NKIRAS2基因调控区序列、调控序列及其在鼻咽癌中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及nkiras2基因调控区序列、调控序列及其在鼻咽癌中的应用。

背景技术：

鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma,npc）是东南亚和我国南方地区高发的癌症，放疗为其治疗首选。目前早期npc的5年生存率可达95%以上，然而由于npc早期症状不明显，75%以上的初诊患者被确诊时即为晚期，而局部晚期npc的5年总生存率只有78.4-80%,且有20-30%患者发生局部治疗失败或远处转移。因此研究npc的发生发展机制，探索其中的关键基因，揭示基因上的重要靶点，从而开发相应的特异的检测方法和治疗药物或手段，这对于npc的筛查和诊治具有重要意义。研究表明，mirna（microrna，简写为mir）在包括npc的癌症中表达会出现失调，已被初步证明和癌症的生物行为密切相关，因此是癌症机制研究以及诊治方法和药物开发的重要切入点。

npc和eb病毒(epstein-barrvirus,ebv)感染显著相关，ebv在npc细胞中仅表达少数病毒蛋白，却大量表达mirna。申请人团队前期研究发现ebv产生的mir-bart13即ebv-mir-bart13（bamhi-arightwardtranscript13,bart13）在npc细胞c666-1中高表达，并可分泌到细胞外；mir-bart13在npc患者的血浆中特异高表达，其表达水平与其n分期、临床分期显著正相关，且在放疗完成时降至接近0等医学生物学现象和规律。然而mir-bart13在npc发生发展中的具体分子机制尚未被揭示。经过深入研究，本发明首次阐明了mir-bart13通过靶向抑制nkiras2基因来活化nf-κb信号通路，从而影响npc的增殖和侵袭转移。本发明揭示的nkiras2基因和mir-bart13的具体作用靶点，可以做为npc诊断方法检测靶标和防治药物开发靶点，此外也可以为npc增殖和侵袭转移机制研究以及临床诊治方法和药物开发提供理论基础和应用依据。

技术实现要素：

本发明首次提供了nkiras2基因的一种调控区序列及其调控序列，尤其是ebv的mir-bart13这一调控序列，构建含有调控区序列或调控序列的载体和npc细胞株；在阐明所述调控区序列和调控序列对npc增殖和侵袭转移的影响和具体通路的基础上，提供了在npc中的相关应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的目的之（1）在于提供nkiras2基因调控区序列、包含特定调控区序列的重组病毒载体、包含所述重组病毒载体的细胞以及这三者在npc中的应用，具体如下：

nkiras2基因调控区序列如seqidno:1-4中的任一序列所示，均为7核苷酸序列。其中，seqidno：1和seqidno：3所示的调控区序列的转录序列分别是如seqidno：4和seqidno：2所示的序列。本发明中所述的序列是指核苷酸序列及其衍生物；基因调控区序列主要是指特定区域基因序列本身或该区域转录序列，这些序列需要满足可以受调控分子作用从而调节基因整体的表达水平，如果调控分子为核酸及其衍生物的则称之为调控序列。nkiras2基因调控区序列除了指明的seqidno:1-4中的任一序列这一调控区功能序列外，还可以有其它核苷酸序列及其衍生物，但不能够影响调控区序列和调控序列的相互结合和调节功能的发挥。

以ncbi（nationalcenterforbiotechnologyinformation）上的核酸数据库中的nc_000017.11(登录号)序列为参照，所述调控区序列对应于参照序列的第42025222-42025228且包含两端位点的区域或该区域对应的转录本区域。相应调控序列通过与该调控区序列相互结合从而影响nkiras2基因的表达，该调控区序列改变将影响其与调控序列的相互结合。nkiras2基因的表达产物是通过作用于nf-κb信号通路来影响npc的增殖和侵袭转移的。

