雷酚内酯苷类化合物及其应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种雷酚内酯苷类化合物及其应用。

背景技术

雷公藤(tripterygiumwilfordii)系卫矛科植物，作为传统中药，它被运用于多种疾病的治疗已有相当长的历史。主要分布于我国长江流域以南山区和北长白山区。雷公藤作为一种传统中药在我国已有几千年的药用历史。作为药物，雷公藤主要用于治疗类风湿性关节炎和某些皮肤病。自上世纪60年代开始雷公藤制剂用于治疗炎症、癌症、麻风病、慢性肾炎、系统性红斑狼疮等疾病。雷公藤主要含有倍半萜、二萜、三萜化合物及少量木脂素和其它成分。

雷酚内酯(triptophenolide)是一种二萜类化合物，主要存在于卫矛科植物中，如昆明山海棠、雷公藤的根皮和心木。现代药理研究表明，雷酚内酯具有具有抗炎免疫作用外也能作为雄激素受体拮抗剂，雷酚内酯对列腺癌细胞有一定的抑制作用。但是雷酚内酯水溶性差，对雷酚内酯进行葡萄糖糖基化后能显著提高雷酚内酯水溶性，更有利于雷酚内酯成药。雷酚内酯在细胞培养基中溶解性差，雷酚内酯糖基化后形成的雷酚内酯苷可以溶解于细胞培养基。

技术实现要素：

本发明涉及一种雷酚内酯苷类化合物，所述化合物具有如下结构式：

其中，r为糖基。

进一步地，所述糖基选自葡萄糖基或葡萄糖醛酸基。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种具有如下结构式的雷酚内酯苷：

本发明另一方面，提供了本发明所述化合物在制备具有抗炎、免疫调节和抗肿瘤药物中的运用。

本发明的又一方面，提供了一种包含本发明所述化合物的组合物，所述组合物通过将其它抗炎、免疫调节或抗肿瘤药物与所述雷酚内酯苷类化合物联合使用，以达到联合用药的目的。

本发明的再一方面，提供了一种包含本发明所述雷酚内酯苷类化合物的药物制剂，所述药物制剂还含有制药上可接受的赋形剂，适合的剂型可以是口服制剂，如口服固体制剂或口服液体制剂，或注射剂、或乳剂。

本发明的再一方面，提供了本发明所述雷酚内酯类化合物或包含本发明所述雷酚内酯类化合物的组合物，在制备具有抗炎、免疫调剂或抗肿瘤药物中的运用。本发明药理实验表明雷酚内酯苷可以抑制脑胶质瘤细胞，乳腺癌细胞，宫颈癌细胞，人类红白血病细胞的生长。

本发明的还一方面，提供了一种制备本发明所述雷酚内酯类化合物的方法，所述方法包括：在适于酶促反应的条件下，使糖基供体和雷酚内酯与糖基转移酶进行反应，从而将糖基供体转移到雷酚内酯的羟基上，分离纯化酶催化产物得到雷酚内酯苷化合物，所述糖基转移酶为氧糖基转移酶。

一个具体的糖基转移酶是雷公藤糖基转移酶twugte1，因此，本发明的一个实施方案中，提供了一种一种获取雷公藤糖基转移酶的方法，通过构建雷公藤糖基转移酶基因，并将转移转入宿主细胞中，在培养基中发酵表达并纯化表达所获得的蛋白，即获得雷公藤糖基转移酶。

所述雷公藤糖基转移酶具有seqidno：2所述氨基酸序列，编码所述雷公藤转移酶的雷公藤糖基转移酶基因twugpt1的核苷酸序列如seqidno：1所示。

所述糖基供体为尿苷二磷酸糖基转移酶，优选为udp-葡萄糖或udp-葡糖醛酸，所述纯化产物雷酚内酯苷的方法为高效液相色谱法。

附图说明

图1为雷酚内酯苷的质谱图。

图2为雷酚内酯苷的核磁氢谱图。

图3为雷酚内酯苷的核磁碳谱图。

图4为雷酚内酯苷的hmbc谱图。

图5为雷酚内酯苷的cosy谱图。

图6为雷酚内酯苷的hmqc谱图。

图7为雷酚内酯苷不同给药浓度下不同细胞存活率曲线图。

图8为在mcf-7细胞中雷酚内酯和雷酚内酯苷水溶性的比较(control为对照试验未加药物，trip为在培养基中加入雷酚内酯；trip-side为在培养基中加入雷酚内酯苷；在雷酚内酯的浓度为50μm时，在培养基中已出现结晶；雷酚内酯苷的浓度为800μm时，培养基中无结晶出现)。

