本发明属于人工金属酶领域，具体涉及一种脱色过氧化物酶及其制备方法与应用，尤其是涉及一种基于肌红蛋白三点突变体的高效人工脱色过氧化物酶及其制备方法与应用。
背景技术：
：染料脱色过氧化物酶(dye-decolorizingperoxidases,dyps)是一类新型的含血红素过氧化物酶，广泛存在于细菌、真菌和其他微生物中，可应用于多种工业染料的降解，因而在水环境污染治理等领域具有一定的应用前景。然而，天然脱色过氧化物酶获得相对困难，而且这些生物酶催化条件相对苛刻，通常在较酸的条件下才具有一定的生物催化功能。例如，从霍乱弧菌(vibriocholerae,vcdyp)中提取的脱色过氧化物酶，在酸性(ph4)条件下表现出较高的催化氧化活性蓝物质19(reactiveblue，rb19)脱色活性。因而，这些苛刻条件在一定程度上限制天然脱色过氧化物酶的广泛应用。此外，虽然天然脱色过氧化物酶dyps属于过氧化物酶(peroxidase)超家族，但它们与过氧化物酶家族的其它成员相比，几乎没有序列同源性，也较少有结构相似性。所以，用天然过氧物酶如辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,hrp)替代天然脱色过氧化物酶的做法并不可取。因此，设计并制备一种新型的人工脱色过氧化物酶非常重要。而人工金属酶的分子设计，对于认识天然酶的结构与功能关系，以及制备具有潜在应用价值的人工金属酶尤为重要。前期的研究报道已经基于运输氧功能的肌红蛋白(myoglobin,mb)分子，设计了双点突变体f43y/f138wmb，虽然具有显著的染料脱色过氧化物酶活性，但具有一定的过氧化氢(h2o2)的依赖性，如需要在50mmh2o2浓度下，才能表现出明显的催化活性。而且，催化时间相对较长，如需要100s才能将0.1mmrb19脱色完全。因此，进一步设计并制备一种高效的人工脱色过氧化物酶非常至关重要，才能使其在水环境污染治理中具有实际的应用前景。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷提供一种高效的脱色过氧化物酶及其制备方法与应用。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：本发明利用运输氧功能的肌红蛋白作为蛋白质分子设计骨架，在肌红蛋白血红素活性中心附近43位引入酪氨酸、138位引入色氨酸、且同时在血红素活性中心外围88位引入色氨酸，模拟天然天然脱色过氧化物酶的结构，构建具有催化功能的人工金属酶，获得三点突变体蛋白f43y/f138w/p88wmb，即一种新型的高效人工脱色过氧化物酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明还提供了编码所述的脱色过氧化物酶的dna分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的脱色过氧化物酶的核苷酸序列。本发明还提供了所述脱色过氧化物酶的制备方法，运用定点突变技术，在肌红蛋白血红素活性中心附近43位引入酪氨酸、138位引入色氨酸、且同时在血红素活性中心外围88位引入色氨酸，宿主细胞中表达后分离纯化。作为优选，本发明所述制备方法所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括rosetta系列和bl21系列菌株。在一个实施方案中，宿主细胞为bl21(de3)菌株。作为优选，本发明所述制备方法所述分离纯化的方法为依次使用离子交换柱和凝胶柱分离。在一些实施例中，所述离子交换柱层析的填料为deae52树脂；所述凝胶柱层析的填料为superdex75。本发明所述三突变体f43y/f138w/p88wmb人工脱色过氧化物酶，能够在低h2o2浓度下数秒内使rb19分子脱色，且其催化效率较双点突变体蛋白增加了130％。因此本发明还提供了所述脱色过氧化物酶在降解工业废水的染料中的应用。本发明还提供了一种工业染料废水脱色的方法，在h2o2存在下，加入权利要求1所述脱色过氧化物酶对含有工业染料的废水进行反应。作为优选，所述工业染料废水脱色的方法中，所述h2o2的浓度为1-5mm。在一些实施例中，所述h2o2的浓度为5mm。作为优选，所述工业染料废水脱色的方法中，所述脱色过氧化物酶的度为1-7μm。在一些实施例中，所述脱色过氧化物酶的度为7μm。作为优选，所述工业染料废水脱色的方法中，所述反应温度为25℃，所述反应ph值为7.0。作为优选，所述工业染料废水脱色的方法中，所述工业染料为活性蓝(rb19)。进一步作为优选，所述工业染料废水脱色的方法中，所述工业染料的浓度为0.0025-0.1mm。在一些实施例中，所述工业染料的浓度为0.1mm。由上述技术方案可知，本发明提供了一种高效的脱色过氧化物酶及其制备方法与应用。本发明所述脱色过氧化物酶是利用运输氧功能的肌红蛋白作为蛋白质分子设计骨架，在肌红蛋白血红素活性中心附近43位引入酪氨酸、138位引入色氨酸、且同时在血红素活性中心外围88位引入色氨酸获得三点突变体蛋白f43y/f138w/p88wmb，其氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明所述脱色过氧化物酶保持了双点突变体蛋白对染料分子的亲和性，提高了催化转化数，降低了对过氧化氢的依耐性。本发明所述脱色过氧化物酶制备方法操作简单，适合大规模产业化生产。实验表明，本发明所述脱色过氧化物酶在低过氧化氢浓度下，即可在数秒内降解染料分子，达到脱色效果，其催化效率比双点突变体蛋白增加了130％，从而可以广泛应用到工业染料废水的污染治理中。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为f43y/f138w/p88wmb质谱图；图2为f43y/f138w/p88wmb在h2o2存在下催化rb19氧化脱色的全谱变化，插图为rb19特征峰595nm处吸收值随反应时间的变化趋势；图3为f43y/f138w/p88wmb催化rb19氧化脱色反应前(左)和反应10s后(右)的溶液颜色图；图4为f43y/f138wmb在h2o2存在下催化rb19氧化脱色的全谱变化，插图为rb19特征峰595nm处吸收值随反应时间的变化趋势；图5为f43y/f138wmb催化rb19氧化脱色反应前(左)、反应10s后(中)和反应100s后(右)的溶液颜色图；图6为wtmb在h2o2存在下催化rb19氧化脱色的全谱变化，插图为rb19特征峰595nm处吸收值随反应时间的变化趋势；图7为wtmb催化氧化rb19氧化脱色反应前(左)和反应100s后(右)的溶液颜色图；图8为wtmb和不同突变体蛋白催化rb19氧化的稳态速率常数与底物rb19不同浓度(0.0025-0.1mm)之间的关系。具体实施方式本发明公开了一种脱色过氧化物酶及其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1基于基因工程和蛋白质工程，运用定点突变技术，在肌红蛋白血红素活性中心附近43位引入酪氨酸、138位引入色氨酸、且同时在血红素活性中心外围88位引入色氨酸，进而在大肠杆菌bl21(de3)中表达，并通过离子交换柱(deae52树脂)和凝胶柱(superdex75)分离方法，进行蛋白质分离纯化，获得f43y/f138w/p88wmb突变体蛋白。蛋白质分子量如质谱所示(图1)。f43y/f138w/p88wmb突变体氨基酸序列(seqidno.1)如下：vlsegewqlvlhvwakveadvaghgqdilirlfkshpetlekydrfkhlkteaemkasedlkkhgvtvltalgailkkkghheaelkwlaqshatkhkipikylefiseaiihvlhsrhpgdfgadaqgamnkalelwrkdiaakykelgyqg。实施例2用100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)配制7μmf43y/f138w/p88wmb。同时，用离子水配制配置10mmh2o2和10mm活性蓝物质rb19(reactiveblue，rb19)母液，浓度用紫外光谱标定(h2o2为ε240nm＝39.4m-1cm-1，rb19为ε595nm＝10mm-1cm-1)。取上述f43y/f138w/p88wmb溶液2ml，加入20μl10mmrb19母液，混合均匀置于快速停留光谱仪c进样器，并取10mmh2o22ml置于d进样器。催化反应由c和d进样器进样混合后进行，反应时间为10s，共采集500个光谱(图2)。监测rb19特征吸收595nm吸收峰随时间的变化(图2插图)。结果显示，f43y/f138w/p88wmb可在数秒(5s)内使染料rb19在595nm处的吸收峰消失。实施例3用100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)配制7μmf43y/f138w/p88wmb。同时，用离子水配制配置10mmh2o2和10mm活性蓝物质rb19母液(reactiveblue，rb19)，浓度用紫外光谱标定(h2o2为ε240nm＝39.4m-1cm-1，rb19为ε595nm＝10mm-1cm-1)。取两个规格相同的比色皿(干净且干燥)，各加入上述f43y/f138w/p88wmb溶液1ml，并分别加入10μl10mmrb19母液混合均匀。向其中一个比色皿加入1ml100mm磷酸盐缓冲液，另外一个比色皿加入1ml10mmh2o2，该操作要求同时进行。反应5s并迅速拍照，反应前后溶液颜色如图3。结果显示，f43y/f138w/p88wmb可在数秒(5s)内使染料rb19脱色。实施例4用100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)配制7μmf43y/f138wmb。同时用离子水配制配置50mmh2o2和100mm活性蓝物质rb19(reactiveblue，rb19)母液，浓度用紫外光谱标定(h2o2为ε240nm＝39.4m-1cm-1，rb19为ε595nm＝10mm-1cm-1)。取上述f43y/f138wmb溶液2ml，加入2μl100mmrb19母液，混合均匀置于快速停留光谱仪c进样器，并取50mmh2o22ml置于d进样器。催化反应由c和d进样器进样混合后进行，反应时间为100s，共采集500个光谱(图4)。监测rb19特征吸收595nm吸收峰随时间的变化(图4插图)。结果显示，f43y/f138wmb可在100s内使染料rb19在595nm处的吸收峰消失。实施例5用100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)配制7μmf43y/f138wmb。同时用离子水配制配置50mmh2o2和100mm活性蓝物质rb19(reactiveblue，rb19)母液，浓度用紫外光谱标定(h2o2为ε240nm＝39.4m-1cm-1，rb19为ε595nm＝10mm-1cm-1)。取两个规格相同的比色皿(干净且干燥)，各加入上述f43y/f138wmb溶液1ml，并分别加入1μl100mmrb19母液混合均匀。向其中一个比色皿加入1ml100mm磷酸盐缓冲液，另外一个比色皿加入1ml50mmh2o2，该操作要求同时进行。反应前、反应10s和100s后拍照，溶液颜色如图5。结果显示，f43y/f138wmb反应10s时染料rb19未完全褪色，但可在100s内使染料rb19脱色。实施例6用100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)配制7μmwtmb。同时用离子水配制配置50mmh2o2和100mm活性蓝物质rb19(reactiveblue，rb19)母液，浓度用紫外光谱标定(h2o2为ε240nm＝39.4m-1cm-1，rb19为ε595nm＝10mm-1cm-1)。取上述wtmb溶液2ml，加入2μl100mmrb19母液，混合均匀置于快速停留光谱仪c进样器，并取50mmh2o22ml置于d进样器。催化反应由c和d进样器进样混合后进行，反应时间为100s，共采集500个光谱(图6)。监测rb19特征吸收595nm吸收峰随时间的变化(图6插图)。结果显示，wtmb在100s内仅使染料rb199在595nm处的吸收峰稍微降低。实施例7用100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)配制7μmwtmb。同时用离子水配制配置50mmh2o2和100mm活性蓝物质rb19(reactiveblue，rb19)母液，浓度用紫外光谱标定(h2o2为ε240nm＝39.4m-1cm-1，rb19为ε595nm＝10mm-1cm-1)。取两个规格相同的比色皿(干净且干燥)，各加入上述wtmb溶液1ml，并分别加入1μl100mmrb19母液混合均匀。向其中一个比色皿加入1ml100mm磷酸盐缓冲液，另外一个比色皿加入1ml50mmh2o2，该操作要求同时进行。反应100s后拍照，反应前后溶液颜色如图7。结果显示，wtmb在100s内并不能使染料rb19脱色，颜色稍微降低。实施例8用100mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)分别配制7μmwtmb、f43y/f138wmb和f43y/f138w/p88wmb。同时用离子水配制配置10mmh2o2、50mmh2o2和100mm活性蓝物质rb19(reactiveblue，rb19)母液，浓度用紫外光谱标定(h2o2为ε240nm＝39.4m-1cm-1，rb19为ε595nm＝10mm-1cm-1)。取上述wtmb溶液2ml，加入不同体积100mmrb19母液(终浓度为0.01-0.1mm)，混合均匀置于快速停留光谱仪c进样器，并取50mmh2o22ml置于d进样器。催化反应由c和d进样器进样混合后进行，反应时间为100s，共采集500个光谱。每个浓度要求多次实验以计算误差。监测595nm处吸收峰随时间的变化，通过对曲线初始线性部分拟合得到rb19氧化的初始反应速率。将初始反应速率对rb19浓度作图，然后用michaelis–menten酶促动力学方程拟合，从拟合出的米氏曲线可以得到催化反应的动力学参数kcat和km。f43y/f138wmb实验步骤与wtmb相同。f43y/f138w/p88wmb实验步骤不同之处在于：①rb19浓度范围为0.0025-0.1mm；②h2o2浓度为10mm；③监测时间为10s采集500个光谱。天然脱色过氧化物酶vcdyp的实验步骤参照uchidat,sasakim,tanakay,ishimorik.biochemistry,2015,54,6610-6621进行。实验结果如图8和表1。表1wtmb和不同突变体蛋白以及天然脱色过氧化物酶vcdyp催化rb19氧化的稳态动力学参数比较mbskcat(s-1)km(μm)kcat/km(m-1s-1)wtmb0.06±0.0178±8770f43y/f138wmb1.66±0.0215±1110670f43y/f138w/p88wmb4.0±0.115.7±1255900vcdyp1.3±0.350±2026000结果显示，三突变体f43y/f138w/p88wmb催化氧化rb19脱色效率(kcat/km)最高，分别是wtmb和f43y/f138wmb的332倍和2.3倍，同时是天然脱色过氧化物酶vcdyp的9.8倍。序列表<110>南华大学<120>一种脱色过氧化物酶及其制备方法与应用<130>mp1806968<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>153<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1valleusergluglyglutrpglnleuvalleuhisvaltrpalalys151015valglualaaspvalalaglyhisglyglnaspileleuileargleu202530phelysserhisprogluthrleuglulystyraspargphelyshis354045leulysthrglualaglumetlysalasergluaspleulyslyshis505560glyvalthrvalleuthralaleuglyalaileleulyslyslysgly65707580hishisglualagluleulystrpleualaglnserhisalathrlys859095hislysileproilelystyrleuglupheileserglualaileile100105110hisvalleuhisserarghisproglyasppheglyalaaspalagln115120125glyalametasnlysalaleugluleutrparglysaspilealaala130135140lystyrlysgluleuglytyrglngly145150当前第1页12