鉴于对nkiras2基因调控区序列seqidno:1-4中任一序列的位置、序列本身及基因调节通路和功能的揭示，可遵循分子生物学方法和操作对包含此调控区序列的片段进行扩增，并将所述扩增片段导入到包括病毒在内的载体中获得包含nkiras2基因调控区序列的重组载体，并将所述重组载体导入到细胞（尤其是npc细胞株）中获得包含所述重组载体的细胞。其中采用的载体包含但不限于plvthm慢病毒载体，采用的细胞包含但不限于cne-1，cne-2，6-10b，5-8f，c666-1、np69和sune-1。所构建的载体和细胞可用于鼻咽癌包括增殖和侵袭转移在内的发生发展机制的研究中。

鉴于对nkiras2基因调控区序列seqidno:1-4中任一序列的位置、序列本身及其对npc增值和侵袭转移影响和具体通路的揭示，可以将所述调控区序列、所述包含nkiras2基因调控区序列的重组载体和包含所述重组载体的细胞应用于npc包括增殖和侵袭转移在内的发生发展机制的研究中以及临床筛查、防控、诊断和治疗中；将所述调控区序列做为npc诊断方法检测靶标和防治药物开发靶点中的应用。

本发明的目的之（2）在于提供靶向nkiras2基因调控区序列seqidno:1-4的调控序列、包含所述调控序列的载体、包含所述载体的细胞以及这三者在npc中的应用，具体如下：

靶向nkiras2基因调控区序列seqidno:1-4的调控序列，其序列包含如seqidno：5-6所示的任一序列。本发明所述序列是指核苷酸序列及其衍生物；基因调控区序列主要是指特定区域基因序列本身或该区域转录序列，这些序列需要满足可以受调控分子作用从而调节基因整体的表达水平，如果调控分子为核酸及其衍生物的则称之为调控序列。调控序列除了指明的调控功能序列seqidno：5-6中的任一序列外，还可以有其它核苷酸序列及其衍生物，但不能够影响调控序列对于nkiras2基因调控区序列的结合和调节功能。其中，包含seqidno：5的调控序列可以靶向如权利要求1中所述的nkiras2基因调控区序列seqidno：1和seqidno：2，包含seqidno：6的调控序列可以靶向如权利要求1中所述的nkiras2基因调控区序列seqidno：3和seqidno：4，从而调控nkiras2基因在鼻咽癌细胞内的表达，进而通过nf-κb信号通路影响到鼻咽癌细胞的增殖和侵袭转移。

鉴于对nkiras2基因调控区序列对应的调控序列以及调控区序列和调控序列两者之间调控关系的揭示，可遵循分子生物学方法和操作将所述调控序列导入到包括病毒在内的载体中获得包含所述调控序列的重组载体，并将所述重组载体导入到细胞（尤其是npc细胞株）中获得包含所述重组载体的细胞。其中采用的载体包含但不限于plvthm慢病毒载体，采用的细胞包含但不限于cne-1，cne-2，6-10b，5-8f，c666-1、np69和sune-1。

鉴于对靶向nkiras2基因调控区序列seqidno:1-4的调控序列及其对npc增值和侵袭转移影响和具体通路的揭示，可以将所述调控序列、包含所述调控序列的重组载体和包含所述重组载体的细胞应用于npc包括增殖和侵袭转移在内的发生发展机制的研究中以及临床筛查、防控、诊断和治疗中；将所述调控序列做为npc诊断方法检测靶标和防治药物开发靶点中的应用。

本发明对于nkiras2基因特定调控区序列、调控序列及其对npc尤其是npc增殖和侵袭转移影响和具体通路的揭示，可以将其做为npc诊断方法检测靶标和防治药物开发靶点，此外也可以为npc包括增殖和侵袭转移机制在内的发生发展机制研究以及临床诊治方法和药物开发提供实验基础和理论依据。

附图说明

图1是ebv-mir-bart13在npc中的表达情况。图1a为ebv-mir-bart13在npc细胞中的表达情况；图1b为ebv-mir-bart13在npc组织和正常组织中的表达情况。

图2是ebv-mir-bart13促进npc体外增殖实验结果。图2a为cck8增殖实验，反映ebv-mir-bart13对npc细胞增殖功能的影响；图2b为克隆平板形成实验，反映ebv-mir-bart13对npc细胞克隆增殖能力的影响；图2c为westernblot检测ebv-mir-bart13对增殖蛋白survivin及pcna的影响。

