本发明涉及一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
双孢蘑菇（agaricusbisporus），中文别名为蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇。其含有丰富的蛋白质、多糖、维生素、核苷酸和不饱和脂肪酸，不仅营养丰富，肉质肥美，味道鲜美，而且热能低，具有很高的医疗保健作用，日益受到各国人民的喜爱。据中国食用菌学会统计，2015年全国双孢蘑菇总产量达337多万吨，其中双孢蘑菇工厂化日产达到417吨，说明双孢蘑菇在国内越来越受消费者们的青睐。
随着双孢蘑菇的种植业发展迅速，不仅和他们的栽培工艺先进有关，还和他们有适合本国工厂化生产的菌种有关。as2796是我国首次通过杂交育种的方法培养的双孢蘑菇新品种，并成为我国唯一的当家品种。但是，国内双孢蘑菇的工厂化品种大部分是进口国外的。没有真正的完全适合国内生产工艺的工厂化品种。这主要是因为双孢蘑菇育种者们对分离双孢蘑菇同核不育单孢菌株没有完全破解，制约了双孢蘑菇杂交育种的进程。通常育种者都是将收集到的担孢子进行出菇，如果不能出菇者将其视为单孢不育菌株。这个过程繁琐耗时耗力，并且不能判定得到的单孢菌株的交配型。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的引物，所述引物包括：
aba1f1：atcgtcgcaagggtaggtaaga；
aba1r1：atttactgagccgtcggaagag。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法，提取双孢蘑菇的基因组dna，然后以引物aba1f1和引物aba1r1进行pcr扩增，所得pcr扩增产物用内切酶进行酶切，接下来通过1-2%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物；
aba1f1：atcgtcgcaagggtaggtaaga；
aba1r1：atttactgagccgtcggaagag。
优选的技术方案为：所述pcr扩增反应的体系为：50ng/μl双孢蘑菇的基因组dna0.5μl，10μmol/l的引物2μl，0.1mmol/ldntp2μl，高保真酶pfu0.5μl，5μl的pcr缓冲液，用ddh2o补齐至50μl。
优选的技术方案为：所述pcr扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。
优选的技术方案为：酶切反应条件为：（1）a+因子的内切酶为0.5μl，a-因子的内切酶为0.5μl，mbuffer2μl，pcr扩增产物6μl，ddh2o为11μl，总体积是20μl，37℃温育3小时；酶切产物用1-2%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照；（2）a+因子的内切酶0.5μl，mbuffer2μl，pcr扩增产物6μl，ddh2o为11.5μl，总体积是20μl，37℃温育3小时，酶切产物用1-2%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照；（3）a-因子的内切酶为0.5μl，mbuffer2μl，pcr扩增产物6μl，ddh2o为11.5μl，总体积是20μl，37℃温育3小时，酶切产物用1-2%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照。
优选的技术方案为：如果pcr扩增产物只能被a+因子的内切酶酶切，则此菌株是同核不育单孢菌株的a+因子的交配型；如果pcr扩增产物只能被a-因子的内切酶酶切，则此菌株是同核不育单孢菌株的a-因子的交配型，如果pcr扩增产物既能被a+因子的内切酶酶切，也能被a-因子的内切酶酶切，则此菌株是双核体菌株。
优选的技术方案为：a+因子的内切酶选自内切酶bsahi、btsai、bsmi、bsphi、ecorv、styi、ndei、bani、bani、bpmi；a-因子的内切酶选自内切酶xmni、drdi、tsoi、tlii、arai、smli、xhoi、bsobi、paer7i、bmet110、pshai、spei、baegi、bsp1286i、bme1580i、sapi、bspqi、sfci。
优选的技术方案为：a+因子的内切酶为内切酶ecorv，a-因子的内切酶为内切酶xhoi、bmet110i或spei。
优选的技术方案为：提取双孢蘑菇的基因组dna的方法包括下列步骤：用孢子收集器将成熟双孢蘑菇子实体上的孢子收集后，用ddh2o稀释成105cfu/ml浓度的孢子悬浮液，再取100μl孢子悬浮液涂布在pda平板上，再将在pda平板上长出来的单菌落转移到新的pda平板上，培养结束后直接挑取菌丝放在dna裂解液中，在80℃进行温浴5min后即得。
优选的技术方案为：提取双孢蘑菇的基因组dna的方法包括下列步骤：将双孢蘑菇菌株的菌丝在液体pda中25℃培养5-7天，收集菌丝，然后用质量浓度为1.5%的溶壁酶进行酶切，酶解温度为30℃，酶解时间是3h；将获得的原生质体用0.6m的甘露醇进行洗涤收集，将获得的原生质体稀释成105cfu/ml浓度的孢子悬浮液，再取100μl孢子悬浮液涂布在pda平板上，25℃培养；将原生质体萌发的单菌落菌丝放在dna裂解液中，在80℃进行温浴5min后即得。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明针对双孢蘑菇单孢不育菌株筛选难和鉴定不育交配型难两个问题，针对双孢蘑菇的交配型a因子基因组序列，首先筛选到了一段特异性的基因序列，根据筛选到的基因序列的snp位点设计酶切位点，利用酶切的方式对特殊序列进行酶切，能够区别具有不同交配型的单孢不育菌株的方法及其在双孢蘑菇育种中的应用。