具体实施方式

以下通过优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征，本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明，而不是限制本发明的范围。在不背离权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。例如，将实施例中所实用的启动子和表达载体替换为本领域中常用的其它启动子和表达载体，是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的雷公藤(tripterygiumwilfordiihook.f.)悬浮细胞在文献“雷公藤4-(5’-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析.中国中药杂志,2015,40(21):4165-4170”中公开过，公众可从首都医科大学分子生药与中药资源实验室获得。

实施例1构建雷公藤糖基转移酶编码基因twugpt1并表达获得twugpt1

1、雷公藤悬浮细胞总rna提取及cdna第一链的获得

取雷公藤悬浮细胞，迅速放于液氮中，-80℃低温保存备用，用于提取rna，提取方法按照总rna提取试剂盒(上海普罗麦格生物产品有限公司)操作说明书进行；并利用fastkingcdna第一链合成试剂盒(天根生化科技北京有限公司)进行反转录获得cdna。

2、引物设计及pcr扩增

根据雷公藤转录组数据注释筛选得到基因全长序列片段，利用primer5设计特异性引物twugte1-r和twugte1-f引物，将设计的引物送睿博生物技术有限公司合成，-20℃保存，引物序列如下：

twugte1-rccacatcactcaacgtagtacatac(idno：3)

twugte1-fctaccttatcctaattcacgcttac(idno：4)

参照kapahifi高保真酶(北京普凯瑞生物科技有限公司)的扩增方法克隆目标序列的全长基因，反应体系如下：

反应程序：98℃预变性3min；98℃变性20s，53℃退火15s，72℃延伸2min为一个循环，共计35个循环，最后72℃再延伸7min；取pcr产物5μl代替cdna，利用上述反应体系进行二次扩增。pcr反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；pcr反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，160v电压，电泳30min。目的条带用胶回收试剂盒(thermo公司)的方法切胶回收。

3、连接克隆载体，转化感受态细胞，筛选阳性克隆并测序

将质量浓度符合要求的pcr产物连接到peasy-bluntzero载体(北京全式金生物技术有限公司)上，连接体系如下：

将添加好的反应体系在30℃放置15min进行连接，连接产物放置在冰上，转化到transt1大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，转化过程如下：

(1)连接好的载体加入到transt1感受态细胞中，冰上放置30min；

(2)42℃热激30s，取出放冰上2min；

(3)添加液体lb培养基500μl，37℃的摇床上180r/min震荡培养1h，在含氨苄抗性的固体培养基上37℃培养过夜，挑选单菌落送睿博生物科技有限公司完成测序。

4、将基因twugte1构建到paml-c2x表达载体中

将测序结果正确的菌株和pmal-c2x载体菌株分别接种到含相应抗性的液体lb培养基中，37℃、220r/min下震荡培养12～16h，用质粒小提试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取质粒。

设计目的基因特异性的引物，送睿博兴科生物技术有限公司合成。

f:cgcggatccatgcaggaggacaaattcacatatt(idno：5)

r:tgcactgcagcttccattgctcgactagcttggcc(idno：6)

以测序正确的质粒为模板，用高保真酶扩增得到插入片段扩增产物。

pcr反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，160v电压，电泳30min。目的条带用胶回收试剂盒(thermo公司)的方法切胶回收，利用genovanano三合一超微量分光光度计测定回收twugte1基因的浓度。