图3是ebv-mir-bart13促进npc在小鼠体内增殖实验结果。图3a为肉眼下观察sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组的裸鼠皮下成瘤情况；图3b为观察不同天数下sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组的裸鼠皮下成瘤体积生长曲线；图3c为肉眼下观察sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组的裸鼠解剖后皮下瘤组织情况；图3d为sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组裸鼠解剖后的瘤组织瘤重比较。

图4是ebv-mir-bart13促进npc体外迁移侵袭实验结果。图4a为细胞划痕实验，反映ebv-mir-bart13对npc细胞的创伤愈合能力的影响；图4b为transwell迁移实验，反映ebv-mir-bart13对npc细胞的迁移能力的影响；图4c为transwell侵袭实验，反映ebv-mir-bart13对npc细胞的侵袭能力的影响。

图5是ebv-mir-bart13促进npc的上皮间质转化实验结果。图5a为相差显微镜观察ebv-mir-bart13对npc细胞形态学的影响；图5b为westernblot实验检测ebv-mir-bart13对上皮间质转化相关蛋白的影响。

图6是ebv-mir-bart13促进npc在小鼠体内转移的实验结果。图6a为活体成像检测系统比较sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组裸鼠肺部转移瘤荧光值大小；图6b为肉眼观察sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组裸鼠察肺组织的肺部转移瘤情况；图6c为肉眼观察比较sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组的肺部转移瘤占比；图6d为比较sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组取肺组织做横断位he染色情况；图6e为he染色比较sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组的肺部转移瘤占比。

图7是nkiras2做为ebv-mir-bart13直接调控靶点的实验结果。图7a为ebv-mir-bart13与nkiras2mrna的3’utr序列的结合部位及突变部位；图7b为双荧光素酶报告系统检测mir-bart13可与nkiras2的3’utr互补结合；图7c为westernblot检测mir-bart13对nkiras2蛋白的影响；图7d为rt-qpcr检测mir-bart13对nkiras2mrna的影响；图7e为rt-qpcr检测鼻咽癌组织中与正常组织中的nkiras2mrna的相对表达量，并分析鼻咽癌组织中mir-bart13与nkiras2mrna表达的相关性。

图8是对nf-κb信号正向通路影响的实验结果。

图9是rescue实验结果。图9a为cck8检测过表达nkiras2对sune-1-bart13细胞增殖的影响；图9b为克隆平板形成实验反映过表达nkiras2对sune-1-bart13细胞克隆形成数目的影响；图9c为细胞划痕实验反映过表达nkiras2对sune-1-bart13细胞的创伤愈合能力的影响；图9d为transwell迁移实验反映过表达nkiras2对sune-1-bart13细胞的迁移能力的影响；图9e为transwell侵袭实验反映过表达nkiras2对sune-1-bart13的侵袭能力的影响；图9g为相差显微镜观察过表达nkiras2对sune-1-bart13细胞形态学的影响；图9h为westernblot检测反映过表达nkiras2对上皮间质转化相关蛋白的影响。

图10是通路的回复实验结果。图10a为westernblot检测反映过表达nkiras2对sune-1-mir-bart13细胞的nf-κb信号通路蛋白的影响。图10b为mir-bart13通过靶向抑制nkiras2活化nf-κb信号通路，从而促进鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和emt的示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本发明实施例中涉及的细胞、组织样本以及基础实验方法和统计方法先行统一阐述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施。

（1）细胞系和组织样本

人鼻咽癌细胞系cne-1，cne-2，6-10b，5-8f、sune-1以及永生化的鼻咽上皮细胞系np69购买于武汉细胞生物学研究所、中国典型培养物保藏中心和中山大学肿瘤防治中心。c666-1鼻咽癌细胞由香港大学的georges.w.tsao教授惠赠，亦可在公共平台和商业化机构中买到。细胞生长于含有10%胎牛血清的roswellparkmemorialinstitute的1640培养基(美国gibco公司)中。此外，从福建医科大学附属肿瘤医院获得了23例冷冻新鲜鼻咽癌组织和18例正常鼻咽上皮组织，入组的鼻咽癌患者活检前未接受任何化疗或放疗。本发明研究经福建省肿瘤医院伦理委员会批准（审批号：＃2015-010-02），并获得每位患者的书面知情同意书。

