevalval
675680685
aspalathrarglysglyasnlysileargphealaasnhisserval
690695700
asnproasncystyralalysvalmetmetvalasnglyasphisarg
705710715720
ileglyilephealalysargalaileglnthrglyglugluleuphe
725730735
pheasptyrargtyrserglnalaaspalaleulystyrvalglyile
740745750
gluargglumetgluilepro
755
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>3
atgatatactttattagaat20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>4
tcaagggatttccatttctc20