附图说明
图1利用酶切的方法区分双孢蘑菇同核不育菌株的酶切图谱。
图2酶切法筛选孢子同核不育菌株电泳图。
图3原生质体菌株的酶切电泳图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例一：一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法
本发明基于分子标记技术，建立一个简单快速鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法。
本发明是基于双孢蘑菇的交配型基因a因子序列，对双孢蘑菇的交配型基因的特征片段进行pcr扩增，扩增引物是seq.no.1和seq.no.2，扩增获得的特征片段在不同交配型的单核体中的长度分别是737bp和730bp，长度为737bp的命名为a+因子，其序列如seq.no.4所示；长度为730bp的命名为a-因子，其序列如seq.no.3所示；。
两个单核体的a+和a-因子进行序列比对，发现它们只有在snp位点上有差异。根据这些位点不同，a因子的两个序列的酶切位点不同，根据不同的内切酶位点进行酶切，根据酶切的图谱差异，筛选单核体菌株及其鉴别单核体的交配型。
这些不同的位点从a+因子到a-因子位子分别是：t93-a93,c127-g127,t170-c169,t177-g174,t229-c229,g241a242-a241t242,t258-g257,a333-g331,c392-g392,a417t419-c411c413,g483c485a486-a489t491g492,g499-a505,c504-t510,g527a528-c518t519,c533t534-a524a525,-/-g562,t570-a578。
a+因子序列特有的酶切位点有：bsahi90,btsai126,bsmi173,bsphi237,ecorv256,styi259,ndei336,bani483,bpmi486;a-特有的酶切位点有：xmni193,drdi233,tsoi271,tlii/arai/smli/xhoi/bsobi/paer7i326,bmet110327,pshai389,spei417,baegi/bsp1286i/bme1580i494,sapi/bspqi524,sfci575。
对a+因子特异性片段进行酶切，其中内切酶bsahi酶切的特异性片段大小为90bp和640bp，btsai酶切特异性片段的大小为126bp和604bp,bsmi酶切特异性片段的大小为173bp和557bp；bsphi酶切特异性片段的大小为237bp和493bp；ecorv酶切特异性片段的大小为256bp和474bp；styi酶切特异性片段的大小为259bp和471bp；ndei酶切特异性片段的大小为336bp和394bp；bani酶切特异性片段的大小为247bp和483bp；bani酶切特异性片段的大小为336bp和394bp；bpmi酶切特异性片段的大小为247bp和483bp。
对a-因子特异性片段进行酶切，其中内切酶xmni酶切的特异性片段大小为193bp和543bp，drdi酶切特异性片段的大小为233bp和503bp；tsoi酶切特异性片段的大小为271bp和465bp；tlii/arai/smli/xhoi/bsobi/paer7i酶切特异性片段的大小为326bp和410bp；bmet110酶切特异性片段的大小为327bp和409bp；pshai酶切特异性片段的大小为389bp和347bp；spei酶切特异性片段的大小为417bp和319bp；baegi/bsp1286i/bme1580i酶切特异性片段的大小为242bp和494bp；sapi/bspqi酶切特异性片段的大小为212bp和524bp；sfci酶切特异性片段的大小为161bp和575bp。
利用获得的a+和a-因子序列上的酶切位点的不同，分别进行内切酶的组合，然后对pcr扩增获得的pcr产物进行酶切，再将获得的酶切产物5μl，进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，观察酶切的结果。
所述的pcr扩增条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保存。反应体系是：50ng/μl基因组dna0.5μl,10μmol/l的引物2μl，0.1mmol/ldntp2μl,保真性酶0.5μl，5μl的pcr缓冲液，用ddh2o补齐至50μl。
所述的酶切条件是：内切酶a为0.5μl，内切酶b为0.5μl，内切酶buffer为2μl,pcr产物6μl，ddh2o11μl，总体积是20μl，37℃温育3小时。
将此方法应用到筛选孢子单核体菌株及其区别它们的交配型和筛选原生质体同核不育菌株及其区别它们的交配型中。
一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的引物，所述引物包括：
aba1f1：atcgtcgcaagggtaggtaaga；
aba1r1：atttactgagccgtcggaagag。
一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法，提取双孢蘑菇的基因组dna，然后以引物aba1f1和引物aba1r1进行pcr扩增，所得pcr扩增产物用内切酶进行酶切，接下来通过1-2%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物；
aba1f1：atcgtcgcaagggtaggtaaga；