（2）定量逆转录聚合酶链反应即qrt-pcr

按照说明书操作使用tripure试剂（美国罗氏公司）从细胞和组织中分离总rna，并使用bulge-looptm的microrna特异性rt引物（厦门柏瑞生物科技有限公司）和hifiscriptcdnasynthesiskit（北京康为世纪生物科技有限公司，简称北京康为）将其逆转录成cdna。采用正向引物5'-ggggtgtaacttgccagggac-3'和反向引物5'-tgcgtgtcgtggagtc-3'以及rt引物5'-gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggata

cgactctgtac-3'进行实时荧光定量pcr即qpcr扩增以测定mir-bart13的水平。为了检测nkiras2表达水平，使用hifiscriptcdnasynthesiskit（北京康为）将rna样品逆转录成cdna，定量扩增试剂为ultrasybrmixture（北京康为），扩增仪为美国伯乐公司的cfx96型实时荧光定量pcr仪，扩增引物对为引物5'-actttgctccctctcacctc-3'和引物5'-ggtgactctgcttcctgtct-3'。u6snrna和gapdh被用作内部对照，并且通过2^-δδct方法测量相对表达水平。所有实验都设置三次平行并且至少重复一次。

（3）质粒构建和慢病毒感染

将ebv-mir-bart13（即mir-bart13）和nkiras2的cdna序列克隆到plvthm慢病毒载体中，经扩增和dna序列确认后，将这些重组质粒分别命名为lv-mir-bart13和lv-nkiras2。为了抑制c666-1细胞中的mir-bart13，设计mir-bart13的反义序列并将它们克隆到plvthm慢病毒载体中，经所构建的载体命名为lv-mir-bart13sponge。此外，过表达mir-bart13/nkiras2（lenti-mir-bart13/lenti-nkiras2）和低表达mir-bart13（lenti-mirna-bart13sponge）的慢病毒体系以及各自的慢病毒阴性对照(lenti-vector/lenti-vectorsponge)均由上海的吉凯基因公司设计完成。按照说明书操作，使用polybrene试剂（revg0001，中国上海）让这些慢病毒感染npc细胞。

（4）细胞活力的cck-8测定法和克隆平板形成实验

采用cck8法对细胞活力变动进行测定。将转染的cne-1，sune-1和c666-1细胞系以5×10³，5×10³和1×10⁴个/100μl的细胞的密度接种到96孔板中，并培养24小时，48小时和72小时。前期培养结束时，加入10μl的cck8溶液（日本dojindo公司）后继续培养2小时。之后使用微孔板读数仪（美国bio-rad公司）在450nm处测量每个孔的吸光度值，并以650nm波长下的结果做为参照。为了检测细胞集落形成，在转染的cne-1和sune-1细胞系开展克隆平板形成实验。将细胞以每孔800个的密度接种到六孔板中，然后每三天用新鲜的培养基更新培养14天。实验结束时，将细胞固定在甲醇中，并用0.5％结晶紫溶液染色20分钟；当有50个细胞或更多细胞时，目测计数细胞集落数。

