本发明属于核苷酸的化学合成技术领域，特别是涉及一种2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体及其合成方法。
背景技术：
rna干扰技术(rnainterference，rnai)于2006年获得了诺贝尔生理学和医学奖。rna干扰是在分子生物学上由双链rna引发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。小干扰rna(sirna)不仅仅是一种出色的分子生物学研究手段，更重要的是，它是一种潜在的具有药物应用前景的生物分子。近年来，sirna的药物应用成为科研机构和企业的研究热点。其中化学修饰的方法是一种非常重要的手段，虽然短的双链rna分子能够用于基因沉默，而且在细胞水平上具有较高的活性和稳定性，但是无论是在其中一条引入修饰或两条链都引入修饰都是十分必要的。首先，对于医疗用途来说，进一步提高热力学稳定性和核酶的抗性是十分重要的。第二，化学修饰能够提高双链sirna在身体内的半衰期。第三，化学修饰还能够提高双链sirna的分布和药物动力学特性，并且能让sirna靶向特定的细胞。第四，通过合适的化学修饰可以改变与靶基因的亲和能力，从而提高sirna的干扰效果，降低sirna的脱靶效应。2’-o-me和2’-f修饰是最早进行的sirna修饰探索，2’-o-me和2’-f修饰交替使用来对天然的sirna进行修饰可以对显著提高其血清稳定性，并在部分序列中能一定程度上可能提高rnai活性(allerson,c.r.；sioufi,n.；james,r.，etal．j.med.chem，2005，48,901．)。目前sirna合成公司可以提供这两种商品化的修饰服务。但是化学合成的高难度和成本限制了化学修饰rna技术的发展，更多、更复杂的亚磷酰胺单体有待开发。本发明将丰富化学修饰sirna单体的选择，并将促进sirna药物的研究与发展。
近些年的研究表明，2'-c-甲基腺嘌呤核苷显示出很有前途的抗癌药物、抗病毒活性和感兴趣的生化特性。（ronaldc.g.;lillianlou;christopherd.r.;ulischmitz.annualreportsinmedicinalchemistry,2004,vol.39,p.223-237；franchetti,p.;cappellacci,l.;marchetti,s.;trincavelli,l.;martini,c.;mazzoni,m.r.;lucacchini,a.;grifantini,m..j.med.chem.,1998,41,1708-1715;matsuda,a.;takenuki,k.;sasaki,t.;ueda,t.j.med.chem.1991,34,234;harry-o’kuru,r.e.;smith,j.m.;wolfe,m.s.j.org.chem.1997,62,1754;awano,h.;shuto,s.;baba,m.;kira,t.;shigeta,s.;matsuda,a.bioorg.med.chem.lett.1994,4,367;matsuda,a.;azuma,a.nucleosidesnucleotides1995,14,461;baker,c.h.;banzon,j.;bollinger,j.m.;stubbe,j.;samano,v.;robin,m.j.;lippert,b.;jarvi,e.;resvick,r.j.med.chem.1991,34,1879.）。
本发明以具有良好的抗癌和抗病毒活性的2'-c-甲基腺嘌呤核苷作为起始原料，合成一种2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体，可以作为rna核苷酸固相合成的原料，可以方便地在寡核苷酸片段中引入一个或多个2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体，合成新型的寡核苷酸序列及其探针。在sirna(小干扰rna，smallinterferingrna)的药物研发、基因功能的研究和全基因库的筛选等方面具有广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题是提供一种2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体及其合成方法，该合成方法反应条件温和，后处理简单，操作简便，适合工业化生产，为大量合成此类化合物提供了条件。能够为合成新的rna核苷序列提供原料，为新sirna药物研发和新核酸序列分析技术的低成本、高速度和高通量奠定基础。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：合成一种2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体，其特征在于结构为：
其中r1选自于：
r2选自于：
r3选自于：
r4选自于：
具体合成步骤为：
（1）起始原料为2'-c-甲基腺苷（2'-c-甲基腺嘌呤核苷），在碱性条件下，先使用二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)保护5'-oh和3'-oh合成式1化合物。然后继续加入叔丁基二甲基氯硅烷保护2'-oh，直接得到式2化合物；
（2）式2化合物，在碱性条件和催化剂的作用下，保护-nh2合成式3化合物，催化剂优选dmap；
（3）式3化合物，在碱性条件和催化剂氟化氢吡啶的作用下，选择性脱5'-oh和3'-oh保护合成式4化合物。然后经简单后处理后，直接在碱性条件和催化剂的作用下，选择性保护5'-oh合成式5化合物，保护基优选4,4-二甲氧基三苯甲基，催化剂优选dmap；
（4）式5化合物，在碱性条件和催化剂的作用下，选择性保护3'-oh合成式6化合物。保护试剂优选2-氰乙基n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺，催化剂优选dmap。
