本发明涉及农业肥料技术领域，具体涉及一种微生物液体菌肥及其制备方法和应用。
背景技术：
作为世界上的主要产茶国，中国国内茶叶消费近年来快速增加，2013年达到161.32万吨，比2001年增长225％。同期，全球茶叶消费量由2001年的298.58万吨增加到2013年的482.1万吨。市场对茶叶的大量需求，直接促进了茶叶的大面积种植和品质的提高。目前，中国已成为全球发展最快和潜力最大的茶叶市场。改善茶叶品质和提高茶叶产量是提升茶叶产品市场竞争力和提高茶叶生产企业经济效益的两个关键技术问题。施肥是提高茶叶产量品质并促进茶园可持续发展最重要的农业措施之一。现有技术中，关于茶叶施肥的研究有较多报道，但施用的肥料主要为化肥、有机肥和豆科绿肥。但是，随着茶园化肥的盲目使用和不合理的施肥模式引起的茶园环境问题及生态问题日益凸显，开发能够促进茶园可持续发展的环保高效肥料，显得尤为重要与迫切。
微生物肥料是活体肥料，是二十一世纪的新型肥料，是一种低碳、纯天然、无毒、无害、无污染的有机微生物菌剂。它主要靠大量有益微生物的生命活动代谢来完成，具有提高土壤肥力，增加土壤中有益微生物数量及活性，改善土壤性状，防止土壤板结，提高土壤保肥、保水，抗寒能力，增强作物抗病能力，增加土壤中的有机质，阻止病原菌入侵，减少植物的病虫害生长，促进农作物生长，提高农作物产量，改善和还原农产品品质等功能。微生物肥料从形态来分有固体和液体两种。其中液体微生物肥料以其速溶、均匀、即用、能够喷灌和浇灌以及不易吸湿和结块等优势受到茶叶种植行业的青睐。但是，目前行业内的微生物肥料对促进茶叶种植的研究普遍集中在促进土壤肥力和提高产量方面，其功能较为单一，对促进茶叶提高品质方面的研究较少。此外，行业内技术人员发现在施用液体微生物肥料的过程中，液体肥料存在稳定性差、随着贮藏时间的增加其液体菌肥中的活菌数量显著减少、所起功效随之下降的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种微生物液体菌肥及其制备方法和应用，以解决现有微生物液体菌肥存在功能单一、贮藏稳定性差的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种微生物液体菌肥，所述液体菌肥为含活菌数为1.8×108cfu/ml～2.2×108cfu/ml的解淀粉芽孢杆菌的发酵液，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)w208，该菌株于2016年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.13006。所述发酵液是指在发酵培养基中接种解淀粉芽孢杆菌在30～40℃发酵而成；所述发酵培养基是以马铃薯淀粉厂的淀粉废水为原料、添加豆粕粉10～30g/l、调节ph值为6.0～8.0、灭菌得到的液体培养基。
为增加其贮藏稳定性可在所述液体菌肥中添加有机酸；所述有机酸的添加质量为液体菌肥质量的0.01～2.0％；优选地，所述有机酸为甲酸、乙酸或柠檬酸中的任意一种。添加有机酸后的液体菌肥其活菌数能在常温下稳定保持3个月。
所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)w208的菌株形态特征为：细胞形态呈杆状，长为1.0～2.0μm，宽为0.3～0.6μm，有鞭毛，革兰氏染色为阳性；在lb平板培养基上培养48h后，菌落形状隆起、不光滑、不透明、呈乳白色、边缘呈树枝状；其生长的适合ph值为6.0～8.0，适合温度为30～40℃。
一种微生物液体菌肥的制备方法，包括以下步骤：
(a)将解淀粉芽孢杆菌菌株接种到lb培养基中，在30～40℃恒温摇床中，180r/min振荡培养24h，制成液体种子；所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)w208，该菌株于2016年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.13006；