（5）肿瘤细胞划痕、迁移和侵袭实验

利用细胞划痕实验来测定细胞迁移能力变动。将转染的cne-1，sune-1或c666-1细胞接种到6孔板中并生长到约95％至100％的覆盖度。接下来，将细胞在无血清培养基中饥饿24h，然后使用标准的200μl塑料移液器尖端在细胞层上进行划痕。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（pbs）洗涤细胞后，继续培养细胞48小时。使用倒置显微镜下在0小时，24小时和48小时时测量划痕的宽度。采用transwellchambers（美国corning公司）测定肿瘤细胞迁移和侵袭情况。将感染后的5×10⁴个cne-1，2×10⁴或1×10⁵个sune-1和1×10⁵个c666-1细胞接种于具有8μm孔径膜的上室中在含有和不含matrigel试剂（美国bdbiosciences公司）的无血清培养基中培养，而下室则是添加20％fbs的培养基，进行24小时和48小时的细胞培养。实验结束时，使用棉拭子去除留在膜顶部表面的细胞，而迁移或侵入膜相反表面的细胞被固定在10％福尔马林缓冲液中，用0.5％结晶紫溶液处理20分钟并在倒置显微镜下计数。实验至少重复一次。

（6）裸鼠肿瘤细胞移植瘤生长和肺转移瘤模型

本发明研究涉及的动物实验得到了福建省肿瘤医院动物护理和使用委员会（iacuc）的批准。从上海slac实验动物有限公司购买4-7周龄、20-25g体重的雌性balb/c裸鼠。对于裸鼠移植瘤模型，将稳定表达mir-bart13或阴性对照的sune-1细胞皮下注射到小鼠背侧区（含1×10⁶个细胞的200μlpbs）。每天监测移植瘤，并且每三天测量一次大小。15天时处死小鼠并解剖移植瘤，称重并进行组织处理和he染色后进行组织学观察。

对于裸鼠肿瘤的肺转移，将稳定表达mir-bart13-荧光素酶或阴性对照感染的sune-1细胞注射到小鼠尾静脉（含5x10⁵个细胞的100μlpbs）中。五周后，将体内级的vivoglotm萤光素（美国promega公司）以150mg/kg量注射到每只小鼠的腹腔中，并且使用caliperivisluminaii（美国caliperlifesciences公司）测定小鼠肺的发光值。之后，将小鼠处死以切除肺组织，并在10％福尔马林中固定，组织处理，石蜡包埋和切片。取5μm厚的组织切片进行he染色。计算每只小鼠肺中大和微转移病灶的存在并取平均值。

（7）萤光素酶报告实验

将3'-utr野生型和突变型的nkiras2基因的cdna进行pcr扩增并利用xhoi和noti位点分别将其克隆入pgl4萤光素酶质粒（美国promega公司）中。扩增并确认克隆序列后，将这些质粒转移到sune-1细胞中进行荧光素酶测定。也就是将细胞接种到6孔板中过夜培养，然后与2μg携带nkiras2基因3'-utr野生型或突变型的pgl4质粒、以及mir-bart13或使用x-tremegenehp试剂（美国roche公司）的mir-ctrl共转染24h。然后进行蛋白提取，并使用dual-luciferasereporterassaysystem（美国promega公司）和微孔板读数器（瑞士tecaninfinite公司）进行荧光素酶活性测定。每个实验设三个平行，至少重复一次。

（8）westernblot实验

使用millipore（美国billerica公司）的蛋白质提取试剂盒提取总细胞蛋白和核蛋白。根据文献方法（xuy,linz,zongj,yey,gangc,chenyetal.decreasedexpressionofthenkg2dligandulbp4maybeanindicatorofpoorprognosisinpatientswithnasopharyngealcarcinoma.oncotarget2017;8:42007-42019.）进行蛋白质印迹。所使用的抗体针对人pcna（＃13119），存活蛋白（＃2808t），vimentin（＃5741t），n-钙粘蛋白（＃13116t），zeb1（＃3396t），zo-1（＃13663），iκbɑ（＃4812s），p-nf-κb（p65）（＃3033s）actin（＃4967）和tubulin（＃15115）均来自美国cellsignalingtechnology公司，e-cadherin（ab15148），nkiras2（ab92333），ikkβ（ab32135），nf-κb（p65）来自美国abcam公司，iκbβ（sc-74451）或ikkɑ（sc-130153）的全长cdna（ab32536），gapdh（ab181602），laminb1（ab16048），均来自美国santacruzbiotechnology公司。β-肌动蛋白，微管蛋白，gapdh和laminb1用作蛋白质上样对照。