aba1r1：atttactgagccgtcggaagag。
优选的实施方式为：所述pcr扩增反应的体系为：50ng/μl双孢蘑菇的基因组dna0.5μl，10μmol/l的引物2μl，0.1mmol/ldntp2μl，高保真酶pfu0.5μl，5μl的pcr缓冲液，用ddh2o补齐至50μl。
优选的实施方式为：所述pcr扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。
优选的实施方式为：酶切反应条件为：（1）a+因子的内切酶为0.5μl，a-因子的内切酶为0.5μl，mbuffer2μl，pcr扩增产物6μl，ddh2o为11μl，总体积是20μl，37℃温育3小时；酶切产物用1-2%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照；（2）a+因子的内切酶0.5μl，mbuffer2μl，pcr扩增产物6μl，ddh2o为11.5μl，总体积是20μl，37℃温育3小时，酶切产物用1-2%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照；（3）a-因子的内切酶为0.5μl，mbuffer2μl，pcr扩增产物6μl，ddh2o为11.5μl，总体积是20μl，37℃温育3小时，酶切产物用1-2%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照。
优选的实施方式为：如果pcr扩增产物只能被a+因子的内切酶酶切，则此菌株是同核不育单孢菌株的a+因子的交配型；如果pcr扩增产物只能被a-因子的内切酶酶切，则此菌株是同核不育单孢菌株的a-因子的交配型，如果pcr扩增产物既能被a+因子的内切酶酶切，也能被a-因子的内切酶酶切，则此菌株是双核体菌株。
优选的实施方式为：a+因子的内切酶选自内切酶bsahi、btsai、bsmi、bsphi、ecorv、styi、ndei、bani、bani、bpmi；a-因子的内切酶选自内切酶xmni、drdi、tsoi、tlii、arai、smli、xhoi、bsobi、paer7i、bmet110、pshai、spei、baegi、bsp1286i、bme1580i、sapi、bspqi、sfci。
优选的实施方式为：a+因子的内切酶为内切酶ecorv，a-因子的内切酶为内切酶xhoi、bmet110i或spei。
优选的实施方式为：提取双孢蘑菇的基因组dna的方法包括下列步骤：用孢子收集器将成熟双孢蘑菇子实体上的孢子收集后，用ddh2o稀释成105cfu/ml浓度的孢子悬浮液，再取100μl孢子悬浮液涂布在pda平板上，再将在pda平板上长出来的单菌落转移到新的pda平板上，培养结束后直接挑取菌丝放在dna裂解液中，在80℃进行温浴5min后即得。
本实施方式基于pcr扩增获得的特异性片段的snp位点的不同，交配型基因a+和a-因子的序列上的酶切位点不同。筛选到的a+因子的酶切位点中选了ecorv，其可以把a+因子序列酶切成257bp和479bp大小；从a-因子的酶切位点中选了内切酶xhoi或者bmet110i或者spei分别进行酶切，分别可以获得327bp和409bp,328bp和407bp，313bp和418bp大小序列。
所述的pcr扩增条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保存。反应体系是：50ng/μl基因组dna0.5μl,10μmol/l的引物2μl，0.1mmol/ldntp2μl,保真性酶0.5μl，5μl的pcr缓冲液，用ddh2o补齐至50μl。
所述的酶切条件是：内切酶ecorv0.5μl，内切酶xhoi或者bmet110i或者spei0.5μl，mbuffer2μl,pcr产物6μl，ddh2o11μl，总体积是20μl,37℃温育3小时。将获得的酶切产物5μl，进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，观察酶切的结果。
酶切结果分为三种：只能被内切酶ecorv切成257bp和479bp大小的序列，是交配型为a+；只能被内切酶xhoi或者bmet110i或者spei切开，获得327bp和409bp或者328bp和407bp或者313bp和418bp的序列，是交配型为a-;同时能被ecorv和xhoi或者bmet110i或者spei切开的菌株为双核体菌株。
本实施方式的结果如图1所示，m是marker；1是用内切酶ecorv切aba1f1片段；2-4分别是用内切酶xhoⅰ,bmet110ⅰ和speⅰ切aba1f1片段；5是用ecorv和xhoⅰ进行双酶切aba1f1片段。下方的四个箭头指的是内切酶已知的a+因子ecorv酶切a1b1片段的带型，由图可知，内切酶xhoⅰ,bmet110ⅰ和speⅰ无法切断单孢子。
实施例二：一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法
高保真酶pfu，dntps，酶buffer购自碧云天生物科技有限公司，内切酶ecorv和xhoⅰ购自大连宝生，特异性引物aba1f1：atcgtcgcaagggtaggtaaga和aba1r1：atttactgagccgtcggaagag购自上海生工生物科技有限公司。
双孢蘑菇孢子收集来自上海联中食用菌合作社种植的菌株a15子实体。用包子收集器将成熟子实体上的孢子收集后，用ddh2o稀释成105浓度的孢子悬浮液，再取100μl涂布在pda平板上。再将在平板上长出来的单菌落转移到pda平板。
将分离得到菌株进行菌丝进行菌丝pcr，即直接挑取微量菌丝放在dna裂解液中，在80℃进行温浴5min，即可作为模板进行pcr。dna裂解液购自上海生工生物科技有限公司。
