本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及适用于毛细管电泳检测技术的一组水稻ssr分子标记及其应用。
背景技术：
水稻是我国最重要的粮食作物之一，其播种面积和总产量均居粮食作物首位。全国约60％的人口以大米为食。我国丰富的稻种资源是稻作研究和生产上的一大优势，经过80多年的育种实践，已培育出5000多份水稻品种并在生产中推广应用。对水稻品种的鉴定、遗传多样性分析及dna指纹数据库的构建，可以客观、全面了解当前水稻品种现状，对于品种管理、品种选育以及种质资源收集和保护具有重要意义。
随着分子生物技术的发展，分子标记种类和检测手段日趋完善，各种分子标记已经广泛应用于水稻遗传多样性研究中。众多分子标记中，简单重复序列(simplesequencerepeats,ssr)标记因具有简便、快捷、重复性高、多态性高、共显性标记等优点而被广泛应用。传统的ssr操作通过聚丙烯酰胺凝胶电泳配合其他一些生物技术来进行基因的多态性分析，这些方法非自动化、耗时，不同等位变异难以准确识别、不同批次反应数据难以统一处理。
荧光标记毛细管电泳检测技术因具有高效、自动化的优点，在多种植物分子标记研究中显示出极为广阔的应用前景。该方法采用几种不同颜色的荧光染料标记ssr引物，再将不同荧光标记、扩增片段长度有差异的pcr产物和标准分子量样品在同一泳道中进行电泳。通过图像采集和分析，可精确计算出等位变异扩增片段的大小，实现了ssr标记与高效、自动化技术的结合。在这个技术过程中，如何找出不同荧光标记的引物，并进行组合、且pcr产物长度有差异、能有效准确分辨产物大小，是ssr的关键技术环节。
技术实现要素：
本发明的目的是提供适用于毛细管电泳检测技术的一组水稻ssr分子标记。
为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的水稻材料，对相应材料的水稻基因组进行测序并比较。本发明提供了一组适用于毛细管电泳检测技术的水稻ssr分子标记，所述分子标记为以下13个ssr分子标记的一个或多个，13个ssr分子标记分别为rm3414，rm1347，rm1319，rm215，rm7365，rm1365，rm536，rm235，rm5，rm297，rm515，rm283，rm332。
所述13个ssr分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：seqidno.1-2，seqidno.3-4，seqidno.5-6，seqidno.7-8，seqidno.9-10，seqidno.11-12，seqidno.13-14，seqidno.15-16，seqidno.17-18，seqidno.19-20，seqidno.21-22，seqidno.23-24，seqidno.25-26。
本发明提供了用于扩增上述ssr分子标记的特异性引物，其为一下任一对：seqidno.1-2，seqidno.3-4，seqidno.5-6，seqidno.7-8，seqidno.9-10，seqidno.11-12，seqidno.13-14，seqidno.15-16，seqidno.17-18，seqidno.19-20，seqidno.21-22，seqidno.23-24，seqidno.25-26。
本发明提供了上述水稻ssr分子标记在构建水稻品种dna指纹数据库中的应用。
本发明提供了上述水稻ssr分子标记在水稻种质资源遗传多样性分析中的应用。
本发明提供了上述水稻ssr分子标记在水稻鉴定中的应用。
本发明提供了上述水稻ssr分子标记在水稻分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供了上述水稻ssr分子标记在制备水稻基因组芯片中的应用。
本发明提供了含有上述水稻ssr分子标记的水稻基因组芯片。
本发明提供了上述水稻ssr分子标记在区分水稻北稻7和龙粳29品种中的应用。
以上所述的应用，包括以下步骤：
1)提取待测水稻样品的dna；
2)以步骤1)提取的dna为模板，利用上述ssr分子标记，进行pcr扩增；
3)采用毛细管电泳系统检测pcr产物。
上述应用的步骤2)中，pcr扩增采用20μl的反应体积，含dntp0.25mm，正向引物、反向引物各0.4μm，taqdna聚合酶1.0单位，1×pcr缓冲液(不含mg2+)，mgcl21.5mm，样品dna10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
进一步地，本发明提供了用于区分水稻北稻7和龙粳29品种的试剂盒，其含有针对本发明的13个水稻ssr分子标记的特异性引物组合。优选地，所述特异性引物组合的核苷酸序列分别如seqidno.1-26所示。
本发明提供的上述13对ssr引物可以在荧光毛细管电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，每对引物的其中一条的5'端标记荧光基团；配制pcr反应体系加入dna、引物、dntp、mgcl2、taq酶、buffer；运行反应程序；扩增产物在荧光毛细管电泳系统上检测；利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。
优选地，将本发明的13对特异性ssr引物进行荧光染料标记，共选用了pet、ned、vic、fam四种荧光染料。将荧光标记的pcr产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μl加入0.5μllz500分子量内标和8.5μl去离子甲酰胺加入到dna分析仪专用深孔板中；然后将其在pcr仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到dna分析仪上进行毛细管电泳检测。用genemapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标lz500进行比较，直接给出目标dna片段的准确大小。