（9）统计学方法

所有数据表述为平均值±标准偏差（sd），并使用spss17.0软件（spss，chicago，il，usa）进行t检验，而spearman相关性检验用于分析mir-bart13与nkiras2在组织标本中的表达量的关联性。p值<0.05表示显著的统计学意义。

实施例1

利用cck8法、克隆平板形成实验、细胞划痕、transwell迁移及transwell侵袭实验检测cne-1或sune-1细胞稳定过表达mir-bart13或c666-1细胞稳定下调mir-bart13后对npc细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响；通过细胞形态学变化观察mir-bart13表达对npc细胞emt的影响；通过westernblot检测mir-bart13表达对npc细胞增殖、侵袭转移和emt相关分子蛋白的影响。具体结果如下：

图1a显示mir-bart13在eb病毒感染的c666-1鼻咽癌细胞中高表达，在非eb病毒感染的鼻咽癌细胞中成低表达或不表达；图1b显示鼻咽癌组织中的mir-bart13明显较正常鼻咽黏膜上皮组织高。因此图1实验表明ebv-mir-bart13在eb病毒感染的鼻咽癌细胞和鼻咽癌组织中表现为高表达。

图2a显示通过cck8检测，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，促进了鼻咽癌细胞的增殖，而c666-1细胞下调mir-bart13后，抑制了鼻咽癌细胞的增殖；图2b显示通过平板克隆形成实验，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后鼻咽癌细胞克隆形成数增多；图2c显示通过westernblot检测，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，使survivin和pcna蛋白表达增高，而c666-1细胞下调mir-bart13后，使survivin和pcna蛋白表达降低（*p<0.05;**p<0.01；***p<0.001）。因此图2实验表明ebv-mir-bart13促进鼻咽癌细胞的体外增殖。

图3a显示通过肉眼观察sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组的裸鼠皮下成瘤情况；图3b显示通过体积生长曲线，发现15天后sune-1-bart13组皮下成瘤体积较对照组大；图3c显示通过肉眼观察sune-1-bart13组和sune-1-ctrl组的裸鼠解剖后皮下瘤组织情况；图3d显示通过对解剖后的瘤组织瘤重的称量，发现15天后sune-1-bart13组皮下成瘤重量较对照组重（**p<0.01）。因此图3实验表明ebv-mir-bart13促进鼻咽癌细胞的体内增殖。

图4a显示通过细胞划痕实验，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，促进了鼻咽癌细胞的创伤愈合能力，而c666-1细胞下调mir-bart13后，抑制了鼻咽癌细胞的创伤愈合能力；图4b显示通过transwell迁移实验，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，促进了鼻咽癌细胞的迁移能力，而c666-1细胞下调mir-bart13后，抑制了鼻咽癌细胞的迁移能力；图4c显示通过transwell侵袭实验，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，促进了鼻咽癌细胞的侵袭能力，而c666-1细胞下调mir-bart13后，抑制了鼻咽癌细胞的侵袭能力（*p<0.05;**p<0.01；***p<0.001）。因此图4实验表明ebv-mir-bart13促进鼻咽癌细胞的体外迁移侵袭。

图5a显示通过相差显微镜观察，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，可使鼻咽癌细胞从聚集立体状变为纤细分散状，而c666-1细胞下调mir-bart13后，可使鼻咽癌细胞从纤细毛刺状变为类椭圆状；图5b显示通过westernblot实验，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，可使e-cadherin蛋白降低，vimentin、n-cadherin和zeb1蛋白升高，而c666-1细胞下调mir-bart13后，可使上述蛋白出现相反的变化。因此图5实验表明ebv-mir-bart13促进鼻咽癌细胞的emt进程。

