本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及用于修复土壤的复合微生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
土壤是大气、水体以及固体废弃物中污染物在环境中迁移、直流和沉积的目标，是长期环境污染的承受着，随着社会经济和工业化发展加快，某些工业废水造成了土壤重金属污染，氨氮污染、有机物污染等等。
对于土壤污染的修复技术与方法，国外自70年代末80年代初已经开始研究，初期一般采用物理和化学方法进行污染土壤的修复，如热处理法和化学浸出法，但费用昂贵，不适于大面积应用。80年代末和90年代初期，国外开始研究基于物理、化学过程的微生物、植物分解代谢土壤污染的生物修复方法，近几年发展非常迅速，不仅较物理、化学方法经济，同时也不易产生二次污染，更适于大面积土壤的修复，而生物修复技术已经开始作为了土壤修复的主要处理技术，而且扮演了越来越重要的角色，但是目前的修复技术能存在氨氮去除率低，微生物不稳定、酶法处理容易失活等问题，因此，亟待全面解决并修复土壤中重金属污染、氨氮污染以及有机物污染等问题。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是提供一种用于土壤修复的复合微生物制剂，该复合微生物制剂主要用于去除土壤中氨氮、磷、重金属等的污染。
本发明的另一目的在于提供上述用于土壤修复的复合微生物制剂的制备方法和应用。
技术方案：本发明提供了一种用于修复土壤的复合微生物制剂，该复合微生物制剂包括盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂、谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂。
其中，所述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂、谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620的重量比为0.1～2:1～5:3～7。
其中，所述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的活菌含量为3×108～5×1010cfu/g，所述谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的活菌含量为2×109～5×1010cfu/g，所述脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620的活菌含量为5×108～7×1010cfu/g。
本发明内容还包括一种制备所述的用于修复土壤的复合微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：将盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂、谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂按0.1～2:1～5:3～7的质量比混合均匀即得。
其中，所述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的制备方法包括：将盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)培养到对数期，然后按培养基体积3％～10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30～35℃，摇床震荡180～220rpm，培养40～48小时，得到盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭一种或几种。
其中，所述培养基为1.5g/l醋酸钠、0.06g/l蛋白胨、0.8g/l碳酸氢钠、0.5g/l硫代硫酸钠、0.3g/l氯化钠、0.2g/l硫酸镁和0.07g/l磷酸二氢钾。
其中，所述谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的制备方法包括：将谷氨酸棒杆菌atcc13032在lb培养基中培养到对数期，然后按培养基体积3％～6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到完全培养基中，30～40℃下，摇床震荡120～180rpm，培养24～48小时，加入吸附剂，干燥，制得谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭中的一种或几种。
其中，所述脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂的制备方法包括：将脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620在种子培养基中培养到对数期，然后按照培养基体积的5％～10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到发酵培养基中，28～30℃，摇床震荡160～180rpm，培养24～48小时，加入吸附剂，干燥，制得脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭中的一种或几种。
其中，所述种子培养基包括：7g/l甲醇、3g/l硫酸铵、2g/l磷酸二氢钾、3g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钠；所述发酵培养基包括：15g/l甲醇、2g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1.5g/l硫酸镁、3g/l磷酸氢二钠、1.5g/l微量元素液、1.3g/l维生素辅液。
其实，所述的微量元素液包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钙和水混合得到，其中硫酸亚铁浓度为100g/l、硫酸锌浓度为20g/l、硫酸锰浓度为10g/l、氯化钙浓度为200g/l。
其中，所述维生素辅液包括叶酸、核黄素、泛酸钙、生物素和水混合得到，所述叶酸浓度为3g/l，核黄素浓度为300g/l、泛酸钙浓度为500g/l、生物素浓度为5g/l。
本发明内容还包括所述的用于修复土壤的复合微生物制剂在重金属、氨氮、磷污染土壤修复中的应用。
有益效果：本发明首次将盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂、谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620混合制备得到了微生物制剂，该微生物制剂借助了盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂能够有效吸附土壤中重金属，吸附氨氮、磷的同时并实现土壤的自净功能，脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620能够在同体系内将nh4+-n转化为无害的气体，同时发明人将上述三种微生物制剂联合使用发现，在脱氮磷方面以及重金属吸附方面的效果远远优于分别单独和分别两两联合使用两种菌剂的效果，氨氮去除率达到了95％以上，p的去除率到达了95％、重金属cu、cd的去除率同时也达到了96％以上。