在本发明的实施例的一个较佳实施方案中，fam荧光标记组的ssr分子标记为rm3414、rm1347、rm1319；vic荧光标记组的ssr分子标记为rm215、rm7365、rm1365、rm536；ned荧光标记组的ssr分子标记为rm235、rm5、rm297、rm515；pet荧光标记组的ssr分子标记为rm283、rm332。以水稻北稻7dna为模板，分别用fam、vic、ned、pet荧光标记的四组引物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以北稻7的dna为模板，用fam、vic、ned、pet荧光标记的全部引物混合物进行毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与fam、vic、ned、pet四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1)，可以看到，在fam、vic、ned、pet单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物组合(共13对引物)可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。以水稻龙粳29dna为模板进行相同的实验，可得到相同的结论(图2)。
实施例中分别以北稻7和龙粳29dna为模板，用fam、vic、ned、pet荧光标记引物组合进行一次性毛细管电泳，分别得到北稻7和龙粳29的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，北稻7在122bp和163bp出现fam蓝色峰，龙粳29在115bp和163bp处出现fam蓝色峰；北稻7在128bp和148bp出现vic绿色峰，龙粳29在132bp和150bp出现vic绿色峰；北稻7在95bp和111bp出现ned黄色峰，龙粳29在98bp和106bp出现ned黄色峰；北稻7在157bp和170bp出现pet红色峰，龙粳29在149bp和164bp出现pet红色峰。北稻7及龙粳29的每个荧光标记出现的峰均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明专利提供的荧光标记引物组合可在一次毛细管电泳中区分水稻北稻7和龙粳29。
本发明的不同荧光标记的扩增产物可在同一泳道中进行电泳，其信号清晰，扩增片段大小差异明显，可精确计算片段大小，每个dna样品电泳峰型各异，易于判断。具有灵敏度高、分辨力好，结果准确可靠、高效快速等优点。用本发明提供的引物组合，可方便快速地将水稻北稻7和龙粳29品种区分开，实现了节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势。本发明提供的该组引物可用于水稻指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。
附图说明
图1a-图1d分别为水稻品种北稻7ssr荧光标记毛细管电泳图，其中，图1a为北稻7经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经fam标记引物电泳结果的比较。图1b为北稻7经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经vic标记引物电泳结果的比较。图1c为北稻7经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经ned标记引物电泳结果的比较。图1d为北稻7经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经pet标记引物电泳结果的比较。各图比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的dna指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。
图2a-图2d为水稻龙粳29的ssr荧光标记毛细管电泳检测结果。其中，图2a为龙粳29经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经fam标记引物电泳结果的比较。图2b为龙粳29经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经vic标记引物电泳结果的比较。图2c为龙粳29经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经ned标记引物电泳结果的比较。图2d为龙粳29经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经pet标记引物电泳结果的比较。各图的比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的dna指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。图1a-图1d和图2a-图2d均为了说明同一个目的，两个品种(北稻7和龙粳29)的实验结果更能说明本申请提供的引物组合的实用性与可靠性。