实施例2

通过体内裸鼠皮下成瘤实验，分别将对照组细胞（sune-1-ctrl）和实验组细胞（sune-1-bart13）各1×10⁶个细胞（200ul）种植于裸鼠右腋下，每组各8只，每隔三天测量肿瘤体积，连续观察15天，最后解剖取瘤组织并称重，观察mir-bart13过表达对裸鼠皮下成瘤的肿瘤体积和重量的影响。通过体内裸鼠尾静脉肺转移实验，分别将带有荧光素酶报告基因的真核表达重组质粒plv-mcherry-luc包装入慢病毒并感染人的鼻咽癌稳转细胞株sune-1-ctrl和sune-1-bart13，利用puro筛选，获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆（sune-1-ctrl-luc和sune-1-ctrl-luc），然后分别将此对照组和实验组细胞各5×10⁵个细胞（100ul）经尾静脉注射，每组各8只，5周后，将每只裸鼠戊巴比妥钠麻醉，按150mg/kg体重的量腹腔注射luciferin，通过活体成像系统，比较两组肺部转移瘤的荧光值大小；另解剖取肺组织，通过肉眼及he染色观察，观察两组肺部转移瘤占比情况。具体结果如下：

图6a显示通过活体成像检测系统，sune-1-bart13组裸鼠肺部转移瘤荧光值较sune-1-ctrl组高；图6b显示肉眼观察肺组织的肺部转移瘤情况；图6c显示通过肉眼观察，sune-1-bart13组的肺部转移瘤占比较sune-1-ctrl组高；图6d显示取肺组织做横断位he染色情况；图6e显示通过he染色，也表明sune-1-bart13组的肺部转移瘤占比较sune-1-ctrl组高(*p<0.05;***p<0.001）。因此图6实验表明ebv-mir-bart13促进鼻咽癌细胞的体内转移。

实施例3

利用生物信息学软件预测结合细胞蛋白质谱检测行交叉分析，发现nkiras2可能为mir-bart13可能直接调控的且与增殖、转移密切相关的靶基因。首先，将targetscan和miranda生物信息学软件预测的靶基因进行交叉分析，结果显示mir-bart13可能直接作用的靶mrna有257个；其次，通过对c666-1-bart13sponge细胞和对照组c666-1-vectorsponge细胞进行itraq检测，结果表明c666-1-bart13sponge细胞较对照组出现上调的蛋白有290个，出现下调的蛋白有255个；最后，将生物软件预测的靶基因与细胞蛋白质谱的结果再进行交叉分析，发现只有7个可能的靶基因。通过查阅文献，其中只有4个可能靶基因被报道具有抑制肿瘤侵袭转移功能，分别为nkiras2、cbl、ppm1a、abi2。

4个可能的靶基因需要在c666-1细胞中予以进一步的验证。rt-qpcr检测结果表明，c666-1-bart13sponge细胞中的mrna表达水平较c666-1-vectorsponge细胞高的靶基因只有nkiras2（p<0.05），而两组细胞中的cbl、ppm1a、abi2的mrna水平差异无统计学意义。进一步对两组细胞中的nkiras2的蛋白表达含量予以westernblot检测，结果表明c666-1-bart13sponge细胞中的nkiras2蛋白的表达含量仍较高。由此表明mir-bart13对nkiras2具有下调作用。

进一步的，利用rt-qpcr、westernblot和双荧光素酶报告系统进行靶点的相关验证，并利用rt-qpcr分析23例鼻咽癌组织中mir-bart13与nkiras2的相关性。利用westernblot验证cne-1或sune-1细胞稳定过表达mir-bart13或c666-1细胞稳定下调mir-bart13后对nkiras2所介导的nf-κb信号通路的影响。结果如下：

图7a显示ebv-mir-bart13与nkiras2mrna的3’utr序列的结合部位及突变部位；图7b显示通过双荧光素酶报告系统检测，mir-bart13可与nkiras2的3’utr野生型序列相结合，从而减弱荧光素酶活性，而当nkiras2的3’utr点突变后，荧光素酶活性得到显著性地回补；图7c显示通过westernblot检测，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，可使nkiras2蛋白降低，而c666-1细胞下调mir-bart13后，可使其蛋白上调；图7d显示通过rt-qpcr检测，c666-1细胞下调mir-bart13后，可使nkiras2的mrna上调；图7e显示通过rt-qpcr检测，npc中的nkiras2的mrna比正常组织的低，且鼻咽癌组织中的mir-bart13与nkiras2mrna表达成负相关（*p<0.05;**p<0.01；***p<0.001）。