具体实施方式
本发明中盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)为中国科学院微生物研究所馈赠，谷氨酸棒杆菌atcc13032购买于美国atcc细胞库、脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620购买于中国普通微生物菌株保藏管理中心。本发明中所有的试剂均为市面上购买获得。
实施例1用于土壤修复的复合微生物制剂的制备
盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的制备方法包括：将盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30℃摇床震荡220rpm，培养48小时，得到盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)的发酵液，向该发酵液中加入活性炭，干燥，即得盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂。该培养基为1.5g/l醋酸钠、0.06g/l蛋白胨、0.8g/l碳酸氢钠、0.5g/l硫代硫酸钠、0.3g/l氯化钠、0.2g/l硫酸镁和0.07g/l磷酸二氢钾。该盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的活菌含量为3×108cfu/g。
谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的制备方法包括：将谷氨酸棒杆菌atcc13032在lb培养基中培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到完全培养基中，30℃下，摇床震荡180rpm，培养48小时，加入活性炭，干燥，制得谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂。所述谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的活菌含量为2×109cfu/g。
脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂的制备方法包括：将脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620在种子培养基中培养到对数期，然后按照培养基体积的5％的接种量将培养到对数期的菌种接种到发酵培养基中，28℃，摇床震荡180rpm，培养24小时，加入活性炭，干燥，制得脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂。种子培养基包括：7g/l甲醇、3g/l硫酸铵、2g/l磷酸二氢钾、3g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钠；所述发酵培养基包括：15g/l甲醇、2g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1.5g/l硫酸镁、3g/l磷酸氢二钠、1.5g/l微量元素液、1.3g/l维生素辅液。微量元素液包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钙和水混合得到，其中硫酸亚铁浓度为100g/l、硫酸锌浓度为20g/l、硫酸锰浓度为10g/l、氯化钙浓度为200g/l。维生素辅液包括叶酸、核黄素、泛酸钙、生物素和水混合得到，所述叶酸浓度为3g/l，核黄素浓度为300g/l、泛酸钙浓度为500g/l、生物素浓度为5g/l。所述脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620的活菌含量为5×108cfu/g。
用于修复土壤的复合微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：将上述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂、谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂按0.1:1:3的质量比混合均匀即得。
实施例2用于土壤修复的复合微生物制剂的制备
盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的制备方法包括：将盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)培养到对数期，然后按培养基体积10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，35℃，摇床震荡180rpm，培养40小时，得到盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭一种或几种。培养基为1.5g/l醋酸钠、0.06g/l蛋白胨、0.8g/l碳酸氢钠、0.5g/l硫代硫酸钠、0.3g/l氯化钠、0.2g/l硫酸镁和0.07g/l磷酸二氢钾。所述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的活菌含量为5×1010cfu/g。
谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的制备方法包括：将谷氨酸棒杆菌atcc13032在lb培养基中培养到对数期，然后按培养基体积6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到完全培养基中，40℃下，摇床震荡120rpm，培养48小时，加入膨润土，干燥，制得谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂。所述谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的活菌含量为2×109cfu/g。
脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂的制备方法包括：将脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620在种子培养基中培养到对数期，然后按照培养基体积的10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到发酵培养基中，30℃，摇床震荡180rpm，培养48小时，加入膨润土，干燥，制得脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂。种子培养基包括：7g/l甲醇、3g/l硫酸铵、2g/l磷酸二氢钾、3g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钠；所述发酵培养基包括：15g/l甲醇、2g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1.5g/l硫酸镁、3g/l磷酸氢二钠、1.5g/l微量元素液、1.3g/l维生素辅液。微量元素液包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钙和水混合得到，其中硫酸亚铁浓度为100g/l、硫酸锌浓度为20g/l、硫酸锰浓度为10g/l、氯化钙浓度为200g/l。维生素辅液包括叶酸、核黄素、泛酸钙、生物素和水混合得到，所述叶酸浓度为3g/l，核黄素浓度为300g/l、泛酸钙浓度为500g/l、生物素浓度为5g/l。所述脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620的活菌含量为7×1010cfu/g。
用于修复土壤的复合微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：将上述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂、谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620按2:5:7的质量比混合均匀即得。
实施例3用于土壤修复的复合微生物制剂的制备
盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的制备方法包括：将盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)培养到对数期，然后按培养基体积5％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，33℃，摇床震荡200rpm，培养44小时，得到盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)的发酵液，向该发酵液中加入膨润土，干燥，即得盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂。培养基为1.5g/l醋酸钠、0.06g/l蛋白胨、0.8g/l碳酸氢钠、0.5g/l硫代硫酸钠、0.3g/l氯化钠、0.2g/l硫酸镁和0.07g/l磷酸二氢钾。所述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的活菌含量为2.5×1010cfu/g。
谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的制备方法包括：将谷氨酸棒杆菌atcc13032在lb培养基中培养到对数期，然后按培养基体积4％的接种量将培养到对数期的菌种接种到完全培养基中，35℃下，摇床震荡150rpm，培养36小时，加入膨润土，干燥，制得谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂。所述谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的活菌含量为2.5×1010cfu/g。
脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂的制备方法包括：将脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620在种子培养基中培养到对数期，然后按照培养基体积的7％的接种量将培养到对数期的菌种接种到发酵培养基中，29℃，摇床震荡170rpm，培养36小时，加入膨润土，干燥，制得脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂。种子培养基包括：7g/l甲醇、3g/l硫酸铵、2g/l磷酸二氢钾、3g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钠；所述发酵培养基包括：15g/l甲醇、2g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1.5g/l硫酸镁、3g/l磷酸氢二钠、1.5g/l微量元素液、1.3g/l维生素辅液。微量元素液包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钙和水混合得到，其中硫酸亚铁浓度为100g/l、硫酸锌浓度为20g/l、硫酸锰浓度为10g/l、氯化钙浓度为200g/l。维生素辅液包括叶酸、核黄素、泛酸钙、生物素和水混合得到，所述叶酸浓度为3g/l，核黄素浓度为300g/l、泛酸钙浓度为500g/l、生物素浓度为5g/l。所述脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620的活菌含量为3.5×1010cfu/g。
用于修复土壤的复合微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：将上述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂、谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620按2.5：3：4的质量比混合均匀即得。
对比例1两种菌剂混合得到的修复土壤的复合微生物制剂
盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的制备方法包括：将盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30℃摇床震荡220rpm，培养48小时，得到盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)的发酵液，向该发酵液中加入活性炭，干燥，即得盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂。该培养基为1.5g/l醋酸钠、0.06g/l蛋白胨、0.8g/l碳酸氢钠、0.5g/l硫代硫酸钠、0.3g/l氯化钠、0.2g/l硫酸镁和0.07g/l磷酸二氢钾。该盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的活菌含量为3×108cfu/g。
谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的制备方法包括：将谷氨酸棒杆菌atcc13032在lb培养基中培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到完全培养基中，30℃下，摇床震荡180rpm，培养48小时，加入活性炭，干燥，制得谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂。所述谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的活菌含量为2×109cfu/g。
