1.一种改良l-精氨酸产生菌的方法,包括以下步骤:
a.敲除谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组中的argr基因,获得基因敲除菌株atcc13032(δargr);
b.对步骤a中所述基因敲除菌株atcc13032(δargr)的基因组中argb基因进行a26v和m31v突变,获得基因突变菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26vm31v));
c.对步骤b中所述基因突变菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26vm31v))的基因组中abc型糖通透酶基因ncgl2374起始密码子上游调控区的碱基序列进行突变,由seqidno:13突变为seqidno:14,获得l-精氨酸生产能力比所述基因突变菌株提高的基因工程菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26vm31v),ncgl2374mut4)。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤a中所述基因敲除菌株atcc13032(δargr)通过下述方法制备:
a1.以atcc13032基因组为模板,使用序列为seqidno:1的引物argr-al-f和序列为seqidno:2的引物argr-al-r进行pcr扩增,得到约1kb的argr-al片段;
a2.以atcc13032基因组为模板,使用序列为seqidno:3的引物argr-ar-f和序列为seqidno:4的引物argr-ar-r进行pcr扩增,得到约1kb的argr-ar片段;
a3.使用hindiii和ecori酶切genbank登录号为fj437239.1的质粒pk18mobsacb,胶回收得到5.7kb载体片段;
a4.gibson连接上述argr-al片段、argr-ar片段和载体片段,转化dh5α感受态细胞,涂布卡那霉素lb平板,过夜培养;
a5.使用引物argr-al-f和argr-ar-r进行pcr扩增验证转化子,得到质粒pk18mobsacb-argr;
a6.制备谷氨酸棒状杆菌atcc13032感受态细胞;
a7.将质粒pk18mobsacb-argr转化入atcc13032感受态细胞;
a8.进行sacb蔗糖反筛,使用引物argr-al-f和argr-ar-r进行pcr扩增,验证在bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子,得到菌株atcc13032(δargr)。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤b中所述基因突变菌株通过下述方法制备:
b1.以atcc13032基因组为模板,使用序列为seqidno:5的引物argb-al-f和序列为seqidno:6的引物argb-al-r进行pcr扩增,得到约1kb的argb-al片段;
b2.以atcc13032基因组为模板,使用序列为seqidno:7的引物argb-ar-f和序列为seqidno:8的引物argb-ar-r进行pcr扩增,得到约1kb的argb-ar片段;
b3.使用hindiii和ecori酶切genbank登录号为fj437239.1的质粒pk18mobsacb,胶回收得到5.7kb载体片段;
b4.gibson连接上述argb-al片段、argb-ar片段和载体片段,转化dh5α感受态细胞,涂布卡那霉素lb平板,过夜培养;
b5.使用引物argb-al-f和argb-ar-r进行pcr扩增验证转化子,得到质粒pk18mobsacb-argbmut;
b6.制备谷氨酸棒状杆菌atcc13032(δargr)感受态细胞;
b7.将质粒pk18mobsacb-argbmut转化入atcc13032(δargr)感受态细胞;
b8.进行sacb蔗糖反筛,使用引物argb-al-f和argb-ar-r进行pcr扩增,验证在bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子,得到菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26vm31v))。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤c中所述基因工程菌株通过下述方法制备:
c1.以atcc13032基因组为模板,使用序列为seqidno:9的引物ncgl2374mut4-al-f和序列为seqidno:10的引物ncgl2374mut4-al-r进行pcr扩增,得到约0.5kb的ncgl2374mut4-al片段;
c2.以atcc13032基因组为模板,使用序列为seqidno:11的引物ncgl2374mut4-ar-f和序列为seqidno:12的引物ncgl2374mut4-ar-r进行pcr扩增,得到约0.5kb的ncgl2374mut4-ar片段;
c3.使用hindiii和ecori酶切genbank登录号为fj437239.1的质粒pk18mobsacb,胶回收得到5.7kb载体片段;
c4.gibson连接上述ncgl2374mut4-al片段、ncgl2374mut4-ar片段和载体片段,转化dh5α感受态细胞,涂布卡那霉素lb平板,过夜培养;
c5.使用引物ncgl2374mut4-al-f和ncgl2374mut4-ar-r进行pcr扩增验证转化子,得到质粒pk18mobsacb-ncgl2374mut4;
c6.制备谷氨酸棒状杆菌atcc13032(δargr,argbmut(a26vm31v))感受态细胞;
c7.将质粒pk18mobsacb-ncgl2374mut4转化入atcc13032(δargr,argbmut(a26vm31v))感受态细胞;
c8.进行sacb蔗糖反筛,使用引物ncgl2374mut4-al-f和ncgl2374mut4-ar-r进行pcr扩增验证在bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子,得到菌株atcc13032(δargr,argbmut(a26vm31v),ncgl2374mut4)。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法,其特征在于,步骤a7、b7和c7中所述转化为氯化钙转化法或电转化。
6.一种基因工程菌atcc13032(δargr,argbmut(a26vm31v),ncgl2374mut4),其特征在于,按照如权利要求1中所述的方法构建。
7.如权利要求6所述基因工程菌用于生产l-精氨酸的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,通过所述基因工程菌的发酵来生产l-精氨酸。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于,发酵培养基组成如下:60g/l葡萄糖,5g/l玉米浆,30g/l(nh4)2so4,8g/lkcl,2g/l尿素,0.5g/lkh2po4,0.5g/lk2hpo4,1g/lmgso4·7h2o,1g/lnacl,20mg/lfeso4·7h2o,10mg/lmnso4·5h2o,20mg/l尼克酸,20mg/lβ-丙氨酸,10mg/lvb1,0.2mg/l生物素,30g/lcaco3,koh调ph=7.7。
10.如权利要求7所述的应用,其特征在于,种子培养基组成如下:3g/lnacl,5g/l酵母提取物,7g/l牛肉浸膏,10g/l蛋白胨,10g/l葡萄糖。