本发明涉及农业科学技术领域，具体而言，本发明涉及利用crispr技术抑制phyb基因表达提高水稻耐盐能力的方法。
背景技术：
“手中有粮、心中不慌”。保障粮食安全是关系我国国民经济发展和社会稳定的全局性重大战略问题。目前我国良田资源已充分挖掘，5亿亩盐碱地的开发和利用将能极大地缓解中国18亿亩耕地红线引起的发展瓶颈难题。目前对盐碱地的改良主要根据“盐随水来、盐随水去”的规律，利用淡水压碱洗盐来降低土壤盐分，在水资源越来越宝贵的将来，利用淡水改良盐碱地的可行性非常小。
水稻是全球最主要的粮食作物，全世界有50％的人口以稻米为主食。根据其种植特点，水稻是盐碱地改良和利用的重要作物。在盐碱地区种植水稻，通过适宜灌排水，泡田、洗盐等措施能够降低土壤盐分含量，改良土壤的作用。现有水稻品种的耐盐碱能力(仅仅能够在低于3‰的盐碱地上生长)远远不能满足盐碱地农业生产的需要，亟需培育耐盐碱能力更强的水稻新品种。
目前在水稻中已报道的与盐胁迫反应有关部分转录因子已经用于耐盐基因工程改良中，主要包括以下几类：第一，dreb1/cbf调控子：水稻基因组包括至少10个dreb1(dehydration-responsiveelementbindingprotein1)型基因，过量表达osdreb1a和osdreb1f的转基因水稻植株的对高盐、干旱和冻害的抗性均增强，同时转基因水稻植株积累了较高含量的渗透调节物质，如脯氨酸和各种可溶性糖(itoetal.,2006；wangetal.,2008)。第二，areb调控子，aba是植物非生物胁迫反应中的一个关键信号分子。areb基因编码bzip-型转录因子，目前有几个bzip型转录因子在盐胁迫反应中的功能已有报道。osbzip23基因的过表达转基因水稻的耐旱和耐盐性提高，而该基因的功能缺失突变体对盐和干旱的抗性降低。第三，myb转录因子包含一个保守的dna结合结构域(52个氨基酸的myb结构域)。osmyb3r-2过表达增强了拟南芥的盐胁迫耐性以及低温和干旱胁迫耐性(daietal.,plantphyisol,2007,143:1739-1751)。过表达osmyb2基因的水稻植株对盐、干旱和低温的耐性增强，但并不影响植株的生长(yangetal.,jexpbot,2012,63:2541-2556)。第四，nac型转录因子也是通过aba依赖途径调控水稻盐胁迫反应。高盐胁迫诱导多个水稻nac基因的表达。snac1和osnac6过表达水稻植株的盐胁迫耐性提高(huetal.procnatlacadsciusa，2006，103:12987-12992；nakashimaetal.，plantj.,2007,51:617-630)。第五，锌指转录因子也参与水稻的盐胁迫耐性，如tfiiia-型的zfp252基因过表达水稻植株盐胁迫耐性和干旱胁迫耐性显著提高(xuetal.febslett,2008,582:1037-1043)。
随着水稻功能基因组学的研究，分子育种和常规育种相结合途径大大提高了水稻新品种培育速度和精准性。报道表明，目前已经鉴定到了数百个水稻耐盐相关qtl(hoangetal.,2016,agronomy,6:54；rahmanetal.,2017,rice,10:4)，但由于检测到的大多数水稻耐盐qtl的表型贡献率较小，精细定位和克隆难度较大。lin和ren等从耐盐籼稻品种nonabokra定位了skc1，该基因编码na+/k+转运蛋白(hkt)，在盐胁迫下维持地上部k+浓度(linetal.,2004,theoreticalandappliedgenetics,108:253-260；renetal.,2005,naturegenetics,37:1141-1146)。利用ir29(盐敏感)/pokkali(耐盐)重组自交系群体，在1号染色体上定位到了saltolqtl。由于saltol与skc1在染色体上的位置十分相近，两者又均负责调控盐胁迫下水稻植株的k+/na+平衡，thomson等推测saltol与skc1可能是同一基因(thomsonetal.,2010,rice,3:148-160)。目前，已将saltol位点转移到7个当地主栽品种(singhetal.,2016,plantscience,242:278-287)。2015年日本takagi等人在耐盐突变体hst1中克隆到耐盐基因osrr22，并已通过分子标记辅助育种技术转育到其它水稻品种(takagietal.,2015,naturebiotechnology,33:445-449)，但目前还没有耐盐品种报道。
由于水稻耐盐性状由多基因控制、基因之间、以及基因与环境之间存在相互作用等原因，利用上述单个基因和qtl位点培育耐盐水稻新品种还未有报道。
水稻phyb基因编码光敏色素光受体，但是目前还未有利用phyb培育水稻耐盐水稻品种的报道。
技术实现要素：
本发明利用crispr/cas9技术，设计合成水稻phyb基因高度特异的spacerdna序列，克隆在pos-sgrna载体上，再通过同源交换克隆至pos-cas9载体上，然后转化至盐丰47栽培水稻品种中，得到的株系通过回交和自交，筛选没有载体序列、只有phyb基因靶序列变异的转基因纯合株系。在200mmnacl处理条件下，phyb-crispr株系的存活率为80～85％，而对照受体水稻品种的存活率约5％，说明phyb-crispr株系的耐盐性显著提高。