用于修复土壤的复合微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：将上述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂、谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂按0.1:1的质量比混合均匀即得。
对比例2两种菌剂混合得到的修复土壤的复合微生物制剂
盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的制备方法包括：将盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)培养到对数期，然后按培养基体积10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，35℃，摇床震荡180rpm，培养40小时，得到盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭一种或几种。培养基为1.5g/l醋酸钠、0.06g/l蛋白胨、0.8g/l碳酸氢钠、0.5g/l硫代硫酸钠、0.3g/l氯化钠、0.2g/l硫酸镁和0.07g/l磷酸二氢钾。所述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂的活菌含量为5×1010cfu/g。
脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂的制备方法包括：将脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620在种子培养基中培养到对数期，然后按照培养基体积的10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到发酵培养基中，30℃，摇床震荡180rpm，培养48小时，加入膨润土，干燥，制得脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂。种子培养基包括：7g/l甲醇、3g/l硫酸铵、2g/l磷酸二氢钾、3g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钠；所述发酵培养基包括：15g/l甲醇、2g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1.5g/l硫酸镁、3g/l磷酸氢二钠、1.5g/l微量元素液、1.3g/l维生素辅液。微量元素液包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钙和水混合得到，其中硫酸亚铁浓度为100g/l、硫酸锌浓度为20g/l、硫酸锰浓度为10g/l、氯化钙浓度为200g/l。维生素辅液包括叶酸、核黄素、泛酸钙、生物素和水混合得到，所述叶酸浓度为3g/l，核黄素浓度为300g/l、泛酸钙浓度为500g/l、生物素浓度为5g/l。所述脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620的活菌含量为7×1010cfu/g。
用于修复土壤的复合微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：将上述盘状螺旋蓝细菌(spirulinaplatensis)菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620按2:7的质量比混合均匀即得。
对比例3两种菌剂混合得到的修复土壤的复合微生物制剂
谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的制备方法包括：将谷氨酸棒杆菌atcc13032在lb培养基中培养到对数期，然后按培养基体积4％的接种量将培养到对数期的菌种接种到完全培养基中，35℃下，摇床震荡150rpm，培养36小时，加入膨润土，干燥，制得谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂。所述谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂的活菌含量为2.5×1010cfu/g。
脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂的制备方法包括：将脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620在种子培养基中培养到对数期，然后按照培养基体积的7％的接种量将培养到对数期的菌种接种到发酵培养基中，29℃，摇床震荡170rpm，培养36小时，加入膨润土，干燥，制得脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620菌剂。种子培养基包括：7g/l甲醇、3g/l硫酸铵、2g/l磷酸二氢钾、3g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钠；所述发酵培养基包括：15g/l甲醇、2g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1.5g/l硫酸镁、3g/l磷酸氢二钠、1.5g/l微量元素液、1.3g/l维生素辅液。微量元素液包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钙和水混合得到，其中硫酸亚铁浓度为100g/l、硫酸锌浓度为20g/l、硫酸锰浓度为10g/l、氯化钙浓度为200g/l。维生素辅液包括叶酸、核黄素、泛酸钙、生物素和水混合得到，所述叶酸浓度为3g/l，核黄素浓度为300g/l、泛酸钙浓度为500g/l、生物素浓度为5g/l。所述脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620的活菌含量为3.5×1010cfu/g。
用于修复土壤的复合微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：将谷氨酸棒杆菌atcc13032菌剂和脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)cgmccno.10620按3：4的质量比混合均匀即得。
实施例4
按照目前常规的测试方法测定氨氮、重金属cd、cu、po43+降解能力：
1)选取被氨氮、重金属cd、cu、po43+等污染的土壤，平均分成18份，分别置于消毒后的容器中，将18份灭菌后的土壤分成6组，每组3份。
2)取实施例1～3和对比例1～3制得的用于修复土壤的复合微生物制剂，每个实施例/对比例制得的用于修复土壤的复合微生物制剂对应加入到其中一组土壤中，混合均匀，其中土壤中加入的用于修复土壤的复合微生物制剂的质量占土壤质量的0.5％。
3)两个月后检测经处理后的土壤中氨氮、重金属cd、cu、po43+等的含量，每组3份取平均值，结果如表1所示。
表1