(b)按质量体积比为5％的接种量将所述液体种子接种于发酵罐内的发酵培养基中，曝气，于30～40℃下发酵70～74h，在发酵过程中补充发酵培养基，待发酵液中所述解淀粉芽孢杆菌活菌数为1.8×108cfu/ml～2.2×108cfu/ml时，收集发酵液，所述发酵液即为微生物液体菌肥。
为增加微生物液体菌肥的功效稳定性，在所述发酵液中添加有机酸；所述有机酸的添加质量为发酵液质量的0.01～2.0％，优选0.05％；所述有机酸为甲酸、乙酸或柠檬酸中的一种；添加有机酸后的液体菌肥其活菌数能在常温下(15～25℃)稳定保持3个月。
所述lb培养基包括：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，ph值为6.0～8.0，121灭菌20min。
所述发酵培养基是以马铃薯淀粉厂的淀粉废水为原料，添加豆粕粉10～30g/l，调节ph值为6.0～8.0，在121℃灭菌20min，制备而成的液体培养基。所述淀粉废水的cod为18000～22000mg/l。
在发酵过程中补充发酵培养基是指在发酵第24h第一次补充发酵培养基，补充体积为原发酵液体积的40～60％，在发酵第56h第二次补充发酵培养基，补充体积为补充前发酵液体积的20～40％。
通过试验证明，施用本发明提供的微生物液体菌肥可以提高茶叶产量、改善茶叶品质、改善土壤环境及微生物菌群，能够在茶叶生产中得到应用。
在茶叶种植中，本发明的微生物液体菌肥的施用方法为：使用前用浓度为6mol/l的氢氧化钠溶液调节其ph至7.0，用所述发酵培养基稀释50倍，建议施用量为1500l/亩。
本发明通过筛选解淀粉芽孢杆菌菌株w208制备成微生物液体菌肥，将其施用于茶园，通过对比发现其肥力效果好；能够显著改善茶园土壤；显著提高茶园土壤有机质和腐殖酸含量，提高幅度分别为81.7％和73.9％；能够显著提高茶园土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量，提高幅度分别为81.4％、53.0％、30.5％；能够显著提高茶园土壤微生物群落多样性；能够显著增加茶叶产量，并提升茶叶品质，显著增加茶叶水浸出物、游离氨基酸和香味物质的含量，特别地，其显著降低了茶叶中咖啡碱的含量，降低幅度为24.3％。公知干茶叶中含有一定量的咖啡碱。而高含量的咖啡碱使得茶叶的口感变得比较苦涩；而且咖啡碱能兴奋人的中枢神经系统，增强大脑皮层兴奋，尤其很多人在夜晚喝茶容易引起失眠。施用本发明提供的液体菌肥可降低茶叶中的咖啡碱，显著提高茶叶的口感，并可解决喝茶容易失眠的问题。此外，本发明通过在液体菌肥中添加有机酸有效解决了行业内液体菌肥存在贮藏时间短，肥效衰减快的问题。本发明制备方法简单、成本低、使用简单，对人畜安全，不会造成环境污染，对促进茶叶生产和生态茶园的可持续发展具有重要的意义。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌w208的菌落形态。
图2为解淀粉芽孢杆菌w208的扫描电镜图。
图3为解淀粉芽孢杆菌w208的革兰氏染色图。
图4为解淀粉芽孢杆菌w208生长的最适温度曲线。
图5为解淀粉芽孢杆菌w208生长的最适ph曲线。
图6为解淀粉芽孢杆菌w208的生长曲线图。
图7为本发明与空白对照对茶园土壤微生物群落影响的结构差异图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，若未特别指明，实施例中的培养基及实验条件均为常规培养基和实验条件。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)w208的获得及鉴定
1、菌株分离