本发明所得化合物作为rna核苷酸固相合成的原料，可以方便地在寡核苷酸片段中引入一个或多个2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体，合成新型的寡核苷酸序列及其探针。在sirna(小干扰rna，smallinterferingrna)的药物研发、基因功能的研究和全基因库的筛选等方面具有广阔的应用前景。
以下三种2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体是本发明的优先化合物：
本发明的有益效果是：本发明跟现有技术相比，具有如下优点：
1.本发明的最大优点是2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体作为rna核苷酸固相合成的原料，可以方便地在寡核苷酸片段中引入一个或多个2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体，合成新型的寡核苷酸序列及其探针。
2.该合成方法反应条件温和，后处理简单，操作简便，适合工业化生产。
3.本发明以具有良好的抗癌和抗病毒活性的2'-c-甲基腺嘌呤核苷作为起始原料，有如此特性的结构引入寡核苷酸片段后，在相关研究领域（尤其是sirna药物研发领域）有望取得突破性成果。
4.本发明的起始重要原料2'-c-甲基腺嘌呤核苷，我司已工业化，成本低廉易得。
附图说明
图1是本发明2'-c-甲基腺嘌呤核苷亚磷酰胺单体的合成路线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
请参阅图1，本发明实施例包括：
实施例1
3',5'-o-(二叔丁基硅基双)-2'-o-叔丁基二甲基硅烷-2'-c-甲基腺苷的合成：
在250ml两口瓶中，分别加入100mldmf和2.8g(10mmol)2'-c-甲基腺苷（这化合物我司已工业化），在氮气保护和0°c条件下，缓慢滴入4.8g(11mmol)二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)，然后0°c搅拌反应30分钟。然后分批加入3.4g(50mmol)咪唑，然后25°c搅拌反应30分钟。缓慢滴加1.9g(12mmol)叔丁基二甲基氯硅烷，然后80°c搅拌反应3小时。冷却至0°c析晶，过滤并用冷乙腈洗涤，最后干燥得到4.7g3',5'-o-(二叔丁基硅基双)-2'-o-叔丁基二甲基硅烷-2'-c-甲基腺苷，产率88％。
实施例2
3',5'-o-(二叔丁基硅基双)-2'-o-叔丁基二甲基硅烷-n6-苯甲酰基-2'-c-甲基腺苷的合成：
在250ml两口瓶中，分别加入100ml二氯甲烷、2.7g(5mmol)3',5'-o-(二叔丁基硅基双)-2'-o-叔丁基二甲基硅烷-2'-c-甲基腺苷、1.0g(10mmol)三乙胺和0.1g(1mmol)dmap，在氮气保护和0°c条件下，滴加1.1g(7.5mmol)苯甲酰氯，然后25°c搅拌反应3小时。tlc检测反应完全后，水洗涤三次（50mlx3）,用无水硫酸镁干燥后，旋干溶剂，然后用20ml乙腈重结晶得到2.4g3',5'-o-(二叔丁基硅基双)-2'-o-叔丁基二甲基硅烷-n6-苯甲酰基-2'-c-甲基腺苷，产率75％。
实施例3
5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-o-[(叔丁基)二甲基硅基]-n6-苯甲酰基-2'-c-甲基腺苷的合成：
在250ml两口瓶中，将1.3g(2mmol)3',5'-o-(二叔丁基硅基双)-2'-o-叔丁基二甲基硅烷-n6-苯甲酰基-2'-c-甲基腺苷溶于5oml无水二氯甲烷中。在冰浴和氮气保护条件下，缓慢滴加1.0g(10mmol)氟化氢吡啶(溶于6ml吡啶中)，继续0°c搅拌1小时后，tlc检测反应完全后，50ml水和50ml饱和碳酸氢钠水溶液各洗涤一次,用无水硫酸镁干燥后，旋干溶剂。然后分别加入50ml二氯甲烷、0.5g(5mmol)三乙胺和0.03g(0.3mmol)dmap，在冰浴和氮气保护条件下，分批加入0.7g(2.2mmol)4,4'-双甲氧基三苯甲基氯固体,然后25°c搅拌反应6小时。tlc检测反应完全后，水洗涤三次（50mlx3）,用无水硫酸钠干燥后，旋干溶剂，柱层析(石油醚／乙酸乙酯=3：1)，得到1.5g5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-o-[(叔丁基)二甲基硅基]-n6-苯甲酰基-2'-c-甲基腺苷，产率93％。
实施例4
5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-o-[(叔丁基)二甲基硅基]-n6-苯甲酰基-2'-c-甲基腺苷-3'-(2-氰基乙基-n,n-二异丙基)亚磷酰胺的合成：
在250ml两口瓶中，将1.2g(1.5mmol)5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-o-[(叔丁基)二甲基硅基]-n6-苯甲酰基-2'-c-甲基腺苷溶于8oml无水二氯甲烷中，然后依次加入0.7g(6mmol)二异丙基乙基胺和0.03g(o．3mmol)的dmap固体，在冰浴氮气保护条件下，缓慢滴加0.7g(3mmol)2-氰乙基n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺(溶于30ml二氯甲烷中)，继续搅拌5分钟后，恢复室温，搅拌8小时。tlc检测反应完全后，旋干溶剂后，直接柱层析(石油醚／乙酸乙酯=8：1)，得到1.3g5'-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-o-[(叔丁基)二甲基硅基]-n6-苯甲酰基-2'-c-甲基腺苷-3'-(2-氰基乙基-n,n-二异丙基)亚磷酰胺，产率86％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。