图8显示通过westernblot检测，cne-1或sune-1细胞过表达mir-bart13后，可使iκbɑ、iκbβ蛋白表达下调，磷酸化nf-κb(p65)及细胞核nf-κb(p65)蛋白表达升高，从而活化nkiras2介导的nf-κb信号通路；而c666-1下调mir-bart13后，可使上述蛋白出现相反的变化。但无论如何，mir-bar13对ikkɑ和ikkβ蛋白均无影响。综上可知，nkiras2是ebv-mir-bart13直接调控的靶点，ebv-mir-bart13可活化鼻咽癌细胞的由nkiras2介导的nf-κb信号通路。

实施例4

通过rescue实验，利用cck8法、克隆平板形成实验、细胞划痕、transwell迁移及transwell侵袭实验检测过表达nkiras2对sune-1-bart13细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响；通过细胞形态学变化观察过表达nkiras2对sune-1-bart13细胞emt的影响；通过westernblot检测过表达nkiras2对sune-1-bart13细胞增殖、侵袭转移和emt相关分子蛋白的影响；通过westernblot检测sune-1-bart13细胞过表达nkiras2对nf-κb信号通路的影响。结果如下：

图9a显示通过cck8检测，过表达nkiras2可抑制sune-1-bart13的增殖；图9b显示通过克隆平板形成实验，过表达nkiras2可使sune-1-bart13细胞克隆形成数目减少；图9c显示通过细胞划痕实验，过表达nkiras2可减弱sune-1-bart13的创伤愈合能力；图9d显示通过transwell迁移实验，过表达nkiras2可减弱sune-1-bart13的迁移能力；图9e显示通过transwell侵袭实验，过表达nkiras2可减弱sune-1-bart13的侵袭能力；图9g显示通过相差显微镜观察，过表达nkiras2可使sune-1-bart13细胞从纤细分散状变为聚集立体状；图9h显示通过westernblot检测，过表达nkiras2可使e-cadherin蛋白升高，n-cadherin、vimentin及zo-1蛋白降低。因此图9实验表明过表达nkiras2可抑制sune-1-bart13细胞增殖、迁移、侵袭和emt进程。

图10a显示通过westernblot检测，过表达nkiras2可使sune-1-mir-bart13细胞的iκbɑ、iκbβ蛋白表达上调，磷酸化nf-κb(p65)及细胞核nf-κb(p65)蛋白表达降低，但对ikkɑ和ikkβ蛋白仍无影响，从而减弱nf-κb信号通路。图10b为mir-bart13通过靶向抑制nkiras2活化nf-κb信号通路，从而促进鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和emt的示意图。图中示mir-bart13可通过直接下调nkriras2，使得iκbɑ、iκbβ蛋白表达下调，进而使nf-κb-p65蛋白入核增多，导致nf-κb信号通路活化，而非通过影响ikkɑ和ikkβ蛋白而导致iκbɑ、iκbβ蛋白表达下调。因此图10实验表明过表达nkiras2可减弱sune-1-mir-bart13细胞的nf-κb信号通路活化。

综上可知，本发明提供了nkiras2基因调控区序列，并充分揭示了该调控区序列可被如mir-bart13的调控序列调节，从而作用于nf-κb信号通路，最终影响鼻咽癌的增殖和侵袭转移，这些可以为npc发生发展机制的探究和临床诊治的应用等提供依据和奠定基础。

虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>福建省肿瘤医院（福建省肿瘤研究所、福建省癌症防治中心）

<120>nkiras2基因调控区序列、调控序列及其在鼻咽癌中的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>7

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>1

aagttac7

<210>2

<211>7

<212>rna

<213>智人(homosapiens)

<400>2

aaguuac7

<210>3

<211>7

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>3

ttcaatg7

<210>4

<211>7

<212>rna

<213>智人(homosapiens)

<400>4

uucaaug7

<210>5

<211>7

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ttcaatg7

<210>6

<211>7

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aagttac7