本发明的技术方案是：一种提高水稻耐盐能力的方法，其特征是，利用crispr技术抑制phyb基因表达，提高水稻耐盐能力。
具体包括以下步骤：
1)合成水稻phyb基因高度特异的双链spacerdna序列，再连接到pos-sgrna载体；
其中，基因高度特异的双链spacerdna序列的获取方式为：在水稻phyb基因外显子区域寻找合适的spacer序列，得到的spacer的5’端加上ggca，其互补序列的5’端加上aaac，合成双链spacerdna序列。
本发明筛选的基因高度特异的双链spacerdna序列为：spacer1、spacer2。
spacer1正向序列phyb-crispr-f1：5’-ggcaccacgccgtgttcgagcagt-3’(seqidno:1)；
spacer1互补反向序列phyb-crispr-r1：5’-aaacactgctcgaacacggcgtgg-3’(seqidno:2)。
spacer2的正向序列phyb-crispr-f2：5’-ggcaaataaccttgagccctacat-3’(seqidno:3)；
spacer2的互补反向序列phyb-crispr-r2：5’-aaacatgtagggctcaaggttatt-3’(seqidno:4)。
其中双链spacerdna序列接到pos-sgrna载体，具体为：采用bsaⅰ酶切pos-sgrna载体，回收线性pos-sgrna载体，然后用t4连接酶连接spacer1或spacer2片段和回收的线性pos-sgrna载体。
2)然后通过gateway技术的lr反应整合在ph-ubi-cas9-7双元载体上，获得phyb基因的crispr/cas9植物表达载体(phyb-crispr/cas9)；
3)再利用农杆菌介导的遗传转化方法将phyb基因的crispr/cas9植物表达载体转化至水稻中，获得耐盐性提高的转基因株系；
4)然后转基因株系和受体水稻进行回交，获得f1代水稻种子；f1代水稻自交后，筛选没有载体序列、只有phyb基因靶序列变异的转基因纯合株系。
本发明的优点在于：
(1)在200mmnacl处理条件下，转基因phyb-crispr株系的存活率为80～85％，而对照受体水稻品种的存活率约为5％，phyb-crispr株系的耐盐性显著提高。
(2)本发明中通过crispr/cas9技术获得降低phyb基因的转基因后代，再进行回交和连续自交，通过遗传分离在后代中除去载体，得到仅仅功能缺失的phyb基因，这为耐盐碱水稻新品种的培育提供了一条重要的育种途径。
(3)本发明中所涉及的crispr/cas9技术降低phyb基因的表达方法，可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物抗旱、抗盐等抗性研究提供支持。
附图说明
图1为pos-sgrna-phyb1或者pos-sgrna-phyb2的pcr扩增产物电泳图；
图2为分别采用lr-test-f/lr-test-r引物对和pos-cas9-f/pos-cas9-r引物对的pphyb-crispr/cas9-1、pphyb-crispr/cas9-2pcr扩增产物电泳图；
图3为phyb-crispr转基因水稻中phyb基因分子特征图；
图4为phyb1-crispr#31和phyb2-crispr#21转基因水稻纯合株系和盐丰47，耐盐处理前后的表型图。
具体实施方式
根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用于不同的用途和条件。
实施例1：spacer的设计与合成
(1)在水稻phyb基因第一个外显子区域寻找合适的spacer序列：从atg端选择含有ngg结尾的片段，将20bp+ngg序列在网站http://www.gramene.org/中blast，去除特异性不高的spacer序列。我们选择了两个spacer，其中spacer1距离翻译起始位点(以atg中的a为+1)是212bp；spacer2距离翻译起始位点897bp。
(2)分别合成spacer1和spacer2的正向序列和反应序列(hplc级)。因为pos-sgrna载体上存在两个bsaⅰ酶切位点，即spacer插入位点。根据其酶切后留下的黏性末端序列，在候选的20nt的spacer的5’端加上ggca，其互补序列的5’端加上aaac，并委托青岛擎科天成生物技术有限公司合成。这样spacer1的正向序列是phyb-crispr-f1:5’-ggcaccacgccgtgttcgagcagt-3’(seqidno:1)/互补反向序列是phyb-crispr-r1:5’-aaacactgctcgaacacggcgtgg-3’(seqidno:2)。spacer2的正向序列是phyb-crispr-f2:5’-ggcaaataaccttgagccctacat-3’(seqidno:3)/互补反向序列是phyb-crispr-r2:5’-aaacatgtagggctcaaggttatt-3’(seqidno:4)。