从福建省福州市晋安区寿山乡寿山村含腐烂稻草的农田采集土壤样品。称取5g土壤样品于灭菌离心管中，加入5倍体积无菌水，将土壤滤去，取滤液接种于lb平板培养基，在37℃下恒温培养，直至菌落出现，用接种针挑取边缘生长良好的细菌，接种于新的lb平板培养基上，待新接种的内生菌长成菌落后，再挑取其边缘的内生菌划线培养，如此反复得到纯化，直到得到单菌落，命名其为菌株w208。其中lb平板培养基包括：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、氯化钠10g/l，琼脂15g/l，ph值为7.0，在121℃灭菌20min。
2、菌株鉴定
(1)菌落及菌体形态观察：将菌株w208在lb平板培养基上进行划线培养，在37℃恒温培养48h后，菌落形状隆起、不光滑、不透明、呈乳白色、边缘呈树枝状，菌落形态见图1。在扫描电子显微镜下观察，菌体呈杆状，长为1.0～2.0μm，宽为0.3～0.6μm，有鞭毛，其扫描电镜图为图2。进行革兰氏染色，其为阳性，革兰氏染色结果见图3。
(2)菌株w208的培养特征观察：将菌株w208按体积比1.5％的接种量分别接种于lb液体培养基中，置于不同温度下摇床培养24h，在15～45℃环境中的菌株能够生长，且30～40℃环境下的菌株生长最快，其最适生长曲线如图4所示；置于不同初始ph值环境下摇床培养24h，在ph值范围为3～9的环境中菌株能够生长，且在ph值为6～8的环境中生长最快，最适ph值生长曲线见图5。置于37℃、ph值为7.0的条件下摇床培养，于第0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、96h取培养液于600nm波长下测定吸光值并绘制成生长曲线，见图6，在培养6h时开始进入对数生长期，到24h时达到生长高峰，24h后进入稳定期，稳定期达24h。其中lb液体培养基包括：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、氯化钠10g/l，ph值为6.0～8.0，在121℃灭菌20min。
(3)菌株w208的生理生化特征：菌株w208能够在含葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、蔗糖、棉子糖、龙胆二糖、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、乳糖、水苏糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、淀粉和明胶为碳源的培养基中生长；通过实验发现形成芽孢试验、氧化酶试验、接触酶试验和淀粉水解试验结果均为阳性，孢囊膨大试验结果为阴性，对利福霉素sv、林可霉素、氯化锂、亚碲酸钾、氨曲南、丁酸钠、d-丝氨酸、溴酸钠、1％乳酸钠、1％氯化钠、4％氯化钠、8％氯化钠敏感，对醋竹桃霉素、万古霉素、二甲胺四环素、四唑蓝、四唑紫、十四烷硫酸钠、萘啶酸不敏感，见表1。
表1菌株w208的生理生化特征
(4)菌株w208的分子生物学鉴定：采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取菌株w208的全基因组，通过选用细菌16srdna通用引物27f和1492r进行pcr，然后测序分析。测序结果经blast比对，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为：淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)w208，并于2016年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.13006。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
实施例2微生物液体菌肥的制备
(1)lb培养基的制备：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，调节ph值为7.0，在121℃灭菌20min即得。
发酵培养基的制备：以马铃薯淀粉厂的淀粉废水为原料，添加豆粕粉10～30g/l，调节ph值为6.0～8.0，在121℃灭菌20min即得。