pcr扩增条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保存。反应体系是：50ng/μl基因组dna0.5μl,10μmol/l的引物2μl，0.1mmol/ldntp2μl,保真性酶0.5μl，5μl的pcr缓冲液，用ddh2o补齐至50μl。
将获得的pcr产物直接进行两种类型的单酶切，即分别ecorv和xhoⅰ进行酶切。
酶切条件是：内切酶ecorv为0.5μl，mbuffer的2μl,pcr产物6μl，ddh2o为11.5μl，总体积是20μl,37℃温育3小时。酶切的产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照。
内切酶xhoi为0.5μl，mbuffer的2μl,pcr产物6μl，ddh2o为11.5μl，总体积是20μl,37℃温育3小时。酶切的产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照。如图2所示，图2中，x1和e1指同时用xhoi和ecorv酶切的同一个孢子不育单核菌株；x2和e2指同时用xhoi和ecorv酶切的同一个孢子不育单核菌株。
结果分析：随机挑选的孢子萌发的24个菌株，有一个可以被ecorv酶切，不能被xhoi酶切，证明则此菌株是同核不育单孢菌株的a+因子的交配型；另一个菌株可以被xhoi酶切，不能被ecorv酶切，说明此菌株是同核不育单孢菌株的a-因子的交配型。
实施例三：一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法
高保真酶pfu，dntps，酶buffer购自碧云天生物科技有限公司，内切酶ecorv和xhoⅰ购自大连宝生，溶壁酶购自广州微生物研究所，特异性引物aba1f1：atcgtcgcaagggtaggtaaga和aba1r1：atttactgagccgtcggaagag购自上海生工生物科技有限公司。
双孢蘑菇菌株as2796菌株的原生质体的制备技术为：将双孢蘑菇as2796菌株的菌丝在液体pda中25℃培养5-7天，收集菌丝，用1.5%的溶壁酶进行酶切，酶解温度为30℃，酶解时间是3h。将获得的原生质体用0.6m的甘露醇进行洗涤收集。将获得的原生质体稀释成105浓度，取100μl涂布在pda平板上，25℃培养。
将原生质体萌发的单菌落菌丝进行菌丝pcr：即直接挑取微量菌丝放在dna裂解液中，在80℃进行温浴5min，即可作为模板进行pcr。dna裂解液购自上海生工生物科技有限公司。
pcr扩增条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保存。反应体系是：50ng/μl基因组dna0.5μl,10μmol/l的引物2μl，0.1mmol/ldntp2μl,保真性酶0.5μl，5μl的pcr缓冲液，用ddh2o补齐至50μl。
将获得的pcr产物直接进行两种类型的单酶切，即分别ecorv和xhoⅰ进行酶切。
酶切条件是：内切酶ecorv为0.5μl，mbuffer的2μl,pcr产物6μl，ddh2o为11.5μl，总体积是20μl,37℃温育3小时。酶切的产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照。
内切酶xhoi为0.5μl，mbuffer的2μl,pcr产物6μl，ddh2o为11.5μl，总体积是20μl,37℃温育3小时。酶切的产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，genefinder荧光染料进行染色并拍照。如图3所示，图3中，x1和e1指同时用xhoi和ecorv酶切的同一个原生质体单核不育菌株；x2和e2指同时用xhoi和ecorv酶切的同一个原生质体单核不育菌株；x3和e3指同时用xhoi和ecorv酶切的同一个原生质体单核不育菌株。
结果分析：如图3所示，随机挑选的24个原生质体萌发的菌株，利用特异性合成的引物aba1f1和aba1r1进行扩增，利用内切酶ecorv和xhoi分别对pcr产物进行单酶切，获得三株原生质体同核不育菌株。这三株原生质体同核不育菌株都同时能被xhoi酶切，不能被ecorv酶切，它们的交配型因子为同核不育单孢菌株的a-因子的交配型。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110>上海市农业科学院
<120>一种鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株及其交配型的方法及引物
<160>4
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
atcgtcgcaagggtaggtaaga
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
atttactgagccgtcggaagag
<210>3
<211>730
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
atcgtcgcaagggtaggtaaaatcgatgaaagtcttgcacagagaagtgatacgcgacga60
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<210>4
<211>737
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
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