实例2：spacer插入pos-sgrna载体
(1)将合成的正向spacer和反向spacer等摩尔比混合，放入pcr仪中，94℃加热5min，之后关闭pcr仪，自然冷却至室温，即形成双链互补spacer。
(2)用neb的bsaⅰ酶切pos-sgrna载体(miaoetal.,cellresearch,2013,23:1233-1236)，回收线性pos-sgrna载体。
(3)用t4连接酶分别连接spacer1或spacer2片段和回收的线性pos-sgrna载体。连接体系10μl，包括双链线性pos-sgrna载体dna2μl，spacer1或者spacer2双链dna0.5μl，t4buffer1μl，无菌双蒸水6μl，混匀，4℃连接过夜。
(4)按照热激法将连接产物转入dh5α感受态细胞，涂布lb+卡那霉素固体培养基(胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；氯化钠10g/l；琼脂粉15g/l，用naoh调节ph至7.0，卡那霉素50mg/l)，挑取单克隆，并利用m13-f：5'-gttttcccagtcacgac-3'(seqidno:5)和phyb-crispr-f1或者phyb-crispr-f2作为扩增引物对进行pcr扩增，pcr体系来自于takara公司，包括2×taqpcrmix10μl，10μmm13-f0.4μl，10μm的phyb-crispr-f1或者phyb-crispr-f20.4μl，菌落1个，加入双蒸水至20μl，pcr扩增程序是94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃15s，共30cycles，然后72℃7min，扩增片段约300b(图1)。对pcr产物进行dna测序，在测得的片段里找到ccacgccgtgttcgagcagt序列(spacer1)或者aataaccttgagccctacat序列(spacer2)，则为阳性克隆，命名为pos-sgrna-phyb1或者pos-sgrna-phyb2。
(5)用genstar质粒抽提试剂盒提取阳性克隆载体质粒，质粒浓度为浓度约200μg/μl。
实施例3：phyb-crispr/cas9植物表达载体的构建
(1)用invitrogenlrclonaseⅱ将克隆载体和表达载体ph-ubi-cas9-7(miaoetal.,cellresearch,2013,23:1233-1236)进行lr反应。反应体系是pos-sgrna-phyb1或者pos-sgrna-phyb2质粒3μl，ph-ubi-cas9-7载体1μl，lrmix1μl，混悬两次，每次2s。25℃反应过夜。加入1μl蛋白酶k，混悬，37℃孵育10min，终止反应。
(2)热激法将lr产物转化dh5α。涂布lb+链霉素固体培养基(胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；氯化钠10g/l；琼脂粉15g/l，用naoh调节ph至7.0，链霉素50mg/l)，挑取单克隆。按照如下方法进行阳性克隆的鉴定。
lr反应后用两对特异引物扩增筛选阳性单克隆，一对是ph-ubi-cas9-7载体上cas9序列中的引物pos-cas9-f:5’-ccgagttgtgagaggtcgatgcgt-3’(seqidno:6)/pos-cas9-r:5’-acaaacggcgagacaggcgagatc-3’(seqidno:7)。另一对是pos-sgrna载体上交换序列的引物lr-test-f:5’-accgactcggtgccactttt-3’(seqidno:8)/lr-test-r:5’-gcacaggacaggcgtcttctact-3’(seqidno:9)。对转化后的单菌落进行pcr扩增，lr-test-f/lr-test-r引物对的退火温度是58℃，扩增片段长度为300bp左右，引物pos-cas9-f/pos-cas9-r引物对的退火温度是64℃，扩增产物约为900bp(见图2)。其余扩增体系同实施例2。这两对引物均获得扩增产物的菌落即为阳性克隆。随后对pcr筛选的阳性克隆委托青岛擎科天成生物技术有限公司测序。通过测序正确的克隆即为植物表达载体，分别命名为pphyb-crispr/cas9-1和pphyb-crispr/cas9-2。将这两个植物表达载体转化至eha105宿主菌。
实施例4：phyb–crispr转基因株系的培育
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到黄河三角洲主栽水稻品种盐丰47，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在hiei等人报道的方法基础上改良进行(hieietal.,1994,plantj,6:271-282)。pphyb-crispr/cas9-1转化分别获得10株独立的转基因水稻植株，pphyb-crispr/cas9-2转化分别获得8株独立的转基因水稻植株。
具体步骤如下：