(2)将实施例1获得的解淀粉芽孢杆菌w208接种到lb培养基上，在37℃恒温摇床中，180r/min振荡培养24h，制成液体种子；
(3)按质量体积比为5％的接种量将液体种子接种于发酵罐内的发酵培养基，曝气，于37℃下发酵72h，在发酵第24h第一次补充发酵培养基，补液体积为补充前发酵液体积的50％，在发酵第56h第二次补充发酵培养基，补液体积为补充前发酵液体积的30％，发酵72h时检测其含解淀粉芽孢杆菌活菌数为2.06×108cfu/ml，收集发酵液，即得微生物液体菌肥。
实施例3微生物液体菌肥在茶叶生产上的应用
试验在福建省龙岩市上杭县蛟潭茶场(海拔1000m左右)进行，茶树品种为铁观音，树龄12年。栽植方式为畦栽密植，栽植密度3000-4000株/亩。该茶园初始土壤的理化指标参数如下：ph为5.8，全氮0.203％，全磷0.026％，全钾1.12％，碱解氮138.1mg/kg，有效磷106.7mg/kg，速效钾297mg/kg，有机质45.0g/kg，腐殖酸17.1g/kg。
试验分为两组：空白对照组(ck)和试验组(w208yf)。
其中空白对照组(ck)施用清水，施用量：1500l/亩；
试验组(w208yf)施用本发明实施例2制备的微生物液体菌肥，其在使用前用发酵培养基稀释50倍，施用量：1500l/亩。
每个处理面积为0.5亩，每个处理4个重复，于2016年8月10日和9月1日进行叶面喷施和沟施，叶面喷施量和沟施量各占50％左右。于2016年10月20日采摘土壤和茶叶，茶叶统一按铁观音做青工艺加工，制成干茶。
对不同处理茶园土壤微生物菌群、茶叶产量和品质进行检测。
1、检测方法：
茶叶水浸出物测定参照《gbt8305-2013茶水浸出物测定》；
游离氨基酸总量参照《gbt8314-2013茶游离氨基酸总量的测定》；
茶多酚测定参照《gbt8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；
咖啡碱测定参照《gbt8312-2013茶咖啡碱测定》；
茶叶香气成分检测步骤：(1)样品处理：香气提取方法采用hs-spme：分别称取茶叶样品10.0g磨碎茶样于150ml三角瓶中，加入2mg/ml癸酸乙酯(内标)25μl和100ml沸腾蒸馏水，用具硅胶隔垫的顶空螺纹盖盖紧，搅拌速度：450rpm，在50℃烘箱中平衡5min后，将萃取头插入三角瓶于茶汤液面上空吸附40min，萃取温度为50℃，最后在gc-ms进样口于230℃下解吸5min。(2)气相色谱-质谱条件：色谱柱：hp-5ms(30m×0.25mmid×0.25μm膜厚)。载气为高纯氦气。进样口温度：230℃。脉冲不分流，进样1μl，柱流速：1ml/min。色谱-质谱接口温度：250℃。离子源温度：230℃。离子化方式：ei。电子能量：70ev。程序升温参数：50℃保持3min，以5℃/min升至180℃，保持3min，再以10℃/min升到230℃，保持5min。(3)gc-ms分析：由gc-ms分析得到的质谱数据经计算机在nist08，nist27，wiley7准谱库进行检索，并结合关文献核对，确定其化学成分，再结合保留时间、质谱、实际成分和保指数等参数对部分组分进一步确定。各组分的相对含量采用峰面积归一化法进行定量分析(扣除溶剂峰)。
茶园土壤肥力检测方法：ph、有机质、碱解氮、有效磷、速效钾、全氮、全磷、全钾，腐殖酸含量分别根据ny/t1377-2007、ny/t1121.6-2006、《土壤农业化学分析法》、ny/t1121.7-2006、ny/t889-2004、ny/t53-1987、ny/t88-1988、ny/t87-1988、《土壤农业化学分析法》进行检测。茶园土壤微生物检测：按试剂盒说明书(
检测结果如下：
表2试验组(w208yf)和空白对照组(ck)茶叶的产量和理化指标
注：结果以平均值±标准偏差表示(n＝4)，同一列数据右上方*表示与ck相比具有显著性(p<0.05，独立样本t检验法)。