图3为用本申请提供的13个水稻ssr分子标记对水稻品种北稻7和龙粳29进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。结果说明，北稻7(上图)显示的fam目的峰(蓝色)与龙粳29(下图)显示的fam目的峰(均用箭头标出)清晰可辨，且目的峰分子量不同。同理，两个品种显示的vic、ned、pet目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本专利提供的引物组合能够对水稻北稻7及龙粳29进行品种区分。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
若未特别说明，本发明实施例所用生化试剂均为市售，所用水稻材料均为本领域公知公用的水稻。
实施例1水稻ssr分子标记及引物的确定
取36个水稻品种进行ssr引物筛选。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从800对ssr引物(http://www.gramene.org/)选出位点可扩增，带型清晰，多态性较高的引物作为可选引物。根据可选引物在36个品种中等位基因的分子量范围、pic值等，即每个组合由尽可能多的引物组成，组内所有引物等位基因范围不叠加的条件，组成四个引物组合并分别合成带fam、vic、ned、pet荧光基团的引物。见表1。本领域技术人员能够理解，本领域内还可选择包括fam、vic、ned、pet在内的其他荧光基团来修饰表1中的四组引物，只要每组内引物标记相同的荧光基团即可，不限于选择哪一种荧光基团。
表1水稻ssr毛细管电泳引物及引物组合
实施例2利用本发明提供的ssr分子标记区分水稻品种
(1)dna快速提取
采用碱煮法对水稻种子进行dna提取。此方法操作快速简便，无有毒有害试剂，适用于植物分子生物学领域的dna制备，而且对大幅度缩短种子纯度检验、转基因检测时间，提高检测效率，降低检测成本具有重要意义。具体操作步骤为：取水稻种子若干粒，置于1.5ml离心管中；在离心管中加入400μlnaoh(1m)，确保将种子完全浸泡，沸水浴5min；在离心管中加入200μltris-hcl(1m，ph8.0)，沸水浴1min；加入200μlte缓冲液(ph8.0)，充分溶解后备用。
(2)dna样品的质量和数量
在紫外分光光度仪上检测dna样品260nm和280nm的od值，选择od260/280值为1.8-1.9的样品用于检测。
(3)核心引物选择
通过分析引物在染色体上的分布、多态性水平、pcr扩增稳定性和扩增产物带型，选择实施例1确定的能够满足毛细管荧光检测技术的引物，具体见表1。
(4)毛细管电泳检测
将筛选出的特异性ssr引物进行荧光染料标记，共选用pet、ned、vic、fam四种荧光染料。将荧光标记的pcr产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μl加入0.5μllz500分子量内标和8.5μl去离子甲酰胺加入到dna分析仪专用深孔板中；然后将其在pcr仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到dna分析仪上进行毛细管电泳检测。用genemapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统根据目标峰的位置与同一泳道中的内标lz500进行比较，直接给出目标dna片段的准确大小。表1中各组引物扩增水稻北稻7和龙粳29所得的扩增产物的目的条带大小见表2。
表2水稻北稻7及龙粳29的差异峰条带及大小
(5)引物组合的判定
以水稻北稻7dna为模板，分别用fam、vic、ned、pet荧光标记的四组引物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以北稻7dna为模板，用fam、vic、ned、pet荧光标记的全部引物混合物进行毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与fam、vic、ned、pet四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1a-图1d)，可以看到，在fam、vic、ned、pet单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物混合物可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。以水稻龙粳29dna为模板进行相同的实验，可得到相同的结论(图2a-图2d)。
(6)北稻7和龙粳29品种的区分
实施例中分别以北稻7和龙粳29dna为模板，用fam、vic、ned、pet荧光标记引物组合(见表1)进行一次性毛细管电泳，分别得到北稻7和龙粳29的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，北稻7在122bp和163bp出现fam蓝色峰，龙粳29在115bp和163bp处出现fam蓝色峰；北稻7在128bp和148bp出现vic绿色峰，龙粳29在132bp和150bp出现vic绿色峰；北稻7在95bp和111bp出现ned黄色峰，龙粳29在98bp和106bp出现ned黄色峰；北稻7在157bp和170bp出现pet红色峰，龙粳29在149bp和164bp出现pet红色峰。北稻7及龙粳29的每个荧光标记出现的峰均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明专利提供的荧光标记引物组合(表1)可在一次毛细管电泳中区分水稻北稻7和龙粳29。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所
<120>适用于毛细管电泳检测技术的一组水稻ssr分子标记及其应用
<130>khp181112463.7
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