(1)愈伤诱导：去壳的野生型日本晴水稻种子，用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)naclo溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基(成分见后)上诱导愈伤组织，于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。
(2)愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培养4天。
(3)农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mlyep液体培养基中(含有50mg/l的链霉素)，28℃，220rpm，培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。将获得的菌液按1％接种量转接到50ml新鲜的、含有50mg/l卡那霉素的ab液体培养基中(成分见后)；28℃，220rpm，培养至od600值为0.5左右(培养5-6小时)。
(4)农杆菌侵染：把50ml菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的aam培养基重悬菌体。把(2)的日本晴胚性愈伤组织浸入上述aam菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，26℃，黑暗共培养2-3天。
(5)愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/l羧苄青霉素cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基(含有25mg/l潮霉素，400mg/l羧苄青霉素)上，26℃暗培养2周。然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/l潮霉素，300mg/l羧苄青霉素)上，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。
(6)分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。
(7)壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2ms培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。
试剂配方：
(1)试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：cb(cabenicillin,羧苄青霉素)；kt(kinetin，激动素)；naa(napthaleneaceticacid，萘乙酸)；2，4-d(2，4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-二氯苯氧乙酸)；as(acetosyringone，乙酰丁香酮)；dmso(dimethylsulfoxide,二甲基亚砜)。
(2)用于水稻遗传转化的培养基配方：
1)yep液体培养基：2gbacto-蛋白胨，2g酵母粉，1gnacl，加水定容至200ml，用5nnaoh调ph至7.0。
2)愈伤诱导培养基：n6大量，n6微量，铁盐，n6维生素，0.5g/l酸水解酪蛋白，30g/l蔗糖，2mg/l2,4-d，gelrite(sigma)4g/l，ph5.8。
3)ab液体培养基：3g/lk2hpo4，1g/lnah2po4，1g/lnh4cl，300mg/lmgso4·7h2o，150mg/lkcl，10mg/lcacl2·2h2o，2.5mg/lfeso4·7h2o，5g/l葡萄糖，ph7.0。
4)aam培养基：aa大量，aa微量，0.9g/ll-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，ms维生素，0.5g/l酸水解酪蛋白，36g/l葡萄糖，68.5g/l蔗糖，20mg/las，ph5.2。
5)共培养培养基：n6大量，n6微量，铁盐，n6维生素，30g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，0.5g/l酸水解酪蛋白，2mg/l2,4-d，20mg/las，gelrite(sigma)4g/l，ph5.8。
6)固体筛选培养基：n6大量、n6微量和n6维生素，0.5g/l酸水解酪蛋白，30g/l蔗糖，2mg/l2,4-d，gelrite(sigma)4g/l，ph5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。
7)分化培养基：ms大量，ms微量，铁盐和ms维生素，2g/l酸水解酪蛋白，30g/l蔗糖，30g/l山梨醇，2mg/lkt，0.2mg/lnaa，ph5.8，30mg/l潮霉素b，200mg/l羧苄青霉素。
8)1/2ms培养基：1/2ms大量，1/2ms微量，ms维生素，30g/l蔗糖，4g/lgelrite，30mg/l潮霉素b，200mg/l羧苄青霉素，ph5.8.