由表2可看出，与ck相比，w208yf茶叶的产量明显增加(p<0.05)，增幅为11.1％，说明本发明制备的微生物液体菌肥可以显著提高茶叶产量。同时，理化指标检测检测结果显示，w208yf茶叶的水浸出物含量和游离氨基酸含量均明显增加(p<0.05)，二者相对于ck的增幅分别为10.6％和8.1％，而咖啡碱含量显著降低(p<0.05)，降低幅度为24.3％，茶多酚含量稍有增加，但差异不显著(p>0.05)。
表3试验组(w208yf)和空白对照组(ck)茶叶的香气成分含量
注：结果以平均值±标准偏差表示(n＝4)，同一列数据右上方*表示与ck相比具有显著性(p<0.05，独立样本t检验法)。
表3检测结果显示，施用本发明制备的微生物液体菌肥能够显著提高茶叶β-罗勒烯、壬醛、紫苏烯、顺-3-己烯基丁酯、丁酸己酯、反-2-己烯基丁酯、2-甲基丁酸叶醇酯、己酸叶醇酯、橙花叔醇和己烷雌酚这些芳香物质的含量(p<0.05)，显著降低苯甲醛、苯乙醛和吲哚的含量(p<0.05)。
表4试验组(w208yf)和空白对照组(ck)茶园土壤的理化指标
注：结果以平均值±标准偏差表示(n＝4)，同一列数据右上方*表示与ck相比具有显著性(p<0.05，独立样本t检验法)。
表4显示，与ck相比，本发明提供的微生物液体菌肥对茶园土壤全氮含量、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质和腐殖酸含量明显较高(p<0.05)，其相对于ck组的增幅分别达76.3％、81.4％、53.0％、30.5％、81.7％和73.9％，说明施用本发明的微生物液体菌肥w208yf能够显著提高茶园土壤化肥利用率和改善土壤肥力。
表5试验组(w208yf)和空白对照组(ck)茶园土壤的微生物多样性
注：结果以平均值±标准偏差表示(n＝4)，同一列数据右上方*表示与空白对照组相比具有显著性(p<0.05，独立样本t检验法)。
表5显示，施用了本发明提供的微生物液体菌肥对茶园土壤微生物群落shannon及simpson指数明显更高(p<0.05)，说明施用本发明提供的液体菌肥可以显著提高茶园土壤微生物群落的丰富度和均匀度。
微生物群落的β多样性一般可采用pcoa(principalcoordinateanalysis，主坐标分析)法进行。通过pcoa法对ck和w208yf(每组4个重复)茶园土壤微生物群落差异进行分析，结果如图7所示。由图7可看出，w208yf与ck之间能够明显的区分开来，说明本发明提供的微生物液体菌肥能够显著调节茶园土壤的微生物群落结构。
从以上的试验结果表明，施用本发明制备微生物液体菌肥能够明显增加茶园土壤肥力及其微生物群落多样性，并显著提高茶叶产量，显著降低茶叶中的咖啡碱，对改善茶叶口感，提高茶叶品质具有显著效果。
实施例4本发明的微生物液体菌肥的贮藏稳定性
取实施例2制备的微生物液体菌肥4份，每份1kg，在其中的3份中每份中添加乙酸，乙酸的添加质量分别是微生物液体菌肥的质量的0.01％、0.05％、0.1％，不做处理的一份为空白对照。
将4份液体菌肥分别封装后放常温下(25℃±1℃)贮藏，每个月对其细胞存活数量进行检测。检测方法：平板计数法；按以下公式计算不同处理下微生物液体菌肥的活菌存活率：
存活率＝微生物液肥在贮藏n个月时的活菌数/微生物液肥的初始活菌数×100％，其中n＝1，2，3或4。
表6不同处理的微生物液体菌肥的存活率
检测结果表明，在本发明制备的微生物液体菌肥中添加乙酸可以使微生物液体菌肥的活菌存活率在常温下贮藏3个月内基本保持稳定，且用甲酸、柠檬酸替换乙酸可以收到同样的技术效果，可见，在制备微生物液体菌肥时，添加有机酸对改进该菌肥所含芽孢杆菌活菌数的稳定、提高液体菌肥的贮藏稳定性至关重要。
此外，采用添加了有机酸的微生物液体菌肥，在使用前用适量的浓度为6mol/l的氢氧化钠溶液调节其ph至7.0，采用同样的方法稀释和施用，其技术效果与实施例3基本一致。
以上仅是本发明的若干个具体实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。