将载体pmal-c2x和twugte1基因分别用bamhi和pstihf限制性内切酶进行双酶切，酶切体系如下：

37℃水浴酶切2h，2％琼脂糖凝胶电泳，目的条带用胶回收试剂盒(thermo公司)的方法切胶回收。

于冰水浴中配制重组反应体系，反应体系如下：

重组反应体系克隆载体使用量为0.018pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量约为0.036pmol。

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，50℃反应15min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min，之后，将反应产物进行转化到transt1大肠杆菌感受态细胞中在含氨苄抗性的固体培养基上37℃培养过夜，挑选单菌落送睿博兴科生物科技有限公司完成测序。测序结果正确的菌株接种至50ml含有100mg/l氨苄西林的lb培养基中培养过夜，质粒小提试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取质粒，质粒存放于-20℃冰箱保存。

5、重组大肠杆菌制备、酶的发酵表达及纯化

pmal-c2x-twugte1转化到bl21(de3)大肠杆菌(北京全式金生物技术有限公司)表达感受态细胞中，转化过程按说明书操作。

蛋白诱导表达：

(1)将重组质粒与空载体pmal-c2x分别转化到大肠杆菌表达型感受态细胞bl21(de3),选取阳性单克隆菌落37℃，250r·min^-1摇14h后,按1.5‰的比例各扩大培养200ml,37℃摇到od600约为0.6-0.8后,加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度1mm,低温16℃诱导表达18h。

(2)低温诱导的菌液4℃10000×g离心3min收集菌体,resuspensionbuffer5ml重悬。

(3)加入chickenwhitelysozyme(50mg·ml^-1)，于重悬菌体中,至0.5mg·ml^-1,混均,冰上静置20min。

(4)加入10％tritonx-100至终浓度0.1％。加入1/10体积的5mol·l^-1nacl溶液,超声破碎30min(超声5s,暂停5s),4℃、12000×g离心30min。

(5)取1ml的amyloseresin加入到柱子中，amyloseresin事先用5倍柱体积washbuffer清洗。

(6)将破碎的菌液上清加到含有amyloseresin的15ml离心管中，小摇床高转速冰上晃动2h。

(7)加入15倍柱体积washbuffer清洗后再用15倍柱体积resuspensionbuffer清洗。

(8)加入1倍柱体积elutionbuffera洗脱一次。加入两倍柱体积elutionbufferb，4℃摇晃10min后洗脱，重复两次。

(9)将elutionbufferb洗脱液分别用10kd和30kd的超滤管浓缩空载对照蛋白和糖基转移酶融合蛋白，浓缩蛋白于-80℃保存。

实施例2利用twugpt1催化合成雷酚内酯苷

(1)挑取含有重组质粒pmalc2xtwugte1单个阳性克隆e.colibl21(de3)菌落接种于10ml的lb液体培养基(含100mg·l^-1氨苄青霉素)中，37℃，250r·min^-1培养过夜。

(2)按1‰的比例各扩大培养至10l，37℃250r·min^-1摇至od600约为0.6-0.8后，加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度1mm，低温16℃诱导表达20h。

(3)低温诱导的菌液在高速离心机中离心3min(4℃，10000g)收集菌体，弃去培养基。蒸馏水清洗后重悬于300ml含有1mmdtt的tris-hcl(100mm，ph＝8.0)缓冲液中。

(4)利用ats匀质机高压破碎重悬菌液，破碎30min。将破碎菌体于高速离心机中离心20min(4℃，10000g)收集上清液。

(5)300ml上清液中加入udpg至终浓度为1mm和雷酚内酯至终浓度为100μm，40℃水浴中反应24h。

(6)反应液用等体积的乙酸乙酯萃取6次，将萃取液减压蒸发除去乙酸乙酯，用10ml甲醇溶解产物。过0.22μm滤膜后，按1.2.11步骤制备雷酚内酯苷，重复制备反应多次。液相色谱串联高分辨质谱检测反应产物。将雷酚内酯苷溶解于0.5ml氘代dmso至终浓度约为6mg·ml^-1，利用800m核磁测雷酚内酯苷的¹h-nmr、¹³c-nmr、hmbc、hmqc、cosy谱图，以确定雷酚内酯苷的结构。

制备色谱条件：仪器：安捷伦制备液相(agilent1260)；流动相a：水；流动相b：乙腈；10ml·min^-1；进样量5ml；色谱柱：watersc18obd(19×50mm，5μm)；检测波长：210nm；0-10min：95％(a)-70％(a)；20-22min：70％(a)-60％(a)；32-35min:60％(a)-40％(a)；45min:35％(a)。收集25.5min处的馏分，减压旋蒸除去水和乙腈，准确称量生成雷酚内酯苷的质量。

[m+cf3cooh]⁺m/z:587.21.

¹h-nmr(800mhz,dmsod_6),7.160(d,j＝8hz,1h),7.094(d,j＝8hz,1h),4.842-4.921(m,2h),4.482(d,j＝8hz,1h),3.701(m,1h),3.623-3.640(m,1h),3.430(m,1h),3.280(m,1h),3.217(m,1h),3.150(m,1h),3.130(m,1h),3.017(m,1h),2.993(s,br,1h),2.973(m,1h),2.486(m,1h),2.334(m,1h),2.237(m,1h),1.090(m,1h),1.737(m,1h),1.588-1.610(m,1h),1.137(d,j＝6.4hz,3h),1.070(d,j＝7.2hz,3h),0.941(s,3h).

¹³c-nmr(800mhz,dmsod_6),174.084,164.946,152.094,144.394,139.992,129.629,123.985,123.353,120.921,105.093,77.457,76.885,74.579,70.985,70.458,61.615,42.586,36.344,32.563,25.245,24.729,24.050,23.166,22.178,19.520,18.219.

其它位置的连接均通过综合解析2d-nmr包括图4的hmbc、图5的hmbc和图6的h-hcosy得以确定，因此鉴定化合物为雷酚内酯-6-o-β-d-葡萄糖苷(雷酚内酯苷)

实施例3雷酚内酯苷的活性检测实验

1.细胞培养：将u251、u87mg、c6、a549、mcf-7、hepg2、panc-1、hela、k562、rbl-2h3、lo2、hek293、astroglia细胞在37℃、含有5％co2和一定湿度的细胞培养箱中培养h，所用培养基为含10％胎牛血清、2mml--谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、100u/ml青霉素的mem或dmem培养基。每天观察细胞状态和密度，平均每2天更换新鲜培养基1次，3天传代1次。

2.96孔板，铺板数3000-10000个细胞/孔，培养24h后加入不同浓度的药物，继续培养24h和48h后用cellcountingkit-8试剂盒(日本同仁)检测细胞的活性，按说明书30min-4h之间完成检测，计算ic50(表1)。

3.水溶性比较：在mcf-7细胞中加入不同浓度药物24h后，显微镜下拍照，比例尺：200μm。

4.药物四个浓度：12.5，50，200，800μm，结果见下表。

表1不同肿瘤细胞的ic50

序列表

<110>首都医科大学

<120>雷酚内酯苷类化合物及其应用

<141>2018-05-29

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1476

<212>dna

<213>雷公藤(tripterygiumwilfordii)

<400>1

atgcaggaggacaaattcacatattcacacacacacagagaagtttcaatggctgccata60

gttctgtatccaactacaggtatgggccacctcatatccatggtagagttgggcaagctc120

atactcactcaccacccatctttcaccgtcaacatcctcctccccacagctccctacgcc180

actggctctactgctcaatacatttctgccgtctccaccacaaacccatctatcatcttc240

caccaccttccccctgtttctctccctctagaccctgcctcttattcctgtgtcgaagcc300

ctcacgttcgacctcattcgcctcaacaaccccaacgtccacactgcaatccaatcaatt360

tctcaaacatccaccgtccatgccttaatcctggactttttttgtaatgcggctcttgat420

gttgctacagaacttgatgttccagcttactttttccttacttctggtgctagttttcta480

gctctgttttgtcactttccaacaattgacagaagcaccaataagaatttcaaggatctc540

gagactactgttaacctcccttacttgccaccgatacccttgtctcatatgccagagcca600

atgcttgaaaaagacacaacagagtatgctggcttcattgattgctcagttggtttgagt660

aaatcaaccggaatcatcgttaacacgtttagcactctcgaaccaaaagctgtgaaggcc720

ttggcagatggagtttgcaatcctgatggtccaacaccgccagttttctgcattggacca780

ctaattgtcacaaatcgtcaaatcggtaatgagggtgatgataaggtgcttggatctgaa840

tgcttaacttggctcgacaagcaaccaagtcaaagcatagtatttttgtgttttggtagc900

ttgggcttgctttctaaggaacagttgagggaaatagctattggtttggagaagagtggc960

caaaggttcttgtgggtggtacggaacccaccttcggaggacaaaaagcagaggttcctc1020

actcaaccagacccagatctgaattctttgttctctgatggtttcttggaccgtacaaag1080

gagagaggactggtagttaagcggtgggcaccacaggtggcagtgttaaatcatgaagca1140

gttggagggttcgtgactcactgtggctggaactcagttttggaatcggtttgtgcaggt1200

ataccaatggttgcatggccgttatacgcagaacaaaagtttaacaaggcattgctggtt1260

gaggagctgaagctggctttgccaatgaacgagtccgaaactgggttcgttagtgcaacc1320

gaggttgagaagcgagttagagaattgatggagtcggaggaaggtaactcattgagggaa1380

cgagtaacggcaaagagaaatgaagcaatgaaggctatggaagagggtggatcatccagg1440

gttgcattggccaagctagtcgagcaatggaagtaa1476

<210>2

<211>491

<212>prt

<213>雷公藤(tripterygiumwilfordii)

<400>2

metglngluasplysphethrtyrserhisthrhisarggluvalser

151015

metalaalailevalleutyrprothrthrglymetglyhisleuile

202530

sermetvalgluleuglylysleuileleuthrhishisproserphe

354045

thrvalasnileleuleuprothralaprotyralathrglyserthr

505560

alaglntyrileseralavalserthrthrasnproserileilephe

65707580

hishisleuproprovalserleuproleuaspproalasertyrser

859095

cysvalglualaleuthrpheaspleuileargleuasnasnproasn

100105110

valhisthralaileglnserileserglnthrserthrvalhisala

115120125

leuileleuaspphephecysasnalaalaleuaspvalalathrglu

130135140

leuaspvalproalatyrphepheleuthrserglyalaserpheleu

145150155160

alaleuphecyshispheprothrileaspargserthrasnlysasn

165170175

phelysaspleugluthrthrvalasnleuprotyrleuproproile

180185190

proleuserhismetprogluprometleuglulysaspthrthrglu

195200205

tyralaglypheileaspcysservalglyleuserlysserthrgly

210215220

ileilevalasnthrpheserthrleugluprolysalavallysala

225230235240

leualaaspglyvalcysasnproaspglyprothrproprovalphe

245250255

cysileglyproleuilevalthrasnargglnileglyasnglugly

260265270

aspasplysvalleuglyserglucysleuthrtrpleuasplysgln

275280285

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290295300

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305310315320

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340345350

aspglypheleuaspargthrlysgluargglyleuvalvallysarg

355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

alaleuleuvalglugluleulysleualaleuprometasngluser

420425430

gluthrglyphevalseralathrgluvalglulysargvalargglu

435440445

leumetgluserglugluglyasnserleuarggluargvalthrala

450455460

lysargasnglualametlysalametglugluglyglyserserarg

465470475480

valalaleualalysleuvalgluglntrplys

485490

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

ccacatcactcaacgtagtacatac25

<210>4

<211>25

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<213>人工序列()

<400>4

ctaccttatcctaattcacgcttac25

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列()

<400>5

cgcggatccatgcaggaggacaaattcacatatt34

<210>6

<211>35

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<213>人工序列()

<400>6

tgcactgcagcttccattgctcgactagcttggcc35