(3)主要溶液配方：
1)n6大量元素(10×)
用水定容1l
2)n6微量(1000×)：
用水定容1l
3)n6维生素(1000×)
用水定容100ml
3)ms大量元素(10×)
用水定容1l
4)ms微量(1000×)：
用水定容1l
5)ms维生素(1000×)
用水定容100ml
6)铁盐(200×)
8)aa微量(1000×)
用水定容1l
9)2,4-d储存液(2mg/ml)
称取2，4-d100mg,溶于1mldmso，加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5nnaoh，至完全溶解，于-20℃保存。
10)kinetin储存液(0.2mg/ml)
称取kinetin10mg，溶于1ml1nkoh，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
11)naa储存液(0.2mg/ml)
称取naa10mg，溶于0.5ml1nkoh，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
12)乙酰丁香酮(100mg/ml)
称取乙酰丁香酮100mg，溶于1mldmso，于-20℃保存。
13)卡那霉素(50mg/ml)
称取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存。
实施例5：转基因水稻植物中phyb基因的分子特征
对获得的18株t0代转基因单株分别利用ctab方法提取基因组dna，具体步骤参考murrayandthompson,nucl.acidsres,1980,8:4321-4325。对于pphyb-crispr/cas9-1转化获得的10株转基因水稻植株,我们利用设计了如下pcr引物phyb1-f15’-ccaccactcgcagtcctc-3’(seqidno:10)/phyb1-r15’-gtgttctcggagtaggcgag-3’(seqidno:11)，对基因组dna进行pcr扩增。对于pphyb-crispr/cas9-2转化获得的8株转基因水稻植株，phyb2-f15’-aacccttctacgccatcctc-3’(seqidno:12)/phyb2-r15’-atcagcaatcatccgcacac-3’(seqidno:13)，对基因组dna进行pcr扩增。pcr体系来自于东洋纺公司，包括2×pcrbufferforkodfx10μl，20μm引物对各0.4μl，kodfx酶0.5μl，2mmdntp2μl，加入双蒸水至20μl，pcr扩增程序是94℃5min；94℃30s，x℃30s，68℃15s，共30cycles，然后68℃7min。对于pphyb-crispr/cas9-1转基因植株，退火温度为60℃；对于pphyb-crispr/cas9-2转基因植株，退火温度为55℃。
对pcr产物由青岛擎科新业生物有限公司进行dna测序，比较phyb基因在转基因株系和受体植株中的核苷酸序列，phyb基因核苷酸序列发生变化的植株即为phyb-crispr阳性转基因植株。
将杂合的转基因株系和受体水稻品种盐丰47种植于大田，长至抽穗开花期，用phyb-crispr转基因株系做母本，用盐丰47做父本，进行回交。获得f1代种子。f1代种子自交后获得f2种子。f2种子种植在大田中，分别取20个单株，提取基因组dna，进行pcr扩增和测序，具体步骤同上。
最终我们筛选到phyb-crispr转基因水稻纯合株系phyb1-crispr#31和phyb2-crispr#21。通过序列比对我们发现phyb1-crispr#31纯合株系和对照yf47相比，是在第一个spacer序列的第229核苷酸处插入了一个碱基a，导致氨基酸提前终止。phyb2-crispr#21和对照yf47相比，是在第二个靶点处多了一个g，导致氨基酸提前终止(见图3)。
实施例6：phyb-crispr转基因株系具有强的盐胁迫耐性
phyb1-crispr#31和phyb2-crispr#21转基因水稻纯合株系和盐丰47种子在30℃培养箱中诱导萌发，挑选萌发一致的种子播种于96孔板(底部去掉)。转移至yoshida溶液(yoshida，1976)在光照培养箱(暗期10h,26℃；光期12h,28℃)中继续培养至三叶期。随后加入200mmnacl溶液处理，分别在处理前，处理7天时照相(见图4)，同时统计植株的存活率。结果表明，野生型的存活率约为5％，phyb1-crispr#31和phyb2-crispr#21的存活率分别为80％和83％。因此phyb-crispr转基因株系具有较强的盐胁迫耐性。
sequencelisting
<110>山东省水稻研究所
<120>一种提高水稻耐